真菌学概述ppt课件 (1).ppt

1、临床真菌学真菌学概述,Hi Bud!,Hi pal!,Opportunity knocks!,From Donnelly JP,The main players,真菌(fungus)是一种真核细胞型微生物，一类具有典型细胞核，有核膜和核仁，胞质内有完整的细胞器，无根、茎、叶，不含叶绿素，无光合色素，细胞壁含几丁质和纤维素的单细胞或多细胞异养真核细胞型微生物。真菌广泛分布于自然界，种类繁多，有10余万种。大多对人无害，有的甚至有益，如食用蕈类，有的真菌用于生产抗生素和酿酒等。然而有些真菌也是造成动植物病害的病原菌之一，其中与医学有关的真大约有数百种，少数真菌可以引起人类感染性、中毒性及变态反应性

2、疾病（如曲霉菌属、毛癣菌属）。近年来，由于抗菌药物的广泛应用和或应用激素、抗癌药物导致机体免疫低下等原因，而使机会致病真菌感染明显增多（如曲霉菌、组织胞浆菌、卡氏肺胞菌、马尔尼菲青霉菌）。,第一节 分类,真菌属真菌界，真菌属真核细胞型微生物。真菌的营养方式是吸收，植物的营养方式是光合作用。真菌分类的主要依据为：有性生殖的各种器官、无性菌丝、孢子及菌落的形态特征。,真菌分类 粘菌门 鞭毛菌亚门真菌界 接合菌亚门*真菌门 子囊菌亚门*担子菌亚门*半知菌亚门*根据卡氏肺囊虫囊虫壁的超微结构类似真菌细胞，将其称为卡氏肺胞菌,接合菌门子囊菌门担子菌门壶菌门,真菌分类接合菌亚门 分为2纲7目24科115属

3、，600余种。属条件致病菌，绝大多数为无隔、多核菌丝体，如毛霉菌、根霉菌等。子囊菌亚门：6纲1959属，15000余种。主要特征:有性生殖产生子囊和子囊孢子 包括：青霉、曲霉、小孢子菌属、毛癣菌属、组织胞浆菌等有性期、毛癣菌属、酵母菌属等。,真菌分类担子菌亚门 具有担子和担孢子，如食用菌蘑菇、灵芝以及致病性真菌新生隐球菌。半知菌亚门 3纲1825个属，约15000种。包括：酵母、隐球菌属、念珠菌属、红酵母属、丝孢酵母属、皮肤癣菌、青霉、曲霉及部分双相真菌等。,第二节 真菌的基本特性,单细胞真菌 圆形或卵圆形 酵母菌(yeast),多细胞真菌 菌丝和孢子 丝状菌(filamentous fung

4、us)交织成团 或霉菌(mold),二相性(dimorphic),一、形态与结构,单细胞真菌形态,呈圆形或卵圆形，常见于酵母菌或类酵母菌，对人致病的主要有新生隐球菌和白假丝酵母菌。这类真菌以出芽方式繁殖，芽生孢子成熟后脱落成独立个体。,多细胞真菌形态,多细胞丝状真菌能长出菌丝，菌丝延伸分枝，有的菌丝上长出孢子。各种丝状菌长出的菌丝和孢子形态不同，是鉴别真菌的重要标志。,1.菌丝 hypha,在环境适宜情况下由孢子长出芽管，逐渐延长呈丝状，称菌丝,菌丝形态(螺旋状、球拍状、结节状、鹿角状、梳状等)有助于鉴别,有性孢子:同一菌体或不同菌体上的2个细胞融合经减数分裂形成,无性孢子:菌丝上的细胞分化或

5、出芽生成 病原性真菌大多形成无性孢子,分生孢子,叶状孢子,孢子囊孢子,大分生孢子 大小、细胞数和颜色是鉴定的重要依据,小分生孢子 真菌都能产生,芽生孢子 假菌丝,厚膜孢子,关节孢子,多细胞真菌形态,关节孢子,真菌孢子和细菌芽胞的区别,二、真菌的培养特性,特点：低营养、低PH(4.0-6.0)、高湿度和氧、温度（浅部感染真菌22-28，深部感染真菌37）。培养基：沙保(Sabouraud)培养基（常加氯霉素和放线菌酮）菌落：单细胞-酵母型菌落、类酵母型菌落（假菌丝）多细胞-丝状菌落 菌落形态也是鉴别真菌的重要依据,酵母型菌落,是单细胞真菌的菌落形式，菌落光滑湿润，柔软而致密。形态与一般细菌菌落相

