原位核酸分子杂交技术.docx

1、原位核酸分子杂交技术原位核酸分子杂交技术原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。原位杂交技术已应用于基础研究如基

2、因组图(Gene mapping),转基因检测,基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相

3、信在不久的将来,原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。第一节 原位核酸分子杂交技术的发展原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，BuongiornoNardelli和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。Orth(1970)应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对

4、人体有害，且受半衰期限制等特点，因此研究用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交，引起了许多学者的重视和探索。Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer(1982)报道用2，4二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶标抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶组织化学的方法显示杂交信号。Brigat(1983)首先建立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位，生物素标记探针技术目前已被广泛

5、应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。Boeringer Mannhem Biochemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场，和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶显色系统)，有较好的反差背景，更有利于与免疫组织化学相结合，同时可以检测基因表达。核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核甘酸探针等。DNA探针还有单链DNA(S

6、ingle stranded,ssDNA)和双链DNA(Double stranded,dsDNA)之分。所以原位杂交可分为DNADNA，cDNARNA,RNARNA和寡核苷酸探针与DNA或RNA等杂交方式。原位杂交技术在生命科学的研究中可视为一顶革命性的技术。它使我们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展.。第二节 原位分子杂交技术的基本方法 原位杂交技术的基本方法包括：杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；杂交；杂交后处理；显示(visualization)：包括放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组

7、织化学显色。(一)固定原位杂交固定的目的是为了保持细胞形态结构，最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA更易被酶降解，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。1最常用多聚甲醛固定组织，因其不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，不会影响探针穿透入细胞或组织。2醋酸酒精的混合液和Bouins固定剂也能获得较满意的效果。3mRNA的定位将组织固定于4%多聚甲醛磷酸

8、缓冲液中12 h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。4组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10 min，空气干燥后保存在-70。如冰箱温度恒定，在-70切片可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材时多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交联的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获满意效果。各种固定剂均有各自的优缺点，如

9、沉淀性(Precipitating)固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouins液、Carnoys液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存RNA，而且对组织结构有损伤。戊二醛较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交联，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。(二)玻片和组织切片的处理1玻片的处理玻片包括盖片和载玻片应用热肥皂水刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24 h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24 h后蒸馏水冲洗、烘干、烘箱温度最好在150或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，

10、干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的粘附剂有铬矾明胶液，其优点是价廉易得，粘附效果较差。多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价格昂贵。一种新的粘附剂APES粘附效果好，价格较多聚赖氨酸便宜，制片后可长期保存应用。2增强组织的通透性和核酸探针的穿透性增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂(detergent)或称清洗剂Triton X100、酒精或某些消化酶如蛋白酶K，胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。这种广泛的去蛋白作用无凝可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存量和影响组织结构的形态，因此，

11、在用量及孵育时间上应填为掌握。蛋白酶K(Proteinase K)的消化作用的浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用蛋白酶K 1g/ml(于01 mol/L Tris/50 mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中)，37孵育1520 min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂，常用01 mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以终止蛋白酶K的消化作用，Burns等(1987)报道应用胃蛋白酶(Pepsin)20100 g/ml(用01 N HCl配)37、

12、30 min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。3减低背景染色背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后(Posthybridization)的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐(acetic anhydride)和三乙醇胺(triethanolamine)中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。预杂交(Prehybridizaiton)是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，

13、从而减低背景染色。在杂交后洗涤中采用低浓度的RNA酶溶液(20 g/ml)洗涤一次，以减低残留的内源性的RNA酶，减低背景染色。4防止RNA酶的污染由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温(240)烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必需在150左右。(三)杂交(Hybridsation)杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，或采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片，加盖片防止孵育过程中杂交液的蒸发。在盖玻片周围加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。硅化的盖玻片的优

