浅论华支睾吸虫病免疫学诊断方法的研究进展.docx

1、浅论华支睾吸虫病免疫学诊断方法的研究进展浅论华支睾吸虫病免疫学诊断方法的研究进展【摘要】 华支睾吸虫寄生于人和犬、猫等动物的肝胆管内，造成肝胆的一系列疾病，是一种重要的人兽共患寄生虫病。选择快速、准确的诊断方法对防治该病十分重要，免疫学检测方法现已广泛用于华支睾吸虫病的诊断，本文就目前华支睾吸虫病免疫学检测方法的研究进展作一概述。【关键词】 华支睾吸虫病;免疫;诊断Training Center of Air Force Academy,Jinzhou 121000 China)Abstract: Clonorchis sinensis parasitises in the bile duct

2、s of human and dogs, cats and other animals. Clonorchiasis is a serious zoonotic parasitic disease causing a series of liver and gallbladder disease. So choosing fast and accurate diagnostic way of treatment is important to prevent and cure the disease. Nowadays, immunological detection has been wid

3、ely used in the diagnosis of clonorchiasis. This paper provides an overview on research progress in ways of immunological detection of clonorchiasis.Key words: clonorchiasis sinensis; immunization; diagnosis华支睾吸虫病(Clonorchiasis)，又称肝吸虫病，是因生食或半生食含有华支睾吸虫幼虫的淡水鱼虾而感染的一种重要的人畜共患寄生虫病。目前全世界有将近2 500万人感染华支睾吸虫，主

4、要分布在东亚和东南亚地区，如中国、朝鲜、韩国、越南及菲律宾等国家。我国除青海、甘肃、宁夏、内蒙、新疆及西藏外，其余省市均有本病传播或流行1。卫生部于2001年6月至2004年底对部分蠕虫病进行调查的结果显示，华支睾吸虫的人群感染率为%，感染者达 1 200多万。由于华支睾吸虫成虫轻度感染不会产生明显临床症状，使患者长期带虫，虫体的分泌代谢产物及虫体本身的机械刺激，对肝胆系统造成慢性损害，可引起胆管炎、胆管肝炎和肝硬化甚至诱发胆管癌等。自20世纪50年代以来，免疫学的发展为华支睾吸虫病提供了更为科学的诊断手段。本文就目前华支睾吸虫病的常用免疫学检测方法作一概述。1 酶联免疫吸附测定(enzyme

5、-linked immunosorbent assay，ELISA) 酶联免疫吸附测定(ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。自20 世纪 70 年代后期出现以来，经过不断的改进和完善，该法已成为十分成熟的免疫学诊断。Lee等用重组Clonorin作诊断抗原，ELISA法检测华支睾吸虫病患者血清特异性，IgG抗体的敏感性较低，但特异性达100%。鉴于重组Clonorin极高的抗原特异性，可作为抗原“鸡尾酒”组分，用于华支睾吸虫感染早期的血清学诊断。何丽洁等以重组华支睾吸虫 26kDaGST 蛋白 (rCs26GS

6、T)为免疫诊断抗原，用ELISA法检测了30 份华支睾吸虫病人血清、15份肺吸虫病人血清、20份日本血吸虫病人血清、40份无寄生虫感染的健康人血清，结果华支睾吸虫感染者血清 IgG的阳性检出率为 %，健康人、肺吸虫病和日本血吸虫病人的阳性率分别为 %、%、%。表明以rCs26GST抗原为免疫诊断抗原的ELISA具有较高的敏感性和特异性，可用于组合“鸡尾酒”式的复合诊断抗原。Zhao等用7ku蛋白(来自华支睾吸虫排泄/分泌物，公认为活动性华支睾吸虫病的标志性诊断抗原)为包被抗原，ELISA法检测华支睾吸虫病和其他蠕虫病患者血清，敏感性达%，特异性达%。崔香淑等6，7分别以华支睾吸虫成虫粗抗原和分

7、泌-排泄抗原为免疫诊断抗原，用ELISA法检测华支睾吸虫感染患者509人、麝猫后睾吸虫感染者47人、卫氏并殖吸虫感染者20人、日本血吸虫感染者14人以及健康人163人的血清特异性IgG，检测结果的敏感性和特异性都很高。 为免疫诊断抗原，用间接ELISA法检测检测华支睾吸虫病人血清107份和健康人血清50份，结果可溶性抗原的敏感性和特异性分别为%、98%，符合率为%;排泄-分泌物抗原的敏感性和特异性分别为%、100%，符合率为%。徐鹏，等：华支睾吸虫病免疫学诊断方法的研究进展辽宁医学院学报 2009年10月，30(5)酶联免疫吸附试验具有高度的敏感性和特异性，操作简便，不需特殊仪器设备，血样用量

