无性系育种专题.docx

1、无性系育种专题无性系育种专题 梨属植物无性育种研究进展梨属植物无性育种研究进展1. 概述无性系育种（Clonal Breeding）在天然群体或人工杂交、诱变群体中，选择优良个体，通过无性繁殖形成无性系，按一定育种目标和要求，经无性系测定选育出优良无性系并应用于生产的育种技术。包含两个内容：一是无性系选育（Selection of Clone） ；二是优良无性系造林（Clonal Afforestation）。也就是大规模采用选育出的优良无性系进行人工林定向培育。梨(Pyrus)属蔷薇科植物，有30个种。我国梨栽培品种有白梨(P.bretschneideri)，秋子梨(Pussuriensis

2、)，沙梨(Ppyrifolia)和西洋梨(Pcommunis)，其中前三种为东方梨，原产我国。梨是我国传统的果品。我国梨的栽培历史悠久，是东方梨的主要生产国，是世界梨的原产中心之一。梨的果实含有多种营养成分，如蛋白质，脂肪，糖，维生素以及多种矿质元素等，这些都是人体所必需的，因而深受人们的喜爱。然而梨树在生产中还存在某些亟待解决的问题。由于童期长和基因高度杂合两大特点使其传统的有性杂交育种成效低，工作量大。如何缩短育种时间和提高育种效率成为梨树育种工作者长期追求的目标。随着分子生物学，特别是组织培养和基因工程技术的不断进步，利用生物技术进行育种已成为可能。现就梨无性育种的研究进展作一综述。2无

3、性系育种的意义无性繁殖可继承母本的阶段性发育，从而缩短育种周期。无性繁殖的遗传改良中的潜力较大；在无性繁殖中，通过寄主基因型和病原菌基因型间基本关系的研究，有助于对育种材料的评定和抗病类型的筛选，通过微型嫁接或组培可以分离出无病毒的健壮无性系；通过扦插生根和愈伤组织根原基分化的研究，有助于了解不定根发生和发育的条件，了解生根的遗传学机理；通过原生质体融合的体细胞杂交，有助于了解无性杂交和无性杂种的实质。3无性系选育实例3.1 杨树、柳树无性系选育程序 杨树和柳树的改良程序大体上可分为杂交、 无性系选择、无性系测定、建立优良无性系采穗圃几个阶段。杨树、柳树无性系选育程序3.2.2 欧洲云杉无性系

4、选育程序欧洲云杉在德国和中欧是一种最重要的树种，约占森林总面积的40，其缺点之一是要到20-25年时才开始结实，已建的种子园尚未得到应有的效果。在联邦德国采取了种源选择与无性系选择相结合的欧洲云杉的改良方式，认为这样做能比种子园繁殖有更快更好的效果。J. Kleinschmit和J. Schmidt (1977年）所制定的欧洲云杉无性系选育程序3.2.3巴西桉树无性系选育程序巴西桉树无性系育种，是在美国著名树木改良专家，南方松种子园倡导者B, Zobel教授指导下，由Ararur Florestal公司进行的。该公司对巨桉和巨桉与尾叶桉的杂种最感兴趣。先由澳大利亚选出了大约300株优良母树，在

5、巴西进行子代测定后作为采种母树，由优良家系中选出优良个体，种植到无性系收集区。把入选树相互杂交再进行试验，从优良家系中进行渐进代选择。为此建成几个每组包括20株树的育种群，生产第二代杂种。以后各代仍依此法不断进行改良，由改良了的巨桉和尾叶桉杂交，生产“优良杂种”。从中选株再繁殖无性系，用于造林。巴西桉树无性系选育程序4.无性育种在梨属植物中的应用4.1 组织培养早在20世纪30年代，TukeY(1935)进行梨的胚胎培养获得成功。1975年，前苏联学者进行洋梨幼胚培养，获得植株。1979年赵惠祥等进行早熟系208X早酥梨杂种胚胎培养，得到比亲本更为早熟的优良单株，他还在1981年从锦丰梨胚乳培

6、养诱导出完整植株。1979年David和1981年赵惠祥从茎尖培养中，分别得到试管苗和完整植株。此外还进行了下胚轴，子叶横切段的培养，都成功地获得了不定芽。目前，梨的组织培养工作已有广泛的发展，大多数集中在叶片培养和茎尖培养两个方面。研究结果表明，不同品种，即使同一品种不同的外植体，所采用的培养基的种类、植物生长调节剂的比例和浓度、培养条件等因素也不相同。个方面。研究结果表明，不同品种，即使同一品种不同的外植体，所采用的培养基的种类、植物生长调节剂的比例和浓度、培养条件等因素也不相同。4.11 叶片培养叶片是梨组织培养中普遍采用的外植体。梨叶片培养起步较晚，始于1988年。Laimer等用西洋