14、点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻片自身有一定重量能使有限的杂交液均匀覆盖。可将复有硅化盖玻片进行杂交的载玻片放在盛有少量5SSC或2SSC(standard saline citrate,SSC)溶液的湿盒中进行孵育。(四)杂交后处理(Post hybridisation treatment)杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。特别因为大多数的原位杂交实验是在低严格度条件下进行的，非特异性的探针片段粘附在组织切片上，从而增强了背景染色。RNA探针杂交时产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗

15、中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。(五)显示(Visualization)显示又可称为检测系统(Detection system)。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射自显影可利用人工或计算机辅助的图象分析检测仪(computerassisted image analysis)检测银粒的数量和分布的差异。非放射

16、性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或图象分析仪对不同类型数量的核酸显色强度进行检测。但做半定量测定必须注意严格控制实验的同一条件，切片的厚度和核酸的保存量如取材至固定的间隔时间等。如为放射自显影，核乳胶膜的厚度与稀释度等必须保持一致。(六)对照实验和结果的判断对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定，常用的对照试验有下列几种。1将cDNA或cRNA探针进行预杂交(吸收试验)。2与非特异性(载体)序列和不相关探针杂交(置换试验)。3将切片应用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交。应用同义RNA探针(Sense probe)进行杂交。4以

17、不加核酸探针杂交液进行杂交(空白试验)。5组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。6应用未标记探针做杂交进行对照。第三节 原位DNA和DNA分子杂交方法DNA探针在病毒的检测等领域中得到广泛的应用。杂交时需先在高温8095短时处理，使DNA探针及细胞内靶DNA变性，解离成单链，迅速置于冰上冷却。然后置于3742杂交过夜。(一)地高辛(Dig)标记DNA探针在石蜡切片检测病毒DNA的方法1组织切片的预处理(1)固定：组织以10%中性福尔马林液或Bouins液固定，常规石蜡包埋，切片厚46 m，粘附于涂有粘附剂的玻片上，入烤箱6080 68 h，使切片更紧粘贴于玻片。(2)脱蜡：二甲苯10

18、 min2,自100%乙醇和， 95%，90%，70%，50%，30%各5 min。入PBS(含5 mmol/L MgCl2,pH7374) 5 min2。(3)入02 mmol/L HCl 20 min以去除蛋白。(4)50 2SSC,含5 mmol/L EDTA溶液中30 min。(5)蛋白酶K(1 g/ml溶于01 mol/L PBS中)，37 2025 min。(6)02 mol/L甘氨酸液：室温10 min,中止蛋白酶反应。(7)4%多聚甲醛(PBS新鲜配制),室温20 min。(8)PBS/5 mmol/L MgCl2漂洗10 min2。(9)脱水，自低浓度到高浓度至无水乙醇各3

19、min，空气干燥。2预杂交封闭非特异性杂交位点，加预杂交液20 l/每张切片，42水浴半小时。3杂交加杂交液1020 l/每张切片，加盖硅化盖片，将切片置于95 10 min，使探针及病毒DNA变性，然后迅速置于冰上1 min，再将切片置于盛有2SSC湿盒内，42过夜(1618 h)。4杂交后漂洗(1)2SSC液内振动移除盖片。(2)2SSC 55 10 min2。(3)05SSC 50 5 min2。(4)缓冲液(含05%封阻试剂，用缓冲液溶解)37 30 min。(5)缓冲液(100 mmol/L TrisHCl,150 mmol/L NaCl pH75)15 min,室温。(6)酶标地高

20、辛抗体(15 000，应用缓冲液解释)37 30 min。(7)缓冲液 15 min2，室温。(8)缓冲液(100 mmol/L TrisHCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH95)室温，2 min。5显色(1)显色液配制：在缓冲液 1 ml中加入45 l四氮唑蓝(NBT)，35 l X磷酸盐(5溴4氯3吲哚磷酸盐(BCIP)配成。30 l/每张切片，置暗处显色(30 min到2 h。定时抽查切片，镜检其显色情况。(2)缓冲液(10 mmol/L TrisHCl,1 mmol/L EDTA,pH80) 10 min终止反应，用核固红或甲绿复染5 min，二

