中药化学成分单体化合物结构鉴定方法和程序.docx

1、中药化学成分单体化合物结构鉴定方法和程序点、比旋度、折光率和比重等的测定。固体纯物质的熔点，其熔距应在0.5度1.0度的范围内，如熔距过大，则可能存在杂质，应进一步精制或另用不同的溶剂进行重结晶，直至熔点恒定为止。液体物质可测定其沸点。液体纯物质应有恒定的沸点，除高沸点物质外，其沸程不应超过5度的范围。此外，液体纯物质还应有恒定的折光率及比重。比旋度也是物质的一种物理常数。中药的有效成分多为光学活性物质，故无论是已知还是未知物，在鉴定化学结构时皆应测其比旋度。 在用各种色谱法如薄层色谱、纸色谱、气相色谱或高效液相色谱等方法对其进行纯度检验。需要注意的是无论采用何种方法检验，因为仅用一种溶剂系统

2、或色谱条件，可能不一定能够分开所有化合物，其结论常会出现偏差。在用硅胶薄层色谱法或高效液相色谱时，最好使用正相和反相薄层或色谱柱同时进行检验，这样可以进一步保证结论的正确性。 一般样品用两种以上溶剂系统或色谱条件进行检测，均显示单一的斑点或谱峰结晶样品的熔距为0.51.0度，液体样品的沸程在5度以内，即认为是较纯的单体化学成分，可用于化合物的鉴定和结构测定。1.2化和物结构类型确定判断未知化合物的基本骨架或结构类型，如确定其母核结构是否为黄酮或者醌类等，可以帮助我们较为容易的认识化合物的波谱谱图，是进行化合物结构解析前非常重要的一步。在判断化合物基本骨架前，可先进行分子式的确定，目前最常用的是

3、质谱法3。高分辨率质谱法不仅可给出化合物的精确分子量，还可以直接给出化合物的分子式。如青蒿素4的HR-MS谱中，分子离子峰为m/z 282.1472,可计算出其分子式为C25H22O5 。也可通过质谱中出现的同位素峰的强度推定化合物的分子式。有时化合物的分子离子峰不稳定，难以用HR-MS谱测出，为确定一个化合物的分子式，需要进行元素定性分析，检查含有哪几种元素，并测定各元素在化合物中所占的百分含量，从而求出化合物的实验式。元素的定性定量分析目前多用自动元素分析仪测定，具有快速、简便等优点。得到一个化合物的实验式后，还要进一步用场解吸质谱、快原子轰击质谱或制备衍生物再测定其质谱等方法测定它的分子

4、量，以求得化合物的分子式。在确定了一个化合物的分子式后，就可以进行分子结构骨架和官能团的确定。判断未知化合物的基本骨架或结构类型。除了用波谱测定推断结构类型（如红外光谱测定官能团）外，由于同科、同属生物常含有相同或类似的化合物，应对文献中有关其原生物或近缘生物成分的报道进行调查，以此作为依据做一个母核的初步判断。并且，在进行提取、分离、精制过程中可获得对该化合物的部分理化性质（如酸碱性、极性、色谱行为及显色反应等）的认识，两者结合为判断该化合物的基本骨架或结构类型提供重要的参考依据5。1.3化合物结构的确定主要是通过波谱解析得到其结构，另外，通过一定的依据判断其可能为已知化合物时(如前面进行的

5、母核测定等)，在有对照品的情况下，最好用对照品同时进行熔点、混合熔点、色谱和红外光谱对照。如果样品与对照品的熔点相同，混合熔点不降低，色谱中的Rf值相同，IR谱相同，则可判定样品与对照品为同一化合物6。若无对照品，则应多做些数据，或制备衍生物与文献数据核对。如果欲鉴定的化合物为文献未记载的物质时，应测定该化合物及衍生物的各种波谱并进行必要的化学反应以确定其化学结构。此时如已推测出该化合物的结构类型，则应充分查找有关该结构类型、结构确定的最新文献。此外，考察它们的生物合成途径也有助于确定其化学结构。值得提及的是近代各种波谱法，在鉴定或确定中药有效成分的化学结构中，发挥着极为重要的作用。下面对主要