8、少，判断结果容易，现场应用方便，是目前符合现场需要的较好的免疫诊断方法。在经典ELISA 的基础上，又有许多改进的方法，如dot-ELISA、ABC-ELISA、McAb-ELISA、 G-ELISA、SPG-ELISA等方法。斑点ELISA (dot-ELISA)dot-ELISA是以硝酸纤维素膜为载体，其吸收抗原稳定，不需特殊仪器，操作周期短，是一种微量、敏感、特异的新方法，适于现场应用。石裕明等(1992)用葡萄球菌A 蛋白代替第二抗体用该方法诊断华支睾吸虫病取得了满意结果，在血清稀释度为1：40 时，实验结果阳性率为 %。黄敏君等(1994)用抗华支睾吸虫成虫抗原的单克隆抗体建立dot

9、-ELISA，检测华支睾吸虫病人血清中的循环抗原，该方法的敏感性为83%，特异性为100%。生物素-亲和素酶联免疫吸附测定(ABC-ELISA)ABC-ELISA技术，即生物素-亲和素-酶结合物技术，20世纪80年代开始已广泛应用于各种免疫学检测。ABC-ELISA利用生物放大效果，既具有免疫反应的特异性，又比常规 ELISA 的灵敏度提高数倍。特别是在用于轻度感染病人低水平抗体的检出时，优越性更明显。裴福全等采用ABC-ELISA法检测华支睾吸虫感染者(62 例)和健康人(38 例)血清特异性总IgG及其亚类，华支睾吸虫感染者血清特异性总IgG及其亚类阳性检出率分别为IgG 100%，IgG

10、1 %，IgG2 %，IgG3 %，IgG4 %;健康人血清特异性总IgG假阳性率%， IgG4假阳性率为0;表明ABC-ELISA法诊断华支睾吸虫病时具有较高的敏感性。崔惠儿等分别以重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(CysB)和华支睾吸虫成虫可溶性粗抗原(CAA)为诊断抗原，用ABC-ELISA分别检测112 份华支睾吸虫感染血清、56 份健康人血清、20 份日本血吸虫病血清和10 份肺吸虫病血清，结果重组抗原CvsB与成虫粗抗原CAA的敏感性分别为%及%;其特异性IgG检测阴性率均相同，分别为%、95%及90%。单克隆抗体 ELISA(McAb-ELISA)McAb 标记效价高，亲和力一致，可

11、提高实验的敏感性和特异性。Yong TS等(1998)用传统的 ELISA 检测出 75% 的阳性华支睾吸虫病例，但% 的对照和% 的并殖吸虫病例为假阳性，而使用单克隆抗体进行ELISA抑制试验，阳性率为 %，在对照和并殖吸虫病例中无假阳性。重组链球菌G蛋白ELISA (G-ELISA)裴福全等10(2007)用重组链球菌G蛋白建立快速酶联免疫吸附试验(G-ELISA)，检测华支睾吸虫病患者、其他寄生虫感染者(日本血吸虫病、肺吸虫病、囊虫病)和健康人血清特异性IgG抗体，结果该方法的敏感性为94%，特异性为97%，表明链球菌蛋白G-ELISA用于华支睾吸虫病血清学诊断具有较高的敏感性及特异性。

12、等11(2008)分别以重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(Cs-CysB)和华支睾吸虫成虫可溶性抗原(CAA)为诊断抗原，用SPG-ELISA检测50份华支睾吸虫感染者血清，结果阳性率均为%，健康人血清50例结果阴性率均为100%;检测日本血吸虫病血清20 份、并殖吸虫病血清20 份、囊虫病血清10 份，交叉反应率分别为%、%、%和%、0、%。表明以重组Cs-CysB为包被抗原用SPG-ELISA检测血清华支睾吸虫抗体具有较高的敏感性及特异性，检测效果与CAA包被的SPG-ELISA相当。半胱氨酸蛋白酶ELISA半胱氨酸蛋白酶ELISA，是通过检测位于肠内的成虫和子宫体内的卵子中半胱氨酸蛋白酶的报

13、春黄甙，通过ELISA来评价半胱氨酸蛋白酶报春黄甙的效价，此种方法的特异性和敏感性很高。Pei等12(2005)用CysB重组蛋白建立ELISA检测方法，该法的敏感性达%(48/50)，特异性达%(25/26)，而对比实验中可溶性粗抗原用于检测的敏感性为%(44/50)，与其他寄生虫感染者血清无交叉反应。表明该重组抗原用于ELISA诊断时具有较高的敏感性及特异性。裴福全等13(2008)分别以华支睾吸虫重组半胱氨酸蛋白酶(CsCp)与成虫粗抗原(CsCAA) 为ELISA包被抗原检测华支睾吸虫病流行区人群血清特异性抗体水平，CsCAA-ELISA阳性率%，rCsCP-ELISA阳性率%，CsC

