斑叶露兜树茎腐病病原菌的鉴定及其在植株体内的分布.docx

1、斑叶露兜树茎腐病病原菌的鉴定及其在植株体内的分布建议：1、前言说明研究的重要性，前人有研究吗，知道是什么菌，提高菌鉴定意义的说明。2、讨论中，要把研究的意义说出来，比如，明确了菌源，未见报道，为防治提供依据，3、我给你查了世界文献，不多，你看了后，说明几个问题，叶露兜树茎腐病有人鉴定过吗？Fusarium verticillioides 还可以发生在什么上面？前人都对这个研究作了什么？我们的研究要干什么。4、题目“斑叶露兜树茎腐病的发生特性及其病原菌分子鉴定”斑叶露兜树茎腐病病原菌的鉴定及其在植株体内的分布肖荣凤，林抗美，郑雪芳，蓝江林，刘 波*（福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建，福州

2、 350003）摘要：本研究分离与鉴定了引起斑叶露兜树茎腐病的病原菌并分析了病菌在该植株体内的分布特性。采用常规病原菌分离方法、Booth镰刀菌鉴定方法及菌株的rDNA-ITS序列分析，明确了从福建建新采集的斑叶露兜树茎腐病的病原菌为串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)。该菌在斑叶露兜树植株体内的数量分布的研究结果表明，含菌量因植株部位和病情不同而有明显差异。就分离的部位而言，茎部的含菌量最大，其次为根部，而叶部的含菌量最少；就病情而言，病株的含菌量是无症株的23倍。关键词：斑叶露兜树；串珠镰刀菌； ITS序列分析；体内分布中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：Id

3、entification of Fusarium verticillioides causing root rot of Veitchs Screw Pine and distribution of the pathogens inside the plantsXIAO Rong-feng, Lin Kang-mei, Zheng Xue-fang, LAN Jiang-lin, and LIU Bo(Agricultural Bioresource Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 3500

4、03, China)Abstract: The objectives of this study were to isolate and identify pathogen which caused root rot on the plant of Pandanus veitchii Dall, and to determine the distributions of this isolate inside the plant. The result showed that the pathogen was Fusarium verticillioides which was isolate

5、d from P.veitchii , in Jianxin, Fujian province, PR China, and identified by using Booths method and the sequence of its rDNA-ITS. Meanwhile, the distributions of F. verticillioides were detected inside the symptomatic and asymptomatic P. veitchii plants and found that the amount of the pathogen was

6、 higher in the base stem than that in the root, and least in the leaves. The amount of the pathogen in the symptomatic plant was 23 times higher than that in the asymptomatic plant. Keywords: Pandanus veitchii Dall; Fusarium verticillioides; rDNA-ITS ; Distribution 斑叶露兜树（Pandanus veitchii Dall.），原产中

7、南太平洋的波里尼西亚及其诸岛屿，现已成为世界流行的室内常绿观叶植物之一。斑叶露兜树叶形、叶色具有较高观赏价值，具簇生圆柱状肉质根和短的根状根，叶基生，条形至长披针形，全缘或稍波状，适宜于室内装饰，近年来我国也有广泛的引种栽培。在福州建新花卉基地发现部分观赏盆景斑叶露兜树出现茎腐病，表现为茎部受害严重，目前还未有关斑叶露兜树茎腐病相关病原菌的研究报道。鉴于该作物的经济与观赏价值、茎腐病所造成的严重为害以及该病害的相关病原菌未见报道，弄清该病原菌具有重要的理论意义，并可为该病害的有效防治提供理论依据。本文从花卉基地采集了无症株及自然感病的植株进行病原菌分离，对其病原菌进行了鉴定，同时研究了病原菌在

