检验专业毕业论文.doc

1、毕业论文题 目：乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证姓 名：学 号：专 业：指导教师：教师职称：研究起止日期：研究提交日期：二O三年十一月毕业论文 乙肝表而抗原的ELISA法定量分析方法学验证中文摘要1英文摘要1前言21 材料与方法31.1试剂盒31.2仪器31.3方法31.3.1溶液配制41.3.2铺板方案41.3.3加样步骤52.结果62标准曲线与线性范62.2准确度（回收率）的验证62.3精密度的验证7231板内精密度的验证72.3.2板间精密度的验证82.4检测限（LOD）计算103 讨论103.1乙肝表面抗原定量分析的意义103.2常用定量分析方法113.3方法概述113.4

2、方法学验证内容123.5结果分析及应用评价13参考文献14综述15致谢18中文摘要乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证中文摘要目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量 分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。方法: ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8ng/ml做2 倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6, 3, 1. 5ng/ml 3个浓度梯 度5复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。结果：标准曲线 R2=0.997,准确度 97.07%, 1.5ng/ml 的 RSD 为 16.78%,不满足 ng/ml 级水平的R

3、SD 一般应15%的要求，检测限LOD为0.172ng/ml, 低浓度样品(vl.5ng/ml)的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度 样品，不适合低浓度样品的检测。结论：该HBsAg的ELISA法定量 分析试剂盒不能用于临床标本的分析。关键词：乙肝表面抗原ELISA 定量分析 方法学验证英文摘要The reification of the HBsAg ELISA quantitativmethodologyAbstract In EnglishObject: to verify the quantitative methodology of Fuzhou blueprint biologic

4、al engineering company to make sure whether it ca be used to the analysis of Clinical Sample. Methods: ELISA quantitative methodology , make an Application of the standard HBsAg kit from the concentration of 8 ng/ml do 2 times diluted six concentration gradient to constitute a standard curve, testin

5、g With 6, 3, 1.5 ng/ml 3 a concentration gradient 5 accurately precise and detection .Results: standard curve ,R2=0.997, the accuracy of RSD of 1.5ng/m is 16.78%, the RSD that cannot meet the demand of ng/inl basic level is less than 15% in comm on. The LOD is 0.172ng/ml, the testing of Low concentr

6、ation samples (1.5ng/ml) are lower than high concentration samples in both accuracy and precision , which as a result make it unsuitable for low concentration sample testing. Conclusion: the ELISA quantitative analysis kit of HBsAg cannot be used for the analysis of Clinical SampleKey words: HBsAg Q

7、uantitative analysis Verification Methodology 乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证前言乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清 标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。随着免疫学技术的不 断发展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平乙肝病毒得以检出, 对临床诊断及流行病学有重要意义1。ELISA法具有较高灵敏度、特 异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫 分析仪上做批量检测。冃前临床上多倾向于做定量分析，若想知道检 验结果是否可靠，实验室则必须对所用试剂盒进行方法学验证，本实 验对福州蓝图生物工程有限

8、公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析 试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现报告如下。1.材料与方法1.1试剂盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限 公司出品。1.2仪器酶标仪：Bio-Rad 680 ；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统: Millipore Elix ；电热恒温培养箱(DNP-9052)上海精宏实验设备有限 公司;振荡器(苏州管械,KJ-201A)；移液器;Tip头；EP管。1.3方法1XPBS缓冲液的配置：称取8g NaCL 0.2g KCK 1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸惚水中，用

9、HC1调节溶液的 pH值至7.4,最后加蒸憾水定容至1L即可。标准品的配置：原始标准品浓度为8 ng/mlo o取6个2mlEP管，分 别标记为Sl-S6o 50ul/well,共1孔需50ul,每孔配置60ul备用，按照下 表稀释方案进行稀释。表1标准晶的稀释方案编号终浓度(ng/ml)预加1 XPBS取标记(U1)S180标准品120S2460S16060S3260S26060S4160S36060S50.560S46060S60.2560S56060质控品的配置：50ul/well,共5复孔需250ul,配置300ul备用，取3个2mlEP管，分别标记为Cl, C2, C3,按照下表稀释