6、三个步骤里涉及到的方法做一个介绍。2单体化合物结构鉴定所涉及的方法介绍2.1纯度检测方法目前未知化合物纯度的测定多用薄层色谱，熔点测定作为固体未知物的纯度检测方法，也可以排除其他化合物的干扰，有利于我们进一步进行化合物进行波谱、光谱的结构研究。由于我们分离到的单体化合物多为固体晶体物质，这里作为一种知识的介绍，主要对固体物质熔点测定用于未知化合物的纯度检测做一个介绍。固体物质熔点测定：据中国药典2005版附录VII介绍，固体物质的熔点测定分为3个类型物质分别进行测定，三者分别是7：第一，测定固体易粉碎的物质，我们分离得到的物质主要是这部分，这里主要对这部分物质的熔点测定进行介绍；第二，测定不易

7、粉碎的固体药品（如脂肪、脂肪酸、石蜡等）；第三，测定凡士林或其他物质。2.1.1熔点测定基本原理 熔点定义：一个大气压下固体化合物固相与液相平衡时的温度。这时固相和液相的蒸汽压相等。每种纯固体有机化合物一般都有一个固定的熔点，即在一定压力下，从初熔到全熔（该范围称为熔程），温度不超过0.51。熔点是鉴定固体有机化合物的重要物理常数，也是化合物纯度的判断标准。当化合物中混有杂质时，熔程较长，熔点降低。纯物质的熔点和凝固点是一致的8。2.1.2测定熔点的方法91）经典方法（提勒管法），记载于中国药典2005版附录VII，但较为繁琐，目前用的较少，具体操作如下：将试样装入熔点管中，将干燥的粉末试样在

8、表面皿上堆成小堆，将熔点管的开口端插入试样中，装取少量粉末。然后把熔点管竖立起来，在桌面上顿几下，使样品掉入管底。这样反复取样多次，最后使熔点管从一根长约4050 cm高底玻璃管中掉到表面皿上，多重复几次，使样品粉末紧密堆积在毛细管底部。为使测量结果准确，样品一定要研地很细，填充要均匀且紧密。载热体一般称为浴液，根据所测物质地熔点选择。一般用液体石蜡，硫酸，硅油等。毛细管中的样品应位于温度计水银球的中部，可用乳胶圈捆好贴实（胶圈不要浸入溶液中），用有缺口的木塞作支撑套入温度计放到提勒管中，并使水银球处在提勒管的两叉口之间。加热，载热体被加热后在管内呈对流循环，使温度变化比较均匀。在测定已知熔点

9、的样品时，可先以较快速度加热，在距离熔点1520时，应以每分钟12 的速度加热，直到测出熔程。在测定未知熔点的样品时，应先粗测熔点范围，再如上述方法细测。测定时，应观察和记录样品开始塌落并有液相产生时（初熔）和固体完全消失时（全溶）的温度读数，所的数据即为该物质的熔程。还要观察和记录再加热过程中是否有萎缩、变色、发泡、升华及炭化现象，熔点测定至少要有两次重复数据，每一次都要用新毛细管重新装入样品。2）显微熔点仪测定熔点（微量熔点测定法）：该类仪器型号较多，共同特点是使用样品量少（23颗小结晶），可观察晶体再加热过程中的变化情况，能测量室温到300样品的熔点，其具体操作如下：取两片干净且干燥的盖

10、玻片将样品夹在中间，用手将样品撵碎，放在载玻片上将样品送入加热平台上，用手柄调节显微镜高度，直至可以清楚的看到晶体。打开控制器上加热开关，调节旋钮I和II使调节器上电压达到100，先让仪器快速升温，待温度升至距样品熔点值约差20左右时放慢速加热速度，控制温度上升速度为每分钟2左右。当样品结晶棱角开始变圆时，表示熔化已开始，结晶形状完全消失表示熔化已经完成，记录熔程。测毕停止加热，稍冷，用镊子取出载玻片，将装有样品的盖薄片放在小烧杯中，将散热片放在加热台上，使其快速冷却，以便再次测试用。使用仪器前必须仔细阅读使用指南，严格按照操作规程进行。2.2中药有效成分的波谱测定方法2.2.1 IR光谱10