8、无症株与病株体内的分布情况。现将研究结果报道如下:1 材料与方法1.1 植株症状观察试验于2003年在福州建新花卉基地进行，观察到部份斑叶露兜树盆景植株的茎基部出现茎腐状，因此，采集无症株与病株各3株进行进一步的病害症状观察与病原鉴定。1.2 病原菌的分离与形态鉴定采用常规的组织分离法进行病菌的分离（方中达，1998）。切取病株根茎处变色木质部，将新鲜病组织切成0.50.3 cm大小的薄片，经75酒精处理2 s，再用0.1升汞处理23 min，取出用无菌水清洗3遍，置于马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）上培养，每皿放5片病组织，共分离15个样本，251.5 培养。随机挑选10个有代表性组织块上的分

9、离物进行单孢分离，分离纯化培养后采用-80 甘油冷冻保存。病原鉴定依据Booth（1971）的鉴定方法：单孢分离纯培养物，接在PSA培养基上，25 培养4 d，测定单孢菌落的生长速度，取培养15 d的培养物进行孢子形态及产孢细胞观察，测量各类型分生孢子长度与宽度。1.3病原菌的致病性检测根据Koch氏法则进行分离物的回接测定。将1.2中的单孢纯化保存的分离物扩大培养后，配成浓度为1.0106 cfu/mL孢子悬浮液，采用浸根接种叶长约为15 cm的盆栽苗，由于该植株根茎部组织较硬，采用的浸根时间为5 h，以清水处理的做对照，各处理10株，观察植株的发病情况并重新分离发病株的病原物。1.4 病原

10、菌的分子鉴定1.4.1 rDNA-ITS区扩增采用CTAB法提取菌株DNA，引物设计合成参考杨红等（2002）方法，正向引物：5-CTTGCGTTGATTACGTCCC -3，反向引物：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3。PCR反应的总体积为25 L，含有1个单位的Taq酶、10buffer 2.5 L、dNTP 0.2 L、10 umol/L的正向引物和反向引物各1 L、DNA模板25 ng。PCR扩增程序：94 预变性10 min，94 变性1 min，55 退火1 min，72 延伸2 min，共25个循环，最后72 延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收

11、。1.4.2 PCR产物的直接比对分析测序 将回收的目的片断送交上海生工生物工程技术服务有限公司。序列结果通过国际互联网(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)进行核酸同源性检索，检索程序主要采用Blast，即核酸序列对核酸序列数据库的检索。通过DNAStar软件中Clustal W方法及MEGA31软件进行序列分析。1.5 串珠镰刀菌在斑叶露兜树植株体内的分布根据症状观察与分离物形态鉴定结果，取1.1中采集的斑叶露兜树无症株（AS）与自然感病植株(S)分段取样。方法：选无症株与病株各1株，且各取6个样品，分别为根部1（正常根）、根部2（有褐变根）、茎部1（茎基部无病症处）、茎

12、部2（茎上部有病症处，健康株无病症；如图2、3）、叶部1（心叶3片）、叶部2（老叶1片）。根部1、根部2、茎部1、茎部2各截取5 cm称重；叶部1、叶部2称重。用清水冲洗、升汞消毒、无菌水漂洗后，加入无菌水100 mL，用匀浆器制成匀浆。梯度稀释涂平板，各吸取0.2 mL至含终浓度为200 u/mL链霉素的PSA平板上，均匀涂布，在25 的培养箱中培养3 d。每个稀释度3次重复。采用平板菌落计数法统计优势种群的单菌落数，计算各样品组织每克鲜重的含菌量。分析无症株（AS）与病株（S）植株体内的串珠镰刀菌的分布状况。2 结果与分析2.1 病原菌的分离与形态鉴定2.1.1 田间症状斑叶露兜树植株（图

13、1）的根茎叶均可受到不同程度的感染，根部主要表现为变色腐烂；茎基部则变色凹陷，严重时病斑上出现白色的菌丝体（图2箭头所示）；病茎纵切面组织呈现褐色（图3-S），而健茎颜色正常（图3-AS）；发病初期叶片出现零星褐色病斑，后期叶片枯萎。ASS茎2Stem 2茎1Stem 1ASS图1 斑叶露兜树植株Fig.1 Veitchs Screw Pine图2 病茎(S) 与健茎( AS); 茎1和茎2Fig.2 Symptomatic stem (S) and asymptomatic stem (AS)，stem 1 and stem 2图3 病茎(S)与健茎(AS)纵切面Fig.3 Vertical