10、方案进行稀释。表2质控品的稀释方案编号终浓度(ng/ml)预加1 XPBS取剩余(ul)标记(U1)C16150标准品450C23300C1300300C31.5300C23003001.3.2.铺板方案取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，按照下表铺板方案进行铺板在相应孔中依次加入系列标准品、质控品及空白对照，每孔50山。空口对照加入1 XPBS缓冲液。表3铺板方案12345AS1ClC2C3PBSBS2ClC2C3PBSCS3ClC2C3DS4ClC2PBSES5ClC3PBSFS6C2C3PBS1.3.3.加样步骤加入酶标抗体,50 ul/well,震荡。37C电热恒温培养箱温育60min

11、, 取出后洗板4次，加入A、B液,50 ul/well, 37C电热恒温培养箱温育 15 mine加入终止液，50 ul/ well酶标板放入酶标仪，盖上盖子，在 电脑上打开Microplate Manager 5.2软件，选择450nm波长（参照波长 630nm）,设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸收值。2.结果2.1标准曲线与线性范标准品理论浓度对应的实测OD值表4实测OD值HBsAg(ng/ml)84210.50.25OD1.661.000.620.390.310.27以HBsAg理论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系，结果显示R2=0.9973,显示具有

12、良好的相关性Q0)oueqosq2.2准确度（回收率）的验证质控品理论稀释浓度对应实测浓度值表5实测浓度值HBsAg (ng/ml)测定值1234566.244.565.736.096.4033.363.293.553.283.481.51.241.271.171.171.20质控品做了3个浓度梯度，每个浓度做了5个复孔，下表是对每个 浓度梯度进行准确度（回收率）的验证。表6 准确度的验证HBsAg (ng/ml)测定值（ng/ml）回收率（）平均回收率RR （%）3个浓度的 平均回收 率66.24103.9397.584.5675.925.7395.576.09101.456.40106.6

13、03.36112.133.29109.5733.55118.40113.0797.07%3.28109.403.48115.831.51.2482.4780.561.2784.671.1778.071.1777.671.2079.93结杲显示HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的平均回收率为97.58%, 113.07%,满足限度要求在85%-115%的范围内，而HBsAg 1.5ng/ml 的平均回收率为80.56%,满足方法定量限在80%-120%的范圉内。3 个浓度梯度的平均回收率为97.7%,显示准确性好。2.3精密度的验证2.3.1板内精密度的验证表7板内精密度的验证HBsAg (

14、ng/ml)测定值X SRSD(%)1234566.244.565.736.096.405.80 土 0.7412.7333.363.293.553.283.483.390.123.501.51.241.271.171.171.201.21 0.043.69上表中RSD(%)这一参数表示相对标准偏差，也就是变异系数CV值，HBsAg 6ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为12.73%,显示孔间差 异较大，精密度不高，但是也符合ng/ml级RSD水平的一般应15%的 要求，其中有一孔浓度为4.55,与其它孔比较差异较大，可能是由于 操作引起例如加样不准。而3ng/ml,和1.5ng/ml的变异

15、系数CV为3.5%,3.7%,符合显示孔间重复性好，符合ng/ml级RSD水平的一般应V15%的要求，精密度高。2.3.2板间精密度的验证从同一实验室中获取2组同样的数据，做板间精密度的验证。首 先对同一实验条件下不同实验人员所获得的数据是否可用于板间分 析做验证。表8板间精密度的验证HBsAg(ng/ml)84210.50.25第二组OD值1.981.420.860.580.400.31第三组OD值1.310.770.360.170.090.03以HBsAg理论浓度为横坐标，所测0D值为纵坐标作图，绘制标 准曲线观察线性关系。第二组Conc(ng/ml)QO)oueqosq图2 线性关系曲线

16、以上标准崩线结果显示第二组数据的R2 =0.967,第三组数据R2 =0.991 o第二组数据由于有一些孔与标准曲线偏离较大，但考虑到随 机抽样与均数存在一定误差，还是可以用于统计学分析。下表对3组数据做板间分析。从表中3个组的数据比较可知，HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的RSD分 别为9.10%, 12.06%,满足对ng/ml级水平的RSD般应15%的要求, 精密度高。ffijHBsAg 1.5ng/m啲RSD为16.78%,不满足ng/ml级水平 的RSD-般应15%的要求，显示低浓度的孔间重复性差，精密度不 是很高，故以下对HBsAg理论浓度为1,5ng/ml的三组数据做分析。

17、对HBsAg理论浓度为1.5ng/m啲准确性，精密度分析表9精密度分析HBsAg (ng/ml)测定值(ng/ml)回收率()平均回收率RR (%)SD%CV%第一组数据1.5 ng/ml1.2482.4780.562.983.701.2784.671.1778.071.1777.671.2079.93第二组数据1.5 ng/ml1.4697.60109.19.498.701.50100.001.73115.601.72114.531.77117.67第三组数据1.1979.47HBsAg (ng/ml)测定值X+SRSD(%)1234566.234.555.736.086.396.105.7