11、红外光波波长位于可见光波和微波波长之间（0.751000um）。其中，近红外光区在0.82.5um(125004000cm-1)、中红外光区位于2.525um（4000400cm-1）和远红外区251000um（40025cm-1）。相应地有近红外光谱、中红外光谱和远红外光谱。近红外区用于含有与C、N、O等原子相连基团化合物的定量，远红外区主要用于无机化合物研究等。红外光谱主要是利用中红外光区（4000400cm-1）进行有机化合物的结构鉴定。红外光谱在有机化合物结构推测中的应用鉴定是否为某已知成分红外光谱用于官能团测定较为普遍，测得的光谱与标准物质对照，在相同的测定条件下图谱完全相同则为同一

12、化合物（光学异构体或同系物除外）。与标准图谱进行核对，如Sadtler标准光谱等，图谱完全相同为同一化合物（光学异构体或同系物除外）。但要注意所用的仪器是否相同，测绘条件（如检品的物理状态，浓度及使用的溶剂）是否相同，这些条件都会影响红外图谱的差别。检验反应是否进行，某些基团是否引入或消去化合物分子的几何构型与立体构象的研究如化合物CH3HC=CHCH3具有顺式与反式两种构型，这两种化合物的红外光谱在1000650cm-1区域内有显著不同，顺式的=CH在690cm-1出现吸收峰（s），反式在970cm-1出现吸收峰（vs）。对于未知样品，通过根据红外光谱的峰位、峰强和峰形，判断化合物中可能存在

13、的官能团，从而为未知物的结构鉴定提供有价值信息。浅谈红外光谱的解析主要是掌握影响振动频率的因素及各类化合物的红外特征吸收谱带的基础上，可按八大区段进行分析，指认谱带的可能归属，结合其他峰区的相关峰，确定其归属。在此基础上，再仔细归属指纹区的有关谱带，综合分析，提出化合物的可能结构，必要时查阅标准图谱或与其他光谱，确证其结构。红外光谱用于结构分析存在的缺陷与其他光谱比较，红外光谱谱图的解析更带有经验型、灵活性。影响红外光谱谱带的数目、频率、强度及形状的因素很多，即使是简单的化合物，红外光谱谱图也会比较复杂，单凭红外光谱确定未知物的结构式困难的。2.2.2UV光谱11紫外光分为近紫外光区（200-

14、400nm）和远紫外光区（1-200nm）两个区段，在天然药物的结构分析中，以近紫外最为有用。UV光谱的应用一般来说，UV光谱主要可提供分子中的共轭体系的结构信息，可据此判断共轭体系中取代基的位置、种类和数目。UV光谱在中药有效成分的结构确定中提供的信息较少，但对某些具有共轭体系类型的中药有效成分，如蒽醌类、黄酮类以及强心苷类等成分的结构确定却有重要的实际应用价值。另外紫外光谱可以用来区分顺、反异构体。一般来说，反式异构体的Rmax和最大吸收峰都大于相同的顺式异构体。因为反式异构体系共平面性好，容易发生共轭，故最大吸收波波长向长波方向移动，最大吸收峰值也增大。UV光谱的应用于结构分析存在的缺陷

15、UV光谱只能给出分子中部分结构的信息，而不能给出整个分子的结构信息，所以单独以UV光谱不能决定分子结构，必须与IR光谱、NMR谱、MS谱以及其他理化方法结合才能得出可靠的结论。2.2.3.NMR光谱NMR光谱能提供分子中有关氢及碳原子的类型、数目、互相连接方式、周围化学环境以及构型、构象的结构信息。目前，分子量在1000以下、几个毫克的微量物质甚至单用NMR测定技术也可确定它们的分子结构。因此，在进行中药有效成分的结构测定时，NMR谱与其它光谱相比，其作用最为重要。（1）1H-NMR谱 1H-NMR谱的化学位移范围在020ppm，正常1H-NMR谱技术能提供的结构信息参数12，主要是化学位移、

16、偶合常数（J）及质子数。H核因周围化学环境不同，其外围电子云密度及绕核旋转产生的磁屏蔽效应不同，不同类型的1H核共振信号出现不同区域，据此可以识别。偶合常数是磁不等同的两个或两组氢核，在一定距离内因相互自旋偶合干扰使信号发生裂分，其形状有二重峰（d）、三重峰（t）、四重峰（q）及多重峰（m）等。裂分间的距离为偶合常数（J）。氢核磁共振波谱解析的辅助方法13对于复杂的自旋体系，完全、甚至部分解析谱图都是相当费时的，有时甚至是不可能的。然而，幸运的是，现已有许多新技术和新方法，使谱图的解析变得越来越容易。高磁场核磁共振波谱一个化合物中氢的化学位移和偶合常数是不随仪器变化的，但是各种仪器兆赫数不同，

