重组蛋白表达系统本科教学课件.pptx

1、重组蛋白表达系统重组蛋白表达重组蛋白及其应用重组蛋白生产的关键因素宿主系统（表达系统）的选择生产工艺分离和纯化成药和最终产品上游下游重组蛋白及其应用重组蛋白的应用：蛋白药物蛋白蛋白相互作用的试剂盒吸附提纯目标蛋白的蛋白体外生化和基于细胞的试剂盒等等问题：什么样子的重组蛋白是好的蛋白？答案：和天然蛋白越接近越好重组蛋白生产流程(质表达载体宿主细胞粒）系细胞池转染很多细胞，有转染成功带有目的基因的，也有转染不成功不携带目的基因的筛选出转染成功的克隆小规模细胞培养用来放大成功携带目的基因的克隆稳定性实验大规模培养生产这里用的设备统称为生物反应器，就是进行细胞培养的设备，小到200微升，大到几千上万升

2、，都是给细胞培养提供高度控制的环境细胞系制备细胞培养基优化下游目标蛋白的分离和纯化目的蛋白基因工作细胞库：从主细胞库而来，用来生产主细胞库：相当于筛选成功的始祖细胞库补料式培养持续式培养重组蛋白产品我们的服务指的工艺优化包括所有环节，简单来说就是增加产量，提高纯度，降低成本优良细胞系筛选生物反应器工程上下游概览重组蛋白生产的关键因素o表达质粒的构建（基因改造）o适宜的转录和翻译的控制o宿主系统o用来合成和修饰蛋白的细胞系统o宿主细胞的生物特性决定了表达的重组蛋白的质量o生产工艺o下游纯化表达系统的选择原核表达系统酵母表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统转基因植物表达系统转基因动物表达系

3、统重组蛋白表达系统1.原核表达系统(大肠杆菌等）原核表达系统发展完善，流程简单快速，成本低，产量高，适宜于表达原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白。缺陷：1.细菌快速蛋白表达经常会导致蛋白的不折叠或者错误折叠，影响蛋白的溶解性和功能性。2.无法进行真核生物翻译后修饰，导致溶解度和功能性降低，而且和天然蛋白相似度降低。3.容易引入内毒素感染2.酵母表达系统酵母表达系统兼具原核和高等真核系统的优点。酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源

4、蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合与表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统局域外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。2.酵母表达系统应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物也有不足之处，如产物蛋白质的不均一，信号肽加工不完全，内部降解，多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。另外，还时常遇到表达产物过度糖基化的情况。因此，酵母系统经常被用在糖基化对于蛋白功能性没有影响的目标蛋白生产中。注：酵母表达系统在前期不会在我们的工作范围之内，所以跳过。昆虫表达系统适宜表达高等真核生物蛋白。昆虫细胞

5、在培养中可以达到较高的细胞密度，具有复杂的翻译后修饰，如蛋白质的正确折叠与切割，二硫键形成，糖基化，磷酸化，酰化，酰胺化，羧甲基化，很多修饰过程与哺乳动物细胞都是相同的。与酵母相同，昆虫细胞也可以进行胞内盒分泌表达，启动子很强，重组蛋白表达量高，而且更适宜表达多元蛋白复合物。3.昆虫表达系统3.昆虫表达系统昆虫细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染可以获得稳定的转染细胞，但试验周期较长，需几周甚至几个月，适宜连续发酵培养。利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，适用于目的蛋白的瞬时表达检测。昆虫细胞系统的蛋白处理方式和高等真核动物还是有一

6、定的差别。与其他系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N-糖基化和准确的O-糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构，理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。4.哺乳动物表达系统常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，小仓鼠肾(BHK)细胞，非洲绿猴肾（COS）细胞，人类肾细胞（HEK293），幼仓鼠肾细胞（BHK)等。不同宿主表达的重组蛋白其稳定性和翻译后修饰有所不同，需根据目的蛋白选择最佳的宿主细胞。4.1 表达宿主CHO细胞是目前较常用的哺乳动物宿主细胞，被美国食品药监局（FDA）确认为安全的基因工程受体细胞，广泛