14、AA-ELISA、rCsCP- ELISA结果与粪检结果的符合率分别为%和%，两种抗原ELISA结果的符合率为%。59例粪检阳性者CsCAA-ELISA和rCsCP-ELISA阳性率均为%，38例粪检阴性者CsCAA-ELISA和rCsCP-ELISA阳性率分别为%和%。结果表明以rCsCP和CsCAA为包被抗原，用ELISA法检测华支睾吸虫病人血清特异性IgG抗体时具有较高的符合率。2 免疫胶体金检测1971年Faulk和Tayto将胶体金引入免疫化学14，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面

15、的过程。吸附机理是胶体金颗粒表面负电荷与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、糖蛋白、免疫球蛋白、牛血清白蛋白、酶、激素、抗生素等各种大分子和小分子物质非共价结合，因此在临床试验和基础研究中成为非常有用的工具。当这些胶体金标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。目前在医学检验中应用的免疫胶体金技术主要是斑点免疫金银染色法、免疫金渗滤法和免疫层析检测(ICT)试剂盒。斑点免疫金银染色法(IGSS)斑点免疫金银染色法是将Dot-ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。将

16、蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点。Liu Y等(2001)用dot-IGSS检测35例确诊华支睾吸虫病患者的血清，均为阳性反应，血清抗体平均效价为1：1 656，表明dot-IGSS具有很高的特异性和敏感性。快速斑点免疫金染色法(R-Dot-IGS)吴胜吉等1497用R-Dot-IGS法、IFAT法和ELISA法同步检测83份华支睾吸虫病患者血清，75例健康人血清和10例日本血吸虫病人血清。三种方法的阳性率分别为%、%和%;检测75例健康人血清结果均为阴性：检测10例日本血吸虫病人血清，

17、有1份日本血吸虫病人血清在IFAT反应为阳性。表明R-Dot-IGS法具有敏感特异、快速简便等优点，适用于华支睾吸虫病的现场流行病学调查和临床快速诊断。斑点金免疫渗滤法(DIGFA)斑点金免疫渗滤法是近年来发展的以胶体金为非酶标记物的快速斑点免疫结合试验，胶体金是负电荷的疏水胶，其负电荷是散在存在的，直径从几纳米到十几纳米不等，成橘红色。该法的原理和实验过程与两点的ELISA相同，差别仅在于加样、反应和洗涤均通过渗透完成。刘登宇等15以华支睾吸虫成虫抗原为包被抗原，金标记葡萄球菌A蛋白(SPA)为显色剂，检测血清抗体，用dot ELISA作平行对照，患者血清阳性率分别为%和%，两者的敏感性相近

18、。而DIGFA检测猪囊尾蚴患者血清20 例、日本血吸虫病患者血清25 例、健康者血清40 例，前两者的交叉反应率分别为5%和4%，后者均为阴性。胶体金免疫层析检测(ICT)试剂盒胡旭初等16以华支睾吸虫成虫水溶性抗原、分泌排泄抗原和重组抗原磷酸甘油酸激酶(PGK)作为诊断试剂,制备胶体金免疫层析检测试剂盒，检测患者血清和唾液中抗华支睾吸虫IgG，并与常规ELISA血清学检测方法和粪便虫卵检查法相比较。实验室检测临床确诊的华支睾吸虫病人血清中特异的IgG，3种抗原的敏感性均为100%。天然抗原除与慢性血吸虫病人血清有较强的交叉反应外，与囊虫、包虫、弓形虫病人血清没有交叉反应。重组PGK抗原同慢性

19、血吸虫病人血清也没有交叉反应。用分泌排泄抗原制备的ICT检测试剂盒在流行区现场检测被调查者的血清和唾液,总符合率为%;ICT与ELISA血清检测的总符合率为%。现场获取了9 人的粪便样本，其中4 人检出华支睾吸虫卵,其血清ICT和ELISA检测均呈强阳性,另外未检出虫卵的5 人中，1 人血清ICT和ELISA均呈阳性，另1 人仅血清ELISA呈弱阳性。证明诊断华支睾吸虫感染的ICT抗体检测技术，尤其是无创性唾液检测技术，简便、快速、准确、安全，优于血清ELISA检测和粪便虫卵检测，适用于临床检验和现场大规模流行病学调查。3 展 望华支睾吸虫病免疫学诊断方法具有客观、操作简便等优点，有取代传统诊