17、1个化学位移单位所含的赫磁数就大，如以Hz为单位，其距离就大。这样，用高磁场强度仪器作图便把谱图拉开了，非常有利于谱图解析工作的开展。化学位移试剂在样品的溶液中增加含有顺磁性的金属络合物。就可以发现各种质子的信号发生不同程度的顺磁性或抗磁性位移。使样品的质子信号发生位移的试剂叫做化学位移试剂。NOE效应NOE是在核磁共振中选择的照射一种质子使其饱和，则与该质子在立体空间位置上接近的另一个或数个质子的信号强度增高的现象。它不但可以找出互相偶合的两个核的关系，还可以反映出不互相偶合，但空间距离较近的两个核间关系。重氢交换活泼氢原子如OH、COOH等的化学位移受多种因素影响，为了鉴定它们，可用重氢交

18、换法。如果待测溶液是非水溶性的，可加入几滴D2O，振荡后静置分层再测定，原有活泼氢的峰消失，而在化学位移4.74.8左右出现HOD的质子吸收峰。如溶液是水溶性的（DMSO-d6），加D2O后产生HOD水峰，可几次用D2O交换除去水峰。浅谈1H-NMR图谱解析14一般由简到繁，先解析和归属容易确定的集团和一级谱，在解析难确认的基团和高级谱。在很多情况下，比较复杂的化合物光靠一张1H-NMR谱图是难以确定结构的，应综合各种测试数据加以解析。必要时有针对性地做一些特殊分析。例如：重氢交换确认活泼氢等及2D-NMR确认指配的基团及基团间的关系等，特别是2D-NMR在新化合物的结构解析中玩玩是必需的。解

19、析谱图步骤：先检查图谱是否合格，即：基线是否平坦；识别“杂质”峰，如溶剂峰等已知分子式则先算出不饱和度根据积分曲线的高度，算出各信号的相对强度，即相当于各种氢核的数目。首先解析CH3O-,CH3N-等孤立的甲基信号，这些甲基均为单峰，然后再接解析有偶合的CH3信号。解释芳氢信号，一般在6.58附近，偶合常数特征性较强，如邻位等偶合关系的确定。若样品中含有-OH或-NH等活泼氢基团，则加几滴重水以后的图与未加前进行比较，解析消失的信号。需注意，有些具有分子内氢键的羟基信号不消失，相反有些CH中1H核信号会消失。解释图中一级谱，找出化学位移和偶合常数，解释各组峰的归属，然后再解释高级谱。合用其他技

20、术。2.2.4 1C-NMR谱：1C-NMR谱化学位移范围宽，对化学环境有微小差异的碳核也能区别，这对鉴定分子结构是极为有利的；驰豫时间长，不同种类的碳原子驰豫时间也相差较大，这样可以通过测定驰豫时间来得到更多的结构信息。1C-NMR的应用在各方面与1H-NMR谱相比毫不逊色，但它也有一些弱点，例如，样品需要量大，累加时间也较长，这对于一些提取困难的微量天然有机化合物来说无疑是不利的。1C-NMR谱提供的结构信息是分子中各种不同类型及化学环境的碳核化学位移，异核偶合常数及驰豫时间，其中利用度最高的是化学位移。常见的1C-NMR测定技术如下15：质子噪声去偶谱质子噪声去偶谱：其测试原理在测定NM

21、R谱时，以一相当宽的频率（包括样品中所有氢核的共振频率）照射样品，由此去除13C和1H之间的全部偶合，使每种碳原子仅出一条共振谱线，此时H的偶合影响全部被消除，简化了图谱，对判断C信号的化学位移十分方便。因照射H后产生NOE现象，连有H的C信号强度增加。季碳信号因不连有H，表现为较弱的峰。偏共振去偶谱质子噪声去偶谱使得13C-NMR谱线简化，增加了大部分谱带的高度，但同时也失去了许多有用的结构信息，不便识别伯、仲等不同类型的碳原子。它的实验方法是采用一个频率范围较小、比质子噪声去偶功率弱的照射场H2，其频率略高于待测样品所有氢核的共振吸收位置使1H和13C之间在一定程度上去偶。采用偏共振去偶，