18、86.086.646.846.040.559.105.995.396.346.495.963.363.283.553.283.4733.362.933.533.072.993.060.3712.062.592.712.812.492.521.241.271.171.161.191.51.461.51.731.711.761.340.2316.781.191.241.251.211.111.5 ng/ml1.2583.1380.273.804.741.2583.531.2281.071.1174.13从上表可知第一组数据和第三组数据准确性差，精密度高。而第 二组数据准确性高，而精密度相对于第一组

19、和第三组数据耍好。综上 对于HBsAg理论浓度为1.5ng/ml的这一低浓度梯度的板内准确性和板 间精密度相对于高浓度的线性要差一些。2.4检测限（LOD）计算LOD为取空白孔的OD值的均数加2倍标准差。表10空白孔的OD值12345MeanSDLOD空白孔OD值0.1580.1530.160.1620.17060.006220.172由上表可知，LOD为0.172。检测限（LOD）表示分析方法检测低 浓度样品的能力，也称为方法的灵敏度，LOD通常为标准曲线上的最 低浓度点，要求标准曲线上的最低浓度点应LOD,此标准曲线上最 低浓度点为0.25,大于LOD （0.172）,故此标准曲线线性好。

20、3.讨论3.1乙肝表面抗原定量分析的意义乙肝表面抗原是乙肝两对半的其中一项，乙肝两对半定性检测对 乙肝疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了一定的作用。但随着临 床医学的发展，乙肝两对半定性检测己经远远不能满足临床及患者的 要求，特别是在疗效观察以及乙肝疫苗注射后抗体产生情况的观察上 有明显的不足。随着检验医学的发展，乙肝两对半定量测定成为可行, 大大弥补了乙肝两对半定性检测的不足。而且乙肝两对半定量检测可 与HBV DNA荧光测定相互补充，综合评价患者病情与药物疗效， 为低含量的慢性乙肝、病毒携带者提供了正确判断病情的依据。这在 目前的临床治疗中应用十分广泛。3.2常用定量分析方法此次实验只是

21、对一种试剂盒的可用性进行方法学验证，而目前 常用的定量方法已有很多，如TRFIA, TRFIA法乂称解离增强镰I系荧 光免疫分析，是近十年发展起来的一种微量分析方法。此技术集酶标 记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定 性好，且测定范围更宽，试剂盒货架寿命长，操作简便和非放射性等 特点，成为最有潜力的一种标记免疫分析方法【3】。全自动酶免分析 仪目前也广泛应有，自动化、标准化的操作手段使实验达到了全过程 控制和全过程标准化分析，大大提高了实验的精密度【4】，使检测结 果更趋稳定，从而保证了实验结果的可靠性。3.3方法概述冃前普遍使用的HBsAg试剂尽管在制备时采用了高亲和

22、力的单 克隆抗体，并且使包被抗体、酶标抗体的结合位点尽可能的远。以避 免竞争抑制，最大程度地解决钩状效应（HOOK）的问题【5】。本次 实验是对实验室的一种试剂盒，即福州蓝图生物工程有限公司生产的 HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用 于临床样本分析。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验。 往预先包被HBsAg捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本，标准品， HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB 在过氧化物的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下最终转化为黄色。 颜色的深浅和样品中得HBsaAg呈正相关。用酶标仪在450nm波长下 测定

23、吸光度0D值，计算样品浓度。应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8, 4, 2, 1,0.5 , 0.25ng/ml 6 个浓度梯度做标准曲线，以6, 3, 1.5ng/ml3个浓度梯度5复孔做质控, 进行准确度，精密度和检测限等方法学验证。选择最低浓度为 0.25ng/ml的原因是因为，绝大多数HBV感染者外周血中可出现 HBsAg,含量在5ng/ml 600ug/ml之间，高者可达2000ug / ml以上【6】，满足了现阶段文献报道的最低浓度值。3.4方法学验证内容方法学验证内容一般包括标准曲线，准确度，精密度和检测限。 标准曲线亦称校正曲线，系指生物样品中所测定的样品浓度与响应的 相关性