14、 section for symptomatic stem (S) and asymptomatic stem (S)2.1.2 病原菌的形态鉴定供试验的15个组织样本中，有13个样本中出现白色的分离物。经单孢分离保存菌株10株，编号为Fm-B.1.1-030221-01至Fm-B.1.1-030221-10。通过平板培养与显微观察结果表明，10个分离物具有相同的特征。在PSA培养基上生长4 d的菌落平均直径为45（4247) mm，菌丝白色至淡紫色，稀疏棉絮状（图4）。小型分生孢子数量多，呈椭圆形或卵圆形，大小17.9 (12.523.6)2.6 (2.23.0) m，在产孢细胞中串生；大型

15、分生孢子镰刀型，细长，顶端逐尖，3个隔膜的居多，大小为26.6 (20.533.5)2.8 (2.53.8) m（图5）。产孢细胞单瓶梗，分枝或不分枝（图6）。依据Booth（1971）的鉴定方法，串珠镰刀菌在PSA培养基上生长4 d的菌落直径大于25 mm，小型分生孢子多且串状着生，大型分生孢子镰刀状、较细、具3-5个隔膜，产孢细胞单瓶梗状，因此，确定侵害该植株的病原菌为串珠镰刀菌（F. verticillioides）。图4 菌株在PSA培养基上菌落形态Fig.4 The colony of isolation on PSA medium图5 菌株的分生孢子形态小型分生了孢子：实线箭头所示

16、；大型分生了孢子：实线箭头所示Fig.5 The conidiophores of isolationmicroconidia : real line arrow，macroconidia : broken line arrow图6 菌株的产孢细胞（实线箭头所示）Fig.6 Conidiogenous cells of isolation（real line arrow）2.2病原菌的致病性检测 接种病原分离物的植株从25 d开始均出现不同程度的症状，症状表现为边缘叶片出现轻微的黄化萎蔫，根部褐变，茎部纵切可见维管束组织变褐色，而清水处理植株生长正常。对接种发病的根茎部病组织进行分离鉴定，获得

17、了与接种前相同的微生物，证实了该病原菌对斑叶露兜树植株的致病性。2.3 病原菌的分子鉴定利用引物P1/ ITS4 对供试菌株Fm-B.1.1-030221-01的rDNA-ITS区进行扩增，扩增图谱见图7。从扩增图谱可见，供试菌株扩增出单一条带，大小为700 bp左右。经测序表明，菌株的ITS长度为716 bp，序列已登录GenBank，序列号为EU717682。序列结果通过国际互联网(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)用Blast进行同源性搜索，得到的同源序列全部是镰刀菌属不同的物种。并选择作物上主要镰刀菌属各2个菌株进行rDNAITS序列共同比对，利用Clustal W

18、软件将序列匹配排列，用MEGA31软件采用近邻归群法(Neighbor Joining，N-J)构建系统发育树从系统树可以看出（图8），供试验菌株与GenBank中的2株串珠镰刀菌（F. verticillioides）AB237662及AF455422的同源性为99%，与2株类尖孢镰刀菌（F. oxysporum）AY18989EY DQ452450的同源性为92%，而与2株茄病镰刀菌（F. solani）的同源性仅为83%。根据Taylor(2000)等概述的用PSR(Phylogenetic Species Recognition) 作为鉴定真菌种的标准和Renske Landeweer

