顶空气相色谱法.docx

1、顶空气相色谱法顶空气相色谱法顶空气相色谱法(HS-GC)又称液上气相色谱分析，它采用气体进样，可专一性收集样品中的易挥发性成分，与液-液萃取和固相萃取相比既可避免在除去溶剂时引起挥发物的损失，又可降低共提物引起的噪音，具更高灵敏度和分析速度，对分析人员和环境危害小，操作简便，是一种符合“绿色分析化学”要求的分析手段。顶空分析方法随气相色谱分析方法的发展在不断更新和发展，现代顶空分析法已形成一个相对较为完善的分析体系。主要分为静态顶空分析、动态顶空分析、顶空-固相微萃取三类。简述顶空气相色谱原理和应用顶空气相色谱法（HS-GC）是在气相色谱仪进样口前面增加一个顶空进样装置的一种色谱技术，常解释为

2、将顶空装置与气相色谱仪联用的仪器。它利用被测样品（气-液和气-固）加热平衡后，取其挥发气体部分进入气相色谱仪。它专用于分析易挥发的微量成分，如对甲醇、乙醇等许多易挥发的有机溶剂类，不同季节的花香气、香水类，带有易挥发成分的中草药类，特殊气味的蔬菜和调味品类等均可用它进行定量分析。顶空气相色谱与质谱联用法（HS-GC-MS）用于对未知的挥发成分进行定性分析的方法。顶空气相色谱法常用于酒后开车司机或行人发生交通事故后对其血液中酒精进行定性定量确证分析、中西医药投入市场前其残留溶剂的标准分析、刑事案件中有毒气体和挥发性毒物的认定分析等，另外许多行业需要控制产品质量或开发新产品等均会用到这种仪器。这种

3、分析方法可避免水份、高沸点物或非挥发性物质对分析柱造成超载和污染问题。而且操作简单、快速，分析结果与气相色谱一样灵敏、可靠、准确。顶空气相色谱系列讲座（2） 血中酒精的顶空色谱分析法研究血中酒精浓度的分析方法，对解决酒后开车、酗酒肇事、酒中投毒等刑事案件中的法律责任问题十分重要。如果因交通事故或中毒死亡后无法取到合格的检材心血或静脉血时，本方法也适用取用其他体液或脏器进行分析，乘以比例系数，换算为血中的酒精量。样品配制： 标准样品 含内标的乙醇溶液用0.9%生理盐水配制0.4%乙醇和0.2%特丁醇（内标） 内标溶液用0.9%生理盐水配制0.2%特丁醇（内标） 混合标样用0.9%生理盐水配制甲醇

4、、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇和特丁醇七种醇各0.7% 对照样品 阴性对照样取0.5g或0.5mL空白脏器或体液，加0.50mL内样溶液 血中阳性对照样取0.5mL空白血（血站购得，用前需检查不含乙醇），加0.50mL含内标的乙醇溶液 水中阳性对照样取0.5mL蒸馏水，加0.50mL含内标的乙醇溶液 肝中阳性对照