21、甲苯透明，DPX封固，镜检。6结果杂交阳性信号呈紫兰色，细胞核呈红或绿色。(二)生物素标记HPVDNA探针在石蜡切片上检测HPVDNA的方法。1玻片的预处理组织细胞原位核酸杂交主要在载玻片上进行，因此玻片的处理至关重要。载玻片(或盖玻片)一般要经过1 mmol/L HCl溶液或重铬酸钾硫酸溶液的浸泡，取出后充分用自来水冲洗，用双蒸水洗三遍，然后置于60烤箱中烤干。将烤干的玻片分别插在染色架中，置250烤箱中烘烤4 h，目的是去除玻片上残留的核酸酶。为了防止组织或细胞在杂交过程中脱落，原位核酸杂交所需的玻片必需进行硅化处理。把经过250烘烤过的玻片用2% 3氨丙基三乙氧基硅烷(APES)丙酮液处

22、理玻片，有助于组织和载玻片的粘附。APES对甲醛固定的组织粘附效果好，可使组织与载玻片发生共价结合。玻片硅化方法：(1)室温下将高温处理过的载玻片用2% APES丙酮液浸泡3 min；(2)用丙酮洗去多余的APES；(3)用DEPC处理的蒸馏水或高压消毒的蒸馏水清洗玻片12次；(4)40烤干玻片，防污保存在干燥器皿中待用。整个处理过程均要戴消毒手套进行操作。2组织切片常用的原位杂交标本有石蜡切片、冰冻切片和细胞培养标本。无论是哪一类的标本，在制备时都要尽量避免RNase污染。操作时要戴手套，要用75%的酒精擦洗工作面和切片刀、镊子等。石蜡切片时，展片要用高压消毒处理过的蒸馏水，裱片后把切片置6

23、0烤箱中烤片13 h。置室温下保存备用。新鲜组织切片最好先用固定剂固定(如用4%多聚甲醛或冷丙酮固定10 min)，吹干后-70保存或在70%酒精中4保存，培养细胞标本的处理方法与冰冻切片法相似。3杂交前处理目的在于提高组织的通透性,以防止DNA探针与细胞、组织之间的非特异结合，以增强杂交信号,减少背景着色。(1)脱蜡石蜡切片必需充分脱蜡,因为石蜡未脱净会影响探针的穿透力,因而脱蜡用的二甲苯尽可能新鲜。常规石蜡切片用二甲苯脱蜡3次,每次5 min;脱蜡后用逐级梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)清洗,然后用蒸馏水洗3 min,必须用高压处理过的蒸馏水。(2)蛋白酶处理 蛋白酶的

24、消化能使固定后被遮掩的靶核酸暴露,以增加探针与靶核酸结合的机会。常用的蛋白酶有蛋白酶K(proteinase K)、链霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin)、蛋白酶BP等。蛋白酶的浓度及消化时间,视组织种类、固定类型、切片厚度而定,一般使用1 g/ml蛋白酶K(用含50 mmol/L EDTA的pH80,01 mol/L TrisHCl缓冲液配制),也可用001%蛋白酶BP(用pH80 PE配制)37孵育1030 min。蛋白酶具有消化包围靶DNA的蛋白质的作用,促进探针渗透,从而提高杂交信号。但过度的蛋白酶消化会引起细胞形态结构的破坏及靶核酸的减少,也会导致标本从载玻片上的脱落

25、。4杂交反应(1)变性和杂交进行杂交反应时,探针和靶核酸都必须是单链。如果用双链cDNA探针检测,则探针和靶核酸都必须先解链,也就是变性。将生物素标记的双链探针杂交液滴在待检组织上,然后加盖经250高温处理过的盖玻片,勿产生气泡,并在盖玻片周边用石蜡油封边(目的是防止探针和杂交液在杂交过程中蒸发),将含有探针的载玻片放入已经加热煮沸(95100)的水浴箱的密封盒中(容器底部预先加入适量的蒸馏水)变性510 min。探针和靶DNA同时变性,变性的单链探针与靶DNA随即进行杂交反应。如果用单链探针与靶DNA进行杂交,虽然探针本身并不需要变性,但也可将探针加在组织标本上,用上述方法使靶DNA变性。变