19、t（2003）的丝状真菌分子分类原则：即对菌株的ITS区域比对，丝状真菌在种间、种内遗传距离上有差异，序列相似性99，鉴别为相同种。因此，供试菌株的鉴定结果应为串珠镰刀菌（F. verticillioides），该结果与传统形态鉴定结果相一致。700 bp图7 rDNA ITS区段PCR扩增凝胶电泳图(M: mark; 1: 供试菌株)Fig.7 The electrophoresis of ITS PCR(M: mark; 1: tested isolation)图8 分离菌株及来自GenBank的镰刀菌属不同种的 rDNA-ITS序列构建的N-J系统发育树Fig.8 The N-J phy

20、logenetic tree based on ITS sequences of Fusarium strains download from GenBank.2.4 串珠镰刀菌在斑叶露兜树植株体内的分布试验结果见表1。串珠镰刀菌在斑叶露兜树植株体内的数量分布因植株部位和病情不同而有明显差异。就分离的部位而言，茎部的含菌量最大，其次为根部，而叶部的含菌量最少。在病株中，茎部中出现茎腐症状的茎2部位大约是未出现症状的茎1部位（图2所示）的含菌量的12倍，分别为1.47105 cfu/g-1鲜重和1.23104 cfu/g-1鲜重；根部中的有褐变的根2部位的含菌量为3.28103 cfu/g-1，

21、比正常的根1部位的含菌量高出近6倍；但所取的叶1与叶2两个部位的含菌量无明显差异，在33-47 cfu/g-1之间。在健株中，茎1与茎2部位间无明显差异，含菌量在为（3.15-3.19）103 cfu/g-1之间；叶1与叶2两个部位的含菌量也无明显差异，在42-44 cfu/g-1之间；但根部中的有褐变的根2部位的含菌量为3.28103 cfu/g-1 ，比正常的根1部位的含菌量高出近18倍。就病株与无症株间的平均含菌量比较而言，前者是后者的23倍。表1 不同发病级别斑叶露兜树植株内串珠镰刀菌的分布状况Tab. 1 Distributions of F. verticillioides ins

22、ide Veitchs Screw Pine plants取样部位Site of samples含菌量（cfu/g-1鲜重）The amount of F. verticillioides （cfu/g-1）无症株Asymptomatic plant病株Symptomatic plant根部1 Root 13.50105.47102根部2 Root 26.291023.28103茎部1 Stem 13.151031.23104茎部2 Stem 23.191031.47105叶部1 Leaf 14.40103.3010叶部2 Leaf 24.20104.70103 讨论斑叶露兜树茎腐病的相关病原

23、菌未见报道，本文利用常规鉴定与分子鉴定相结合的方法，明确其病原菌为串珠镰刀菌(F. moniliforme)(有性态为Gibberella fujikuroi)。串珠镰刀菌能够侵染十几个科的植物，是世界范围内危害较严重的动植物病原真菌之一（李明等，2000）。斑叶露兜树具有较高的经济与观赏价值且已发现串珠镰刀菌能在该植株上造成严重为害，因此，明确其病原菌具有重要的理论意义，也为该病害的防治提供依据，在实际生产中发挥控制病害发生和减少经济损失的作用。同时，本文也对串珠镰刀菌在斑叶露兜树的侵染位点与分布状况进行了研究，类似的研究在瓜类与茄科作物上的尖孢镰刀菌方面研究较多（Beckman，1987；

24、王建明 等，1993；黄素芳 等，2004；林抗美 等，2004），而在串珠镰刀菌方面未见报道。据报道，病原菌的侵染过程（占领空间、吸收营养、生长发育、产生繁殖体扩张发展的功能过程），不但体现了病原菌与寄主、环境条件的相互作用，而且与病害流行过程是紧密关联、互为里表（王子迎，2000）。因此，研究串珠镰刀菌在斑叶露兜树植株体内的侵入、侵染扩展与分布能为生产中的病害防治提供重要的依据。本研究的结果表明，串珠镰刀菌在该植株体内的数量分布因植株部位和病情不同而有明显差异。就不同部位分离结果而言，串珠镰刀菌侵染斑叶露兜树很可能是从植株根部侵入，侵入后导致根和茎基部维管束变褐色，并引近土面部位茎腐。通过