22、既避免或降低了谱线间的重叠，具有较高的信噪比，又保留了与碳核直接相连的质子的偶合信息。但此法常因各信号的裂分峰相互重叠，对结构比较复杂的中药有效成分，有些信号难以全部识别或解析，远不及下述的DEPT法易于解析。实际上DEPT法已基本完全取代了偏共振去偶谱。DEPT谱确定碳原子级数的常因方法有偏共振技术，DEPT法、INEPT法等。目前应用最多的是DEPT技术。DEPT法主要用于碳原子级数的确定。DEPT谱图有下列三种。DEPT45谱：在这类谱图中除季碳不出峰外，其余的CH3、CH2和CH都出峰，且为正峰。DEPT90谱：在这类谱图中除CH出正峰外，其余的碳均不出峰。DEPT135谱：在这类谱图

23、中CH3和CH出正峰，CH2出负峰，季碳不出峰。实际应用中仅测DEPT90谱和DEPT135谱即可。因为DEPT90谱时，只有CH出峰，可确定叔碳；DEPT135谱时，CH3、CH向上出峰，CH2则向下出峰，由此即可将各个碳原子的级数确定下来。浅谈碳谱解析的一般步骤16计算化合物不饱和度及区分谱图中的杂质峰和溶剂峰。判断碳原子级数,通过DEPT谱判断碳原子级数，并结合化学位移值推导出可能的基团及与其相连的基团。分析化合物结构的对称性，在质子噪声去偶谱中每条谱线都表示某种类型的碳原子，故当谱线数目与分子式中碳原子数目相等时，说明分子没有对称性，而当谱线数目小于分子式中碳原子数目是，则说明分子中有

24、某种对称性，在推测和鉴定化合物分子结构是应加以注意。根据化学位移值确定碳原子类型：饱和碳原子区，化学位移值150等，当然这只是一般的规律，碰到具体问题还需具体分析。譬如，当芳碳原子直接与杂原子相连是，化学位移值可能会大于160综合其他图谱获得更多的结构信息，最后确定结构。2.2.5二维核磁共振谱172D-NMR谱又分为二维J谱和二维相关谱。其中二维相关谱最为重要，下面重点讲解二维相关谱（2D-COSY），2D-COSY谱又分为同核（IH-IHCOSY;2D-INADQUATE）和异核相关谱（主要有HMQC,HMBC）两种。同核位移相关谱IH-IHCOSY：是1H和1H核之间的位移相关谱，是同一

25、个偶合体系中质子之间的偶合相关谱。可以确定质子化学位移以及质子之间的偶合关系和连接顺序。对角线上的峰为一维谱，对角线两边相应的交叉峰与对角线上的峰连成正方形，该正方形对角线上的两峰即表示有偶合相关关系。异核相关谱HMQC谱，此谱能反映1H核和与其直接相连的13C的关联关系，以确定C-H偶合关系。直接相连的13C与1H将在对应的13C和1H化学位移的交点处给出相关信号。由相关信号分别沿两轴画平行线，就可将相连的13C与1H信号予以直接归属。HMBC谱，此谱可将1H核和远程偶合的13C核相关联起来。HMBC可以高灵敏度地检测碳-氢远程偶合通过23个键的质子与季碳的偶合也有相关峰。从HMBC谱中可得

26、到有关碳链骨架的连接信息、有关季碳的结构信息及因杂原子存在而被切断的偶合系统之间的结构信息。2.2.6质谱在鉴定有机物的四大重要手段（NMR、MS、IR、UV）中，质谱是唯一可以用来确定分子式的方法。20世纪80年代以后相继发展的新的质谱技术，如快原子轰击电离谱、电喷雾电离源，大气压化学电离源，使质谱在确定化合物分子量、元素组成和由裂解碎片检测官能团、辨认化合物类型推导碳骨架等方面发挥着重要作用。以下主要对新的离子源的电离方式及相应的特点。电喷雾电离（ESI）18ESI是近年来出现的一种新的电离方式。电喷雾离子源属于一种软电离源,能使大质量的有机分子生成带多电荷的离子,通常认为电喷雾可以用两种