6、似，如隐球菌即属之。有部分单细胞真菌在出芽繁殖后，芽管延长不与母细胞脱离，形成假菌丝。假菌丝由菌落向下生长，伸入培养基中，这种菌落称为类酵母菌落，如假丝酵母菌。,C.albicans菌落(类酵母型),真菌在出芽繁殖后，芽管延长不与母细胞脱离，形成假菌丝。假菌丝由菌落向下生长，伸入培养基中，这种菌落称为类酵母菌落。,2.霉菌型菌落（丝状菌落）,是多细胞真菌的菌落形式，由许多管状分支的菌丝体构成。菌落成棉絮状、绒毛状或粉末状，菌落正背两面呈现不同的颜色。菌落的形态、结构和颜色常作为鉴定真菌的参考。真菌有从中心向四周等距离生长形成圆形菌落的倾向，所以临床体癣、股癣、叠瓦癣等皮损表现为环形或多环形。,

7、曲霉属,霉菌型菌落,青霉菌落,霉菌型菌落,双相真菌,凡在组织内和在特殊培养基上37培养时呈酵母相，而在普通培养基上和室温培养时呈菌丝相的一类真菌，统称为双相真菌（dimorphic fungi）。酵母相也称为组织相，是主要的致病相。临床上重要的传统双相真菌包括：孢子丝菌、粗球孢子菌、组织胞浆菌、皮炎芽生菌、副球孢子菌等。近年发现的马尔尼菲青霉等。近年来，有学者将双相真菌的概念扩大，认为凡是具有两种表型的真菌均称为双相真菌。如白念珠菌，在YPD培养基上，表现为酵母相；而在Lee培养基上则呈菌丝相。,双相真菌,特 征菌丝相和酵母相能相互转化，这种转化与培养温度、培养基成分、二氧化碳和氧的浓度变化有

8、关。双相真菌既能引起皮肤感染又能引起内脏器官的感染。鉴 定双相真菌的鉴定主要依赖于转化试验。,真菌的繁殖方式,有性繁殖无性繁殖 出芽繁殖：为酵母菌的主要繁殖方式。分裂繁殖：以二分裂法进行繁殖，可见于某些双相真菌在体内的繁殖。芽管繁殖：真菌孢子萌发芽管，芽管延长后形成菌丝。生隔繁殖：分生孢子在分生孢子梗某一段落形成一横隔，原生质浓缩后形成一个新的孢子，该孢子又可再独立进行繁殖。,致病性,病原性真菌感染：主要为外源性真菌感染。条件致病性真菌感染：主要为内源性真菌感染。真菌变态反应性疾病真菌性中毒真菌与肿瘤,抵抗力,对干燥、日光、紫外线及一般消毒剂抵抗力强对热敏感，601小时菌丝、孢子均被杀死对细菌

9、抗生素不敏感对二性霉素B、制霉菌素、咪康唑、酮康唑、氟康唑和伊曲康唑敏感,临床标本的采集及检验程序 浅部感染真菌的检查可用70%乙醇棉球擦拭局部后取皮屑、毛发、指（趾）甲屑等标本。深部感染真菌的检查可根据病情取痰、血液、脑脊液等标本。标本类型：皮肤的角质性物质：皮屑、毛发、指（趾）甲屑等。分泌物和排泄物：痰、生殖道分泌物、尿液等。血液和体液：血液、脑脊液、胸水、腹水、淋巴穿刺液、脓液及渗出液等。注意事项：若为浅部真菌感染，应刮片取病变部位边缘的痂鳞屑。余同细菌感染标本采集事项。,真菌检验,各种真菌的形态结构有其一定的特殊性，一般可以通过直接镜检和培养进行鉴定，但具体方法应根据标本种类和检查目的

10、而异。,一、标本的直接检查,显微镜检查抗原检测,显微镜检查,皮屑、毛发、指（趾）甲屑等标本置玻片上，滴加10%KOH少许，以盖玻片覆盖后在火焰上微微加温，使被检组织中的角质软化。轻压盖玻片，使标本变薄透明，然后在低倍或高倍镜下检查。若见菌丝或孢子，即可初步诊断患有真菌癣，但一般不能确定其菌种。皮肤癣标本检查常用湿标本，不加染色。假丝酵母菌感染则取材涂片，行革兰染色;隐球菌感染取脑脊液离心。沉淀物用墨汁作负染色后镜检。结果的判断：直接检查阳性有意义，阴性不能排除感染。但阴道、痰等分离出假丝酵母菌、曲霉等条件致病菌需多次阳性才有意义。组织中发现分隔分枝的菌丝多为曲霉;粗大、不分隔或不分枝的菌丝多为