7、梨品种康佛伦斯(Conference)试管苗叶片做试验，在BA和IBA的配合下，部分愈伤组织能够形成球状结构，但仅有少量球状结构转化成了不定梢。在随后的十几年的时间里，科研工作者对不同梨的品种进行了以叶片为外植体的组织培养工作。基本培养基是影响梨叶片再生的重要因素。许多研究表明，组织培养中广泛使用的MS培养基并不适合梨叶片不定芽的诱导，而以NN60为最佳培养基。如韩继成等1通过试验表明，梨的两个品种冀蜜和丰水分别以N6，NN69，MS为基本培养基，附加条件相同，结果在NN69培养基上获得了最佳效果，不定芽的诱导率为100。孙清荣等2的研究也支持了这一论点。植物生长调节剂在组织培养中起重要的调节

8、作用。不同种类、不同浓度和比例的生长调节荆对植物外植体生长和分化的作用不同。影响梨芽分化的生长调节剂主要有TDZ和BA，影响不定根形成的有IAA，IBA，NAA。但是它们并不是独立起作用，而是具有协同效应的。当培养基中生长素浓度与细胞分裂素浓度的比例高时，愈伤组织仅形成根，生长素与细胞分裂素比例小时则产生苗，而两种激素的比例适中时，产生无结构的愈伤组织。IBA，NAA对西洋梨试管苗的生根有明显的促进作用，一般而言，NAA是西洋梨栽培品种最常用的生长素，而东方梨品种则以IAA，IBA为主。叶片的培养条件一般采用12h的光周期，温度为25左右，光照强度2000 Lx。孙清荣7对金花梨叶片接种的初代

9、培养期进行暗培养3周，然后转入光下培养，不定梢再生率高达100。4.12 茎尖培养茎尖培养的目的是脱毒和快速繁殖。茎尖是植株中最年轻，细胞分裂最活跃的部位，几乎不含病毒或很少含病毒，茎尖中的生长点培养成了去除植物中病毒使植物复壮的重要方法。梨茎尖的消毒普遍采用的方法是：外植体用70的酒精浸泡30s，用无菌水冲洗3-5次，再放人0.1的升汞中10min，最后用无菌水冲洗3-5次，以彻底除去升汞。出梨茎尖培养芽的分化以AS为最佳培养基,生根培养基则以ASH和1/2MS为基本培养基。生长季节采集梨芽或茎尖进行组织培养最大的问题之一就是褐变，造成成活率低。褐变发生的原因是植物体内含有较多的酚类化合物，

10、其在多酚氧化酶的作用下，氧化而成为褐色的酚类物质和水，酚类物质以会在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植体的蛋白质聚合，生长停顿，最终导致死亡。目前采取防止褐变的措施有：缩短转瓶时间，可以控制褐变；在培养基中加入抗氧化剂，如维生素C，硫代硫酸钠，二硫苏糖醇和柠檬酸等。接种后的初代培养期进行暗处理，可以控制外植体的褐变发生；培养基低PH值可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。4.2 遗传转化目前，转基因梨的研究还没有应用于生产的的转基因植株。梨的遗传转化普遍采用了农杆菌介导法，即用携带有目的基因的农杆菌感染植物或离体器官(叶片，茎尖，茎段等)的受伤部位，然后将受伤部位的组织在选择培养基上培养，

11、筛选出转基因细胞。4.2.1 农杆菌介导法农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌；梨遗传转化起步比较晚，如今也取得了不小的成绩。1996年Mourgues等率先建立了西洋梨的遗传转化体系，通过农杆菌介导法成功地将GUS及Npt基因导入康弗伦斯，并获得高达42.7的遗传转化率。随后开展了不少梨转基因研究，但多数是为了提高转基因植株的抗病虫能力。Reyniord等3和Mourgues等分别向梨中导入attacin E基因以及抗菌肽cecropins基因，均增强了梨对火疫病的抗性。近年Puterka等4在梨中导人抗菌肽D5C1基因，不仅提高了植株抗火疫病的能力，还能显著降低梨木虱蛹、幼虫和成虫在梨树上的危害

12、。Bell等5将发根农杆菌基因rolC成功导人Beurre Bose。并获得了矮化的转基因植株。此后，Zhu等6也相继将rolB基因转入BPl0030砧木品种，但遗传转化率较低。4.2.2 影响转基因频率的因素基因型基因型是决定转基因成功与否的重要因素。梨种类和品种不同，农杆菌感染力，植株再生能力，生根能力以及转化率均不同。目前获得的转基因植株中仅有欧洲梨及少量砧木品种，而砂梨，白梨，新疆梨等东方梨系还未成功。外植体的种类已成功获得的转基因植株大多采用叶片作为外植体，这也许和叶片再生体系的稳定，高效，重复性好有关。或者叶片对农杆菌更为敏感，更易受侵染。外植体培养条件不同，转化频率也不同。梨转基