25、对根部及茎部无症状部位与有明显症状部位的分析发现，有明显症状的部位含菌量比无症状部位高出6倍以上，说明串珠镰刀菌侵染植株造成的主要症状为根、茎褐变腐烂。就病株与无症株间的平均含菌量比较而言，前者是后者的23倍，说明引起植株表现病症需要累积一定的含菌量。针对串珠镰刀菌侵染斑叶露兜树的特性，结合其的生长方式一般以盆景或在观赏场所种植，其生长特性为喜阴植物，适宜生长温度为1832 ，增加了病原菌的侵害机会。因此，需对育苗或移植的土壤进行适当的消毒处理，并保证其生境通风良好。ReferencesBeckman C H. 1987. The Nature of Wilt Disease of Plant

26、 . American Phytopathological Society, St.Paul. MN. Booth C. 1971. The Genus Fusarium. Commonwealth Mycological Institute: Kew, England.Fang Zhong-da. 1998. Methology for Plant Pathology. Beijing: China Agricultural Press. (in Chinese) 方中达. 1998. 植病研究方法. 北京：中国农业出版社.Huang Su-fang, Zhu Yu-jing, Xiao R

27、ong-feng, Liu Bo, Su Ming-xing, Zhou Han-tao. 2004. Identification of capsicum wilt pathogen and its distribution inside the plants. Journal of Xiamen University(Natural Science ) , 43(Supplement):71-73.(in Chinese) 黄素芳, 朱育菁, 肖荣凤, 刘波, 苏明星, 周涵韬, 2004. 辣椒枯萎病原菌分离鉴定及其在植株体内的分布. 厦门大学学报(自然科学版), 43(增刊):71-7

28、3.Li Ming，Qian Yue-zhen，Yang Xue-jign，Wang Ke-rong. 2000. Vegetative compatibility of Fusarium moniliformeJournal of Nanjing Agricultural University,23(2)：3l-34.(in Chinese)李 明，钱月珍，杨雪静，王克荣. 2000. 串珠镰刀菌的营养体亲和性研究. 南京农业大学学报, 23(2):31-34. 49.Lin Kang-mei, Xiao Rong-feng, Liu Bo, Shi Huai, Xie Guan-lin.

29、2004. Distribution of Fusarium Pathogen Inside the tissue of the melon and its microbiological characteristics. Journal of Xiamen University(Natural Science ) , 43(Supplement):63-66.(in Chinese)林抗美, 肖荣凤, 刘 波, 史 怀, 谢关林. 2004. 甜瓜枯萎病原菌的微生物学特性及其在植株体内分布. 厦门大学学报(自然科学版), 43(增刊):63-66.Renske L, Paula L, Tho

30、mw K. Molecular Identification of Ectomycorrhizal Mycelium in Soil HorizonsJ. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(1):327333.Taylor JW, Jacobson DJ, Kroken S, Kasuga T, Geiser D M, Hibbett DS, Fisher MC. 2000. Phylogenetic species recognition and species concepts in fungi.Fungal Genetics

31、 and Biology,31:21-32 .Wang Jian-ming Zheng Jing-wu He Yun-chun Li Zhi-gang. 1993. A study on the existing form ,number of distribtion and fluctuation laws of Fusarium oxysporum f sp. niveum watermelon plant. Scientia Agricultura Sinica, 26（3）：69-74. (in Chinese)王建明, 郑经武, 贺运春, 李志岗. 1993. 西瓜枯萎病菌在植株体内的存在状态、数量分布及扩展规律的研究. 中国农业科学,26（3）：69-74.Yang Hong, Li Ying, Guan Guo-hua, Li Xiu-yu. 2002. Sequencing of ITS Region in rRNA Gene of a Heterokaryon and Its Segregants of Fusarum oxysporum spvasinfectum. Journal of Agricultural Biotechnology, 10（4）：