11、毛霉。假丝酵母菌出现假菌丝代表活动性，有意义。皮肤癣菌菌丝肥大粗长，提示处于活跃状态。酵母型和二相型真菌在组织内常表现为孢子。,10,10%KOH 压片：浅部真菌感染，敏感性更高,抗原检测,近年来有许多方法用于检测深部感染真菌的抗体，作辅助诊断荚膜组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。但系统性感染患者常因免疫功能降低不出现抗体；而且许多真菌间抗原性有交叉反应；有的产生抗体后维持时间较长，正常人群中有一定比例的阳性率，则必须结合临床情况分析结果才能作出恰当的诊断。由于上述检测抗体受到许多因素的限制，及深部真菌感染时，早期培养阳性率甚低，晚期则多于失去治疗时机，因此用免疫学方法从血清或其他部位检测真菌抗原，

12、对早期诊断具有重要意义。如乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原，ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原及免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原等，均为早期，快速、特异的诊断方法。,血清学试验,（1）测抗原 胞壁1,3-D-葡聚糖（G试验），表面抗原甘露聚糖（LA试验），热不稳定蛋白（LA试验），胞浆蛋白烯醇化酶（ELISA和WB），Mr 65000蛋白（抑制ELISA）等。（2）测抗体 烯醇化酶（P47）抗体（ELISA），白念珠菌芽管抗体（CAGTA）间接免疫荧光法。（3）GM试验临床意义：早期诊断侵袭性曲霉菌感染检测物质：半乳甘露聚糖（Galactomannan）试验原理

13、：双抗夹心法酶联吸附试验标本：血清、肺泡灌洗液、脑脊液,二、分离培养,直接镜检不能确诊时应作真菌培养。皮肤、毛发、甲屑标本经70%乙醇或2%石炭酸浸泡23min杀死杂菌，无菌盐水洗净后接种于含放线菌酮和氯霉素的沙保培养基上，2528数日至数周，观察菌落特征。必要时做小培养，于镜下观察菌丝、孢子特征进行鉴定。阴道、口腔粘膜材料可用棉拭子直接在血平板上分离。若为血液需先增菌，脑脊液则取沉淀物接种于血平板上37培养。若疑为假丝酵母菌取菌落研种于0.5ml血清试管内，371h后涂片革兰染色。见有假丝酵母菌细胞长出芽管即可初步鉴定为假丝酵母珠菌。,培养基的选择1、葡萄糖蛋白胨琼脂:也叫Sabourand

14、(沙保罗或沙氏)琼脂。它适合于多种霉菌的生长。2、血琼脂培养基：适合于假丝酵母菌3、DTM：含蛋白胨、葡萄糖、酚红、放线菌酮、庆大霉素、四环素等。它用于分离皮肤真菌。4、左旋多巴-枸橼酸铁=咖啡酸培养基：用于新生隐球菌的分离。5、酵母浸膏磷酸盐琼脂：分离荚膜组织胞浆菌和皮炎芽和菌。,二、分离培养,培养方法:玻片培养法(小培养);平皿培养法;大试管培养法,二、分离培养,培养温度：2528和3537,菌落直接观察 观察菌落的生长情况是鉴别真菌的主要方法之一。观察菌落时注意菌落性质菌落大小菌落颜色菌落是否下沉，是否使培养基开裂。菌落涂片观察：丝状菌菌落用乳酸酚棉兰染色镜检。,1.在玻片滴上棉兰,2.

15、制作胶带粘菌小旗,3.胶带黏面轻压菌苔粘菌,4.在胶带与棉棒交接处滴数滴75%酒精,丝状真菌鉴定重要步骤乳酸酚棉兰压片,5.翻转棉棒有菌面贴在拨片33,6.胶膜上再滴棉兰,7.再加上盖玻片,丝状真菌鉴定重要步骤乳酸酚棉兰压片,8.用手压实盖玻片34,三、生化试验,糖发酵试验：利用真菌对各种糖的分解能力及代谢产物不同，借以鉴别。试验方法同细菌试验，主要用于检验深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。常用的有单糖（葡萄糖、果糖、半乳糖），双糖（麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖），三糖（蜜三糖），多糖（淀粉）；醇类有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇等。同化碳源试验：将1ml含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基（