13、因中外植体与农杆菌共培养时间长短，感染后外植体暗培养时问长短，以及培养基组成都会影响转化频率。423 转基因植株的检测梨与其它植物转基因一样，先通过抗性筛选获得抗性芽后生成植株，再对抗性植株进行检测，检测阳性的植株才是真正的转基因植株。目前用于鉴定梨转基因植株的检测方法主要有以下几种。GUS活性检测：利用GUS组织化学染色法对获得的转化植株进行GUS基因表达测定。在一定的条件下，将待测定的组织置于GUS染液中，转化的组织变蓝，非转化的组织无此种反应。GUS活性检测是梨转基因植株检测的一种常规方法，在梨转基因植株鉴定中有着广泛应用。PCR检测：根据植物表达载体上的已知序列，如GUS基因和卡那霉素

14、抗性基因，以及插入到表达载体中的目的基因设计合适的引物，通过PCR扩增验证这些已知序列是否存在，从而判断某植株是否是转基因植株。Southern杂交检测：由于PCR反应极为灵敏，有时会扩增出假阳性带，所以为了证实PCR产物的真实性，需要进一步对PCR反应呈现阳性反应的部分植株单系提取DNA进行Hind酶切后的Southern杂交检测，结果得到阳性反应株系，表明外源基因已被整合到受体植株中。4嫁接4.1 砧木特性梨的砧木种类很多，生产上应用的乔化砧木有11种之多，各地所用的砧木种类见多媒体窗口。此外，另有矮化砧木。杜梨：生长旺盛，须根多，深根性。对土壤的适应性强，抗旱，抗寒，也耐潮湿，对盐碱有一

15、定的适应力，对腐烂病的抵抗力中等。萌蘖性强，易分蘖繁殖。与秋子梨、华北梨、砂梨和西洋梨的嫁接亲和力强。豆梨：幼苗期生长迟缓，粗根少，侧根多，根系较深。对土壤的适应性强，在粘重土壤上生长良好，抗旱，耐涝，抗腐烂病，对西洋梨的火疫病、衰退病的抵抗力亦强，耐寒性不及杜梨。与中国梨和西洋梨的亲和力强，是西洋梨的优良砧木。砂梨：幼苗期生长迅速，根系发达，比较开张。耐涝力强，抗旱、抗寒力弱，对腐烂病有一定的抵抗力。中国梨与西洋梨可以用砂梨为砧木，是南方温暖多雨地区的主要砧木。川梨：根系发达。对土壤适应性强。耐涝，抗旱，耐寒。与各系统梨嫁接亲和力均好，是西南地区的主要砧木。CydoniavulgarisPe

16、rs：为中亚细亚原产。其类型很多，用作西洋梨矮化砧木的有安吉斯（Angers）和普鲁文斯（Provence）一类。4.2.砧木的培育4.2.1 种子处理杜梨、豆梨、砂梨等果树的种子采收后，须经过6080天的后熟过程才能萌发，故春播须行层积处理。如秋播，则可免除层积手续。种子发芽的温度依种类而不同，一般秋子梨要在6.5，豆梨10，砂梨1012，才能开始发芽。长江流域一带，大约在3月上旬能达到这样的温度，所以春播须在2月下旬，最迟不能晚于3月上旬。4.2.2 播种分床播与直播。床播可用温床或冷床，于早春提前播下，待幼苗长至具有23片真叶时进行移栽。每亩苗约1000012000株。至于直播，可按一定

17、行距进行条播，出苗后，进行间苗或补缺，并注意病虫害防治、施肥、灌水、除草等田间管理工作，促使健壮生长，供当年秋前嫁接用。4.2.3扦插杜梨、豆梨、砂梨的枝条、根和一年生的枝条，都能扦插生根，故可用扦插繁殖。落叶后，将苗圃内的干劲和杜梨、豆梨残留土中的根截取下来，选粗度在0.5cm以上而发育良好的枝、根剪成1015cn长短，插入土中，不久即生根和萌芽而成苗。特别是，杜梨和豆梨的嫩枝，用50ppm吲哚丁酸处理，发根更好。4.2.4 嫁接时间梨树的高接换种，一年四季均可进行，一般多于早春进行枝接和秋季进行芽接。枝接常用的方法，有劈接、切接、皮下接和腹接等。圃内嫁接多采用芽接，如芽接没有成活，翌日可用