20、断方法的趋势，但另一方面这些方法也存在着假阴性、假阳性及交叉反应等不足。如用于检测抗体的ELISA，免疫诊断抗原直接影响检测效果，即检测的敏感性和特异性。因此，免疫诊断抗原一直是免疫学诊断的研究重点。华支睾吸虫免疫诊断抗原分为粗抗原、纯化抗原和重组抗原等三类。粗抗原制备方法简便，敏感性较高，但特异性不强，与其它寄生虫抗体也有交叉反应。纯化抗原是采用各种纯化技术包括用硫酸铵盐析、离子层析、凝胶过滤层析、反向高效液相色谱等技术，对可溶性蛋白抗原进行纯化分离，获取特异的蛋白组分，具有高度的特异性，但制备工艺复杂，抗原得率低，不易标准化。重组抗原是采用基因工程技术，将华支睾吸虫体内编码某一特定抗原的基

21、因，通过扩增、纯化后，与合适载体重组转移到另一种生物体内，使后者获得前者的遗传特征，并表达重组的华支睾吸虫抗原。重组抗原不仅为解决虫源问题提供一条可行的途径，而且可以根据需要剪接以提高和改善抗原的敏感性和特异性17。目前，用于免疫学诊断的重组抗原，检测结果显示特异性较高，但敏感性较低，所以找到具有更高特异性、高敏感性、更稳定、制备方法更简单的诊断抗原并改进免疫学诊断方法是今后一段时期本领域研究的重点所在。【参考文献】 1 金宁一,胡伸明,冯书章，等.新编人兽共患病学M.北京:科学出版社，2007：789-799. Xu Long-Qi,Yu Sen-Hai,Chensinensis in Ch

22、inaJ.Asian Parasitology Series Monograph,2005,1:1-22.Lee JY,Kim TY,Gan XX,et al. Use of a recombinant Clonorchis sinensis pore-forming peptide,clonorin,for serological diagnosis of clonorchiasis J. Parasitology International, 2003, 52 (2):175-178.HE Lijie,ZOU Xuehua,LUO Jinping. Study on the Applica

23、tion of Recombinant 26kDa Glutathione S-transferase Protein ofto the Detection of Specific AntibodyJ. Journal of Tropical Medicine,2005,5(2):197-199 .Zhao QP,Moon SU,Lee HW,et al. Evaluation of Clonorchis sinensis recombinant 7-kilodalton antigen for serodiagnosis of clonorchiasisJ.Clinical and Diag

24、nostic Laboratory Immunology, 2004,11(4):814-817.崔香淑,金元哲,李顺玉.华支睾吸虫分泌-排泄抗原在血清学诊断中的意义J.时珍国医国药,2006,17(9):241-243.YE Chunyan,WANG Feng,WU Xiuping,etof excretory-secretory antigen and crude antigen ofadult larvae for the serodiagnosis of clonorchiasis by ELISAJ.Journal of Practical Diagnosis and Therapy

25、,2008,22(4):241-243.PEI Fu-quan,FANG Yue-yi,CUI Hui-er,eton the specific igg and its subsets in sera from patients infected with clonorchis sinensis by ABC-ELISA J.Chinese Journal of Parasitic Disease Control , 2004,17(2):100-102.CUI Huier,PEI Fu quan,Isao Nagano,eton the Application of Clonorchis s

26、inensis Recombinant Antigen to the Detection of Specific Circulatory Antibody by ABC-ELISAJ. Journal of Tropical Medicine,2004,4(2):136-138.10 裴福全,崔惠儿,方悦怡,等. 链球菌蛋白G-ELISA用于华支睾吸虫病诊断的方法初探J.华南预防医学,2007,33(6):37,42.11 PEI Fu-quan,CUI Hui-e,Isao Nagano,et a1. Effective evaluation of SPG-ELISA based on a

27、recombinant antigen in detection of Clonorchis sinensis circulative antibodyJ. Journal of Pathogen Biology,2008,3(4):300-303.12 Pei FQ,Nagano I,Wu ZL,etexpression of a Clonochis sinensis cysteine proteinase and its application in ELISA for clonorchiasis dianosis J.Chin J Parasit Dis Con, 2005, 18(2)

28、:103-107.13PEI Fu-quan,Isao nagano,FANG Yue-yi,eton the applied effect of a recombinant cysteine proteinase of Clonorchis sinensis in serological surveyJ. Journal of Pathogen Biology,2008,3(8):598-600.14 刘登宇,胡文庆,张鸿满.斑点金免疫渗滤法检测华支睾吸虫病患者血清抗体的研究J.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2001,19(2)：97-99.15 胡旭初,徐劲,陈守义,等.华支睾吸虫病金标诊断试剂盒的研制和现场初步实验J.中国寄生虫病防治杂志, 2003,16(3):155-158.16 吴胜吉,李鹏,王丹敏,等.R-Dot-IGS法、IFAT法与ELISA法诊断华支睾吸虫病的比较研究J.中国临床医药研究杂志,2008, 5:9-11.17 JIANGin the research on recombinant diagnostic antigens of Clonorchis sinensisJ. Journal of Pathogen Biology,2007,2(2):155-158.