7、应用于医疗用重组蛋白的生产。它遗传背景清楚，生理代谢稳定，与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确，基因转移和载体表达系统完善，对剪切力的耐受性好，便于大规模培养，而且能在无血清和蛋白培养基中生长。缺点是产率较低，重组蛋白一般仅占细胞总蛋白的2.5%。CHO细胞有多种亚细胞株，如脯氨酸缺陷型CHO-K1,二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)CHO等等。4.1 表达宿主与酵母和昆虫细胞类似，哺乳动物细胞表达外源蛋白也可以利用质粒转染和病毒载体的感染。病毒载体举例：腺病毒，慢病毒等等。单质粒表达载体很多可选。4.2 表达载体细胞状态：脆弱的哺乳动物细胞对培养环境十分敏感，营养和生长因子缺乏，缺

8、氧，毒性代谢物的积累，机械搅动以及培养压力的增加等很多因素都可导致细胞停止生长甚至凋亡。哺乳动物细胞的遗传和生理背景复杂多变，每个细胞株都最好单独摸索最优培养条件，尤其是稳定表达的细胞株，有较大的个体差异。控制细胞代谢：培养工艺优化的一部分4.3 哺乳动物表达系统的优化伴随植物生物技术的发展，植物体作为生物反应器正在成为外源基因表达的重要体系，利用职务表达外源重组蛋白生产药用蛋白或疫苗是转基因职务研究的一个焦点。5.转基因植物表达系统6.转基因动物表达系统伴随植物生物技术的发展，植物体作为生物反应器正在成为外源基因表达的重要体系，利用职务表达外源重组蛋白生产药用蛋白或疫苗是转基因职务研究的一个

9、焦点。5.转基因植物表达系统6.转基因动物表达系统我们的工作重点在哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统上，他们的优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性，缺点是表达量通常较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本高。7.表达系统的选择生产工艺生产工艺新鲜培养基，包括养料，碳源，氮源培养液细胞无细胞上清收获瓶4度冰箱分离装置pH溶解氧温度细胞浓度Batch补料培养灌流培养持续培养广州汉腾生物科技有限公司生产工艺整合灌流stirrer广州汉腾生物科技有限公司生物反应器工程生物反应器工程主要涉及生物反应器装备及其动物细胞培养工艺。生物反应器最主要任务是给细胞生长提供一个能够充分混合的

10、流场，以便细胞迅速吸收氧料进行新陈代谢，但在混合过程中会必然产生矛盾体-剪切力，由于动物细胞没有细胞壁的保护，所以其对流场剪切力十分敏感，这也是对生物反应器设计及生产工艺最关键的考验，是用于动物细胞培养反应器价格如此昂贵的重要原因之一。因此，生物反应器性能很大程度上决定着蛋白产量规模化水平及生产工艺研发的难易程度。对生物反应器结构设计而言，目前虽然存在着多种类型的结构，但从结构设计上其实都没有很好地解决混合和剪切力之间的矛盾关系，因此在生产上主要是依赖培养工艺来补偿，这也是工艺为何如此重要和关键的原因，可观的是，现在欧美生产工艺最大已经能够支撑上万升的动物细胞培养。在众多不同结构类型的反应器当

11、中，真正能够达到大规模化级别的（100升以上）其实只有搅拌式（stirred tank，目前唯一达到万升级别），定轨摇晃式（orbitally shaken bioreactor，最大2500L）和摆动式（wave，最大200L），其他类型均属小规模实验型反应器，其性能和工艺均没有达到大规模生产的要求和水平。生物反应器工程反应器的类型两种两种标标准：准：混合运混合运动实现动实现形式：形式：根据反应器混合流场提供的动力源不同可以将反应器分为：搅拌式（stirredtank）,定轨摇晃式（orbitallyshakenbioreactor），摇摆式（rockingtank），气升式，中空纤维式等等

12、。加工材加工材质质不同：不同：根据反应器本身材料成分不同，可以将其分为：不锈钢型（316L不锈钢，典型反应器材质）和聚合塑料可抛弃型（又称为一次性反应器，有望在将来替代不锈钢类型）生物反应器工程不锈钢反应器不锈钢反应器一般指的就是搅拌式生物反应器，为最传统的反应器类型，有着悠久的应用历史，该种类型生物反应器规模最大（万升级），对应的细胞培养工艺也最为成熟。搅拌式生物反应器结构主要分为：搅拌桨（动力源），气泡分布器（sparger,氧气供应），挡板（baffle,增加混合），PH电极，溶氧电极，温度电极以及其他一些补料、取样管路。优点：动力充足，工艺成熟，理论和实践研究充分缺点：流场剪切力大，操