18、枝接法进行补接。枝接时期，一般在树液刚流动时进行。约在2月下旬至3月下旬。芽接时期，应在新梢停长后，芽已充分肥大，而砧木和接穗皮层能剥离时进行。7月至10月均可进行，以8月中旬至9月中下旬为最适。5. 无性系育种中应注意的几个问题5.1 优村取样材料的幼年性与一致性无性系改良最大优点是保持优树为优良特性，特别是那些质量性状或遗传力高的性状，如冠型、干型、分枝型、木材密度、物探、抗性等。然而这种繁殖方法有一缺点，就是对优树取样材料稍不注意，就会引起优树幼年性与一致性的损失。因为无性系后代的生长是取样母树该部位原材料生长的继续，如取样材料是水平枝或下垂枝，就会造成后代的位置效应；如取样材料进入成年

19、时，就会造成熟效应。这都会影响无性系改良效果。目前有效地克服方法不多，不能根本解决问题。主要克服方法如下：5.1.1干基或根系萌生条扦插繁殖复幼法法国和巴西在桉树无性系育种中已采用过这种方法。通常用成熟桉树树冠上的1年生枝条扦插是难以生根的，但40年生枝树砍倒后树桩上萌发的枝条就有较好的生根能力。我国用杉木的伐桩萌条、毛白杨留根苗做插穗都有返童复壮的效果。在毛白杨上采用的挖取幼树根段，人工促萌再用根出条嫩枝扦插繁殖成无性系。5.1.2重复修剪复幼法 萌发枝离根区越近，生理老化进程越慢，随着年龄的增长，枝梢与根系之间的距离增加，重复修剪可缩短这一距离，使母树处于矮化状态而复幼。在辐射松、桉树、柳

20、杉采用此技术均取得了成功。5.1.3连续扦插复幼法由老龄树上取得的插条扦插生根率虽低，但少量生根成活后的个体以后再多次连续扦插，生根率可以不断提高。在桉树上证明，取伐桩萌条扦插生根率为8，用这些苗再扦插，生根率提高到65。5.1.4幼砧连续嫁接复幼法就是把老龄幼树一年生新梢嫁接到幼龄的砧木上，以后连续多次继代进行这种幼砧幼穗嫁接 最后老龄树的新梢就获得了生根能力。进行这种嫁接时，接穗要尽量小些。5.1.5用组培诱导复幼法任何树种老龄树冠上的枝条扦插都难以生根，而且生根苗有明显的倾斜性。但如果对它们进行组织培养，就能使这些缺点得到克服，变得易于扦插繁殖。法国人有人把90年生红杉的穗条接至幼龄株上

21、，再取这种枝条组培，经几次继代培养后，所得的苗木生长较快，且直立苗的百分率增加，生根性也得到了改善。5.1.6 激素处理结合组织培养复幼法这是近年一些欧美国家克服老龄入选优树不能无性繁殖的最新技术，即先用一定浓度的生长物质如6BAP对嫁接在实生苗上的老龄接穗进行1次或多次处理，直到这些植株的休眠芽或针叶短枝（针叶束）中萌生出幼态的新梢后，把这种幼态新梢用于组培，由此得到的组培苗就有返老还童的特征，其穗条的扦插生根率比原株高得多。现在在花旗松、红杉、火炬松、南洋杉等多种树种上，采用此法均获得良好的效果。这些材料是否真正复幼，尚无法证明，采用这些技术往往需要较长的时间和较多的物力。在推行无性系造林

22、时，转而采用在树木成熟前对优良个体进行早期选择，利用幼龄未经测定的材料进行无性繁殖。5.2 在试种中测定，在测定中选择，是无性系改良的合理程序一般程序是优树初繁材料获得以后，就进行无性系测定，最后进行造林，这按部就班的程序，要占去大量的时间，最简单的解决办法是经短期测定以后，将中选的无性系就投入试种造林，实行边繁殖、边试种、边测定、边选择的办法。联邦德国对欧洲云杉采用的不断选择补充、反复测定、不断更新造林的程序，为我们解决这一问题提供了范例。参考文献1 韩继成,冯志红梨离体叶片诱导不定芽的研究亡J河北果树,1998(2):122 孙清荣.孙洪雁西洋梨“丰产”叶片不定梢再生J落叶果树,1999(

23、4): 9-103 Reyniord JP, Mourgues F, Norelli J, et a1First evident for difference in fire blight resistance among transgenic pear clones expression attacin E gene from Hyalophora ceeropiaJPlant Sci, 1999. 149:23-314 Puterka GJ, Bocchetti CDang P, et al. Pear transformed with a lytic peptide gene for d

24、isease control dims noaurrget organism, pear paylla(Homoptera: Psyllidae) J J Econ Eatomd,2002,95: 7978025 Bell RL, Seorm R, Srinivasan C. et e1Transformation of Beurre Bose pear with the rolC geneJJ Amer Soc Hort Sci,1999,124:570-5746 Zhu LH, Welander M . Adventitious shoot regeneration of two dwarfing pear rootstocks and the development of a transformation protocolJJ Hort SciBiotech, 2000,75(6): 745-752