16、45）混合，然后在培养基上分别加入各种糖少许，置25或37孵育后观察结果。若24h后无变化可重复加糖少许。如能同化，在加入糖的周围有生长圈，否则无生长。固体平板培养基适用于生长快的真菌，而液体培养基则适合于生长慢的真菌。,三、生化试验,同化氮源试验或利用硝酸甲试：方法同同化碳源试验，但需无氮源的培养基，不加糖，加入硝酸甲。其它：另外还有牛乳分解试验和脲酶试验、明胶液化试验等，操作方法同细菌鉴定。,四、动物试验,主要用于分离、鉴定致病菌。常用实验动物有小鼠、豚鼠和家兔等。应按实验要求，选用一定的体重和年龄，具有高度易感性的健康动物。接种途径有皮内、皮下、腹腔、肌肉、静脉、脑内和灌胃等。接种后应仔

17、细观察动物的食量、精神状态和局部变化，有时尚要测定体重、体温和血液等指标。若死亡应立即解剖，检查病变，或进一步作分离培养，证实由何病菌所致。,五、核酸检测,（一）DNA中G+C mol%含量测定（二）电泳核型（EK）分析（三）随机扩增多态性DNA（RAPD）分析,（一）DNA中G+C mol%含量测定,是最早用于真菌分类学研究的分子生物学技术。目前在酵母菌的应用较为成功。即利用真菌DNA中核酸序列的同源性及基因大小相似性的遗传特征，测定DNA中的碱基含量（G+C mol%含量）作为真菌分类鉴定的重要遗传指标之一。因为每种真菌都有固定的G+C mol%范围且较为稳定，不同生物种的G+C 含量是不

18、同的，生物种之间的亲缘关系越远，其G+C 含量差别就越大，反之亦然，因而可作为真菌的分类学指标。,（二）电泳核型（EK）分析,电泳核型是指细胞中的染色体在一定电场作用下在固体包埋物中的排列情况，反映了染色体的大小、数目和形状的差异。它是通过脉冲电场凝胶电泳（PFGE）完成的，能分辨50 kb至 10 Mb范围内的DNA分子，基本满足酵母菌和丝状真菌的要求。对病原体而言，EK分析特别适用于低等真核微生物或原虫，它无需用RE消化和探针杂交，就可方便地从EK的差异区别不同的菌种。EK分析带型清晰易辨、分辨力较强，电泳条件稳定时结果重复性好。但EK受电泳条件影响较大，影响不同实验室间的可比性，而且相同

19、大小两条不同染色体往往因迁移率相近呈现为同一条带，影响分辨力。此外它需要昂贵的仪器，DNA的制备及PFGE过程也均较费时。,（三）随机扩增多态性DNA分析（RAPD）,RAPD分析是一种利用随机合成的单个寡核苷酸引物通过PCR反应扩增靶细胞DNA，扩增产物经凝胶电泳，分析DNA片段大小和数量多态性，从而比较靶基因差异的一种技术。RAPD自1990年问世以来，已陆续用于酵母菌和丝状真菌的鉴定、分类和流行病学研究。这一方法适用于真菌各秩级的分类学研究，因为真菌基因组庞大，RAPD能对整个基因组序列做大致的分析，特别适用于分子生物学研究甚少、不了解基因组DNA序列的真菌。它借用的基本方法是PCR技术

20、，操作简便、迅速，便于大规模使用。,六、真菌毒素的检测,真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物都有害。真菌毒素已发现100多种，可侵害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉素可引起肝脏变性，肝细胞坏死及肝硬化，并致肝癌。实验证明，用含0.045PPM黄曲霉素饲料连续喂养小白鼠，豚鼠、家兔等可诱生肝癌，桔青霉素可损害肾小管，肾小球发生急性或慢性肾病。黄绿青霉素引起中枢神经损害，包括神经组织变性，出血或功能障碍等。某些镰刀菌素和黑葡萄穗素主要引起造血系统损害，发生造血组织坏死或造血机能障碍，引起白细胞减少症等。,六、真菌毒素的检测,检测真菌毒素有许多方法，如检测黄曲霉菌有生物学方法、薄层 层析法、高效液相色普法和间接竞争ELISA法等。生物学方法主要用于检测真菌毒素的毒性，间接竞争ELISA法 操作简单，是检测食品的好方法。,真菌概述小结,真菌分酵母菌和丝状真菌（霉菌）基本结构：孢子和菌丝或假菌丝鉴定依据：孢子形态、菌丝形态和菌落形态。镜检染色方法：革兰染色、墨汁染色、乳酸酚棉兰染色、KOH染色。培养：基础培养基沙保弱，常用试管法，2528和35 37。,