13、作复杂，灭菌困难，价格昂贵，能耗大不锈钢反应器代表性企业-欧洲目前商业化的反应器规模一般为中试和生产级别（2000L以下），万升及以上的cGMP车间中的反应器系统均为用户定制，欧洲生物反应器特点为历史悠久，性能优良，种类多样。生物反应器工程生物反应器工程不锈钢反应器代表性企业-欧洲Bioengineering AG,Switzerland（比欧）:老牌企业，其反应器从小到大，实验室一直到生产规模，性价比较高，主要市场在韩国，目前正在与韩国celltrion公（亚洲最大反应器制造商）合作研制一套世界上最大的30万升级cGMP反应器系统。生物反应器工程不锈钢反应器代表性企业-欧洲30万升万升级级反

14、反应应器系器系统统3L6L20L广州汉腾1生00物L 科技有限公75L30L不锈钢反应器代表性企业-欧洲Sartorius,Germany(赛多利斯)：欧洲顶级反应器供应商（主要因为收购了贝朗），历史悠久（1870年成立），2000收购了反应器制造领军企业德国贝朗（B.Braun）,之后主要研发一次性类型反应器。5L30L200L生物反应器工程不锈钢反应器代表性企业-欧洲Zata,Austria：欧洲顶级反应器供应商，主要从事中试到生产的设备，技术和服务一流。据说目前Lonza的20000L哺乳动物细胞反应器由其提供。在2010年以前主要侧重欧洲市场，之后开始开拓国际市场，2012进入中国。生

15、物反应器工程不锈钢反应器代表性企业-美国Abec,America：美国著名生物反应器供应商，进入国内三四年，已经拿下了不少订单，差一点拿到了中信国健30000L的项目大单。50L1200L生物反应器工程不锈钢反应器代表性企业-美国NBS(NewBrunswickScientific),America：美国代表反应器供应商，主要涉及小规模反应器制造，NBS在国内小规模反应器应用上认知度较高。14L广州汉腾生物科4技0L有限公650L生物反应器工程生物反应器工程一次性反应器一次性反应器是指完成单次细胞培养后即抛弃的反应器，顾又称其为可抛弃反应器（Disposable bioreactor）。该种类

16、型反应器是进入二十一世纪后，为了顺应市场需求和行业趋势而做出的革新性改变。因用户无需灭菌和操作简单可靠，该反应器一经问世便受到业界广泛关注，被公认为在未来有望替代传统型（stirred tank）反应器，目前最大研发工作体积已到2500L(Professor Wurm，瑞士联邦理工学院洛桑分校EPFL,具有CHO细胞成功培养数据)。生物反应器工程一次性反应器一次性（可抛弃）物反应器结构主要分为：一次性培养袋（最关键部分,成份一般为三层：PolyethyleneterephthalateorLDPE增加机械强度，PVAorPVC密封层，PVAorPP接触层），动力装置（传统搅拌或其他），控制系统

17、（与传统型类似）。优点：放大一致性好（从小到大同种运动机理）、流场剪切力小，便于研发，能耗低，操作便捷、不易染菌和价格低廉（相对传统型）等。缺点：大规模动力源略显不足（在支撑万升级反应器方面），缺乏上市药成功案例（至今仍没有一款上市药申报基于该种反应器，原因其发展较晚，上市药市场基本被传统搅拌式占领，也导致大公对实际生产应用的犹豫）。生物反应器工程一次性反应器代表性企业-欧洲Kunher,Switzerland：瑞士老牌家族式企业，一直从事定轨摇晃式（orbitally shaking）反应器的研究，目前其公的摇晃式平台已被广泛应用到企业和实验室，稳定和可靠性一直受到国际认可，值得一提的是其与

18、EPFL联合开发的一次性反应器最大规模已经做到了2500L,其中50L和200L规模的反应器已商品化。2500L广州汉腾生物20科0L技有限公50L生物反应器工程一次性反应器代表性企业-欧洲Sartorius,Germany(赛多利斯)：一次性反应器及袋子欧洲龙头企业，主要原因在于其一次性培养袋技术过硬，很多一次性反应器制造商都订购其生产的培养袋。Obitally shaken bags(50 to 2500L)Wave bags(100mL to 100L)Disposable stirred tank and bags(12.5L to 1000L)生物反应器工程一次性反应器代表性企业-欧