27、机制来解释。 （1）小分子带电残基机制：在喷针针头与施加电压的电极之间形成强电场,该电场使液体电离,带电的溶液在电场的作用下向带相反电荷的电极运动,并形成带电的液滴,由于小雾滴的分散，比表面增大，在电场中迅速蒸发,结果使带电雾滴表面单位面积的场强极高，从而产生液滴的“爆裂”重复此过程，最终产生分子离子。 （2）大分子离子蒸发机制：首先也是电场使溶液带电，结果形成带电雾滴&带电的雾滴在电场作用下运动并迅速去溶，溶液中分子所带电荷在去溶时被保留在分子上，结果形成离子化的分子。 一般来讲,电喷雾方法适合使溶液中的分子带电而离子化。离子蒸发机制是主要的电喷雾过程,但对质量大的分子化合物,带电残基的机制

28、也会起相当重要的作用。电喷雾也可测定中性分子,它是利用溶液中带电的阳离子或阴离子吸附在中性分子的极性基团上而产生分子离子。大气压化学电离源 (APCI)19溶液在气流作用下形成气溶胶，蒸发，电晕放电使溶剂电离，电子转移或电子捕获，使样品带电。 软电离技术，产生分子离子峰。 适合分析易挥发、热稳定、低极性和半极性的小分子化合物。 主要是分析中等极性以上的化合物，可用于分析药物及代谢产物的分析等。浅谈质谱的解析程序20一、解析分子离子区由质谱的高质量端确认分子离子峰，定出样品的分子量，根据分子离子的质量的奇偶数，判断有无氮原子存在。如测定的是高分辨质谱图，可根据分子离子峰的高分辨数据，推测化合物的

29、可能组成。根据分子离子峰的相对强度了解分子结构的信息：分子离子峰的相对强度由分子的结构所决定，从分子离子的稳定性，可了解分子结构的类型。对于分子量约200的化合物，若分子离子峰为基峰或强峰，谱图中碎片离子较少，表明该化合物是高稳定性分子，可能为芳烃或稠环化合物。由高分辨质谱仪测得的精确分子量或由同位素峰的相对强度计算分子式并计算不饱和度，确定化合物中环和双键的数目，提出化合物的可能结构。分析同位素离子峰的相对强度比，判断化合物是否含有CL、Br等元素。二、解析碎片离子由特征离子峰及丢失的中性碎片了解可能的结构信息：特征离子有明确的来历，只有特定的化合物、基团或特定的原子排列次序才能产生，可给出

30、明确的结构信息。在质谱图中，高质量端离子一般是通过分子离子失去某些小基团或中性分子产生的碎片峰。研究低质量端离子峰，寻找不同化合物断裂后生成的特征离子和特征离子系列。综合分析以上得到的全部信息，结合分子式及不饱和度，提出化合物的结构单元。再根据化合物的分子量、分子式、样品来源、物理化学性质等，提出一种或几种最可能的结构。分析所推导的可能结构的裂解机理，看其是否与质谱图相符，确定其结构，并进一步解释质谱，或与标准谱图比较，或与其他谱结合，确认结构。3结论波谱法已成为研究天然药物化学成分结构的一种重要的和主要的手段。各种波谱法各有特点和长处，对于比较复杂的有机化合物结构的鉴定，需要综合各种波谱数据

31、，并将必要的物理，化学性质结合起来，彼此补充，进行综合解析，才能最终确证化合物的化学结构和构型。相信未来在各种新旧方法的综合运用上，单体化合物的结构鉴定将进一步得到发展。参考文献1 贝琦华，陈英.药品熔点测定中的影响因素分析J. 今日药学.2009,9(19):7-8.2 贝琦华，陈英.不同传温介质熔点测定的应用与比较J. 中国药师.2010,13(1):152-153.3 余志立,高丽梅, 山广志，等 计算化合物分子式的五种方法J. 质谱学报. 2004,25(2):18-19.4 梅林,石开云,苏建华,等.青蒿素国内研究进展J. 激光杂志. 2008,29(3):89-92.5 宁永成.有机化合物结构鉴定与有机波谱学M.北京：科学出版社，2001:45-46.6 姚新生.有机化合物波谱分析M.北京：中国医药科技出版社，2004:75-76.7 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:一部附录VII S. 北京:化学工业出版社, 2005: 386.8 刘金权.影响熔点测定结果的因素J. 卫生职业教育. 2005,23,(12):45-46.9 王雅珍 张国华. 谈如何提高熔点测定实验的精度和效度J. 化学教育. 2005,26(12):12-14.10 Dudley H.有机化学中的光谱方法M