24、，通常用回归分析方法所得的回归方程來评件，此实验所用了 6个浓度点建立标准曲线。方法准确度指待测浓度与真实浓度的接近 值了，一般用相对回收率表示，限度要求在85%115%的范围内。精 密度则表示分析方法的可重复性，是对同一样品毎次测定结果的一致 性，用标准偏差和相对标准偏差表示，可做板内和板间的验证，对于 ug/m 1级水I的相对标准偏差一般应10%, ng/ml级水-、卜的相对标准偏 差一般应15%o检测限则表示分析低浓度样品的能力，通常又称为 灵敏度。35结果分析及应用评价第一组数据标准曲线R2=0.9973,显示具有良好的相关性,HBsAg 浓度为6ng/ml和3ng/ml的冋收率分别为

25、为97.58%,符合113.07%,符 合限度耍求在85%115%的范围内。但是HBsAg浓度为5ng/ml的回 收率为80.56%,显示此试剂盒对于低浓度样品的检测准确度差。在精 密度方ffi,6,3,1.5ng/ml变异系数CV分别为 12.73% , 3.69% ,3.50%, 而HBsAg 6ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为12.73%,显示孔间差异 较大，精密度不高，但是也符合ng/ml级RSD水平的一般应15%的要 求，其中有-孔浓度为4.55,与其它孔比较差异较大，可能是由于操 作引起例如加样不准不属于试剂盒的问题，故可以认为此试剂盒对于 批内高、低浓度样品的检测精密度还是

26、可以的。在做3个组数据的批 间的精密度分析时，发现6, 3, 1.5ng/ml变异系数CV分别9.10%, 12.06%, 16.78%,分布方式从低到高，前2个浓度满足对ng/ml级水平 的RSD一般应15%的耍求。1.5ng/ml的RSD为16.78%,不满足ng/ml 级水平的RSD般应15%的要求，显示低浓度的孔间重复性差，精 密度不是很高。综上分析，该试剂盒对于高浓度样品的检测具有良好的准确性 和较高的精密度，而对于低浓度样品(vl5ng/ml)的检测在准确性和 精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。目前绝大 多数HBV感染者外周血HBsAg浓度很低，该试剂盒不能全面检

27、测出此 类人群，故该试剂盒不能用于临床标本的检测。参考文献参考文献【1】魏来，陶其敏.努力规范肝脏疾病的免疫学诊断中华检验杂志，2003, 26： 6971【2】刘晓梅，张世兰IIBsAg阴性结果的慢性乙型肝炎患者病毒血症水平与临床 的关系J】临床检验杂志,2004, 22(5)： 381-382.3 李辉霞，王徳志，杨朋，乙肝两对半定量检测及临床意义，医学信息杂志 2010, 23 (9)。4 Weber B, Dengler T, Berger A . Evaluation of two new autom ated assays for hepatitis B virus surface

28、 HBsAg detection IMMUIITE HBsAg_and IMMU1ITE 2000 HBsAg J J .Clin Microbiol, 2003 ,41,(1)； 13 5143 .【5】郑怀竞临床免疫学检验质量保证M北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1995, 99.【6】王朝阳，段文强，乙肝两对半阴阳性之临床意义，中国社区医师杂志,2007, 26(1)： 12-13.综述综述乙肝表而抗原是人类在感染乙型肝炎病毒后出现的第一个病毒血 清学标志物，通常在临床症状出现之前即在血液中出现。我国是乙型 肝炎病毒的高发区，加强对乙型肝炎（简称乙肝）的检出能力，是保障我

29、 国人民健康，促进经济发展和社会进步的重耍措施。由于病毒感染的 窗口期问题、乙肝试剂检测质量以及实验中的各种不确定因素影响着 医院对乙肝病毒的检测。随着医疗检验技术的发展，临床检测乙肝表 面抗原采用的方法有了新的发展，尤其是发光法定量（或半定量）检测 乙肝表面抗原近年有上升趋势。结合我国乙肝病毒感染的现状，选择 反应快、灵敏度和特异度均高但又要成本低的检测方法至关重要。我 们在追求低成本检测的同时，必须保证检测的质量。乙肝表面抗原是 乙川两对半的其中一项，乙肝两对半定性检测对乙肝疾病的诊断，病 情监测，疗效观察起到了一定的作用。但随着临床医学的发展，乙肝 两对半定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求，特别是在疗效 观察以及乙肝疫苗注射后抗体产生情况的观察上有明显的不足。随着 检验医学的发展，乙肝两对半定量测定成为可行，大大弥补了乙肝两 对半定性检测的不足。而且乙肝两对半定