19、洲Applikon,Netherland(荷兰)：具有近40年的生物反应器研制历史，起家于瑞士，Appli代表Application,kon代表瑞士（瑞士很多城市以kon结尾）。1978年落户于荷兰的schiedam。1988生产制造及客服迁至美国california，总部保留研发，2013年在中国广州设立分部。Applikon是世界上唯一能够将0.1mL到2000L众多规模反应器自主研发至商品化的企业，其研发能力惊人。目前主要以一次性反应器为主，不锈钢反应器基本为10L到200L之间的规模，下面主要列举其一次性反应器产品。0.1 to 4mL1-7mL一次性反应器代表性企业-欧洲广州汉腾5生

20、0-物2 0科0 0技L 有限公生物反应器工程一次性反应器代表性企业-欧洲TPP,Switzerland(瑞士)：瑞士典型家族式企业，2001年其创始人MaxTanner将公交给他的儿子RolfTanner经营。其产品主要以一次性生物技术耗材为主，因质量高（品牌主色调-黄色代表用于组织培养和实验室技术高性能一次性塑料产品的瑞士商标）在世界范围内得到了非常广泛的应用。特别值得一提的是该公和瑞士EPFL的Wurm教授共同研发的50mL和600mL的一次性反应器（用于orbitallyshaken平台），几乎已经成了实验室小规模研发的不二选择。生物反应器工程一次性反应器代表性企业-欧洲TubeSpi

21、n Bioreactor 50(50mL)600(600mL)TubeSpin Bioreactor生物反应器工程一次性反应器代表性企业-美国GE,America(美国)：虽然没有特别悠久的反应器研发历史，鉴于一次性生物反应器行业的广阔发展前景和潜力，美国通用公（GE）也加入了一次性反应器研制的行列，而且其公在rocking（摇摆式）一次性反应器已经做到了世界该类型的最大规模200L。200L rocking bioreactor生物反应器工程一次性反应器代表性企业-美国Abec,America(美国)：Abec的一次性反应器主要基于传统搅拌式而进行的研发，但融合了很多创新的设计，目前最大规模

22、已经做到了200L.50L200L生物反应器工程一次性反应器代表性企业-美国PBSBiotech,America(美国)：是美国一家最新成立的针对一次性生物反应器研发的企业，改公提出了一种全新的混合理念，商品化的反应器已经做到了500L。虽然设计针对动物细胞培养，由于最近才成立，并没有见到太多企业和该公公布的在此类反应器上细胞培养数据，该公目前也更多侧重于新型混合理念的宣传，小规模（20to500mL）靠磁力搅拌，大规模（15Lto500L）靠底部通气带动叶轮混合流场。生物反应器工程20 to 500 mL3L15L80L500L一次性反应器代表性企业-美国生物反应器工程生物反应器工程生物反应

23、器类型附录机械搅拌式生物反应器提升浆生物反应器生物反应器类型附录机械搅拌式生物反应器双圆筒筛搅拌式生物反应器生物反应器工程生物反应器工程生物反应器类型附录机械搅拌式生物反应器泡床式搅拌生物反应器生物反应器工程生物反应器类型附录机械搅拌式生物反应器脉冲混合式生物反应器生物反应器工程生物反应器类型附录机械搅拌式生物反应器离心桨生物反应器生物反应器工程生物反应器类型附录机械搅拌式生物反应器高密度细胞培养生物反应器生物反应器类型附录机械搅拌式生物反应器固定化酶搅拌桨反应器生物反应器工程生物反应器工程生物反应器类型附录气升式生物反应器多孔筛导流筒生物反应器生物反应器工程生物反应器类型附录气升式生物反应器螺旋筛导流筒生物反应器生物反应器工程生物反应器类型附录气升式生物反应器外循环生物反应器小结由于悠久的应用历史，目前不锈钢搅拌式反应器仍为主流，但其自身存在的问题已经越来越明显，尤其在生物制药技术越来越国际化的大背景下，更具竞争力的新型反应器需求极为迫切。目前，对于小规模水平反应器，已经出现了结构多种多样的趋势，但在大规模生产方面，只有一次性可抛弃式反应器有望替代传统搅拌式反应器。总而言之，现在生物制药技术行业，一次性装备时代已经到来，对于企业如何顺应时代，抓住机遇，将会是其在将来引领行业潮流的关键。THANKS