26、性完毕将切片放在冰块上迅速降温12 min,然后将切片移入湿盒内置37培养箱杂交60 min。如有条件也可用原位杂交仪进行变性和杂交,先调整好原位杂交仪的变性、杂交时间和温度,将玻片放入杂交仪内进行变性杂交,当杂交仪升温至95时即可进行变性,变性后温度迅速下降到37时即可进行杂交反应。(2)杂交后漂洗其目的是去除未参与杂交体形成的过剩探针,消除与组织或细胞之间的非特异性结合的探针,降低背景染色,增加信/噪比。将杂交玻片从湿盒(或杂交仪)中取出,用2SSC将盖玻片洗脱,2SSC 30洗2次,每次15 min;1SSC 42洗2次,每次15 min;05SSC 37洗2次,每次15 min,TBS

27、缓冲液洗2次。注意在漂洗过程中切不要使切片干燥。(3)杂交信号的检测探针与靶核苷酸结合形成杂交体,对其检测的方法因探针的标记物不同而异,一般与免疫组化方法类似,当带有酶的抗半抗原抗体(或者抗生物素蛋白)通过搭桥(或直接)与探针连接后,催化底物混合液中的底物发生反应,使其产生有色沉淀物即为阳性反应。现在大多数的研究都是采用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶与抗半抗原抗体(或抗生物素蛋白)连接进行检测。在切片组织上滴加碱性磷酸酶标记的链菌素(streptavidin alkaline phosphatase conjugated)溶液,室温孵育2040 min,TBS缓冲液洗3次5 min,加入BCIP/

28、NBT室温暗处显色1030 min,TBS缓冲液洗,01%核固红复染切片5 min,蒸馏水冲洗,酒精脱水,中性树胶封片。(4)杂交结果DNA原位核酸分子杂交阳性反应为靶基因存在的部位,一般在细胞核内,呈紫蓝色颗粒状,若靶基因数量多或显色时间长,则整个细胞核呈浓染蓝色,阴性细胞核呈红色。(5)对照试验阳性对照:用已知含靶核酸序列的组织作对照。阴性对照:用已知不含待测靶核酸序列的组织作对照。用免疫组化检测方法来确定杂交信号的分布。省略标记探针。DNA酶消化靶DNA对照。HJ1(6)非特异性染色非特异性染色可能会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等;探针特异性不高以及组织细胞内某些成分与显示

29、系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色。组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因,目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶,这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应步骤。如过氧化物酶用3% H2O2处理510 min;10%冰醋酸处理组切片10 min,或在底物显色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。NBT/BCIP显示碱性磷酸酶时如果在光照下显色也会增强非特异性染色。必须根据检测系统不同的标记酶作不同的内源酶处理。第四节 RNA原位核酸杂交方法一、基本原理RNA原位核酸杂交(RNA nucleic acid hybridi

30、zation in situ)又称RNA原位杂交组织化学(RNA in situ hybridization histochemistry)或RNA原位杂交6,7,25 (RNA in situ hybridization RISH)。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内 RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。R

31、NA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。RNA原位杂交不同于DNA原位杂交主要有：(1)使用的探针不同：RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针，因此避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。cRNA-RNA之间形成的杂交体要比DNA-DNA、cDNA-RNA杂交体性能稳定，在杂交反应后可用RNA酶洗脱，以除去未结合的探针，因此特异性更强。(2)检测的目的不同：RNA原位杂交检测和分析的主要为内源性基因，包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态、探索疾病发病机理、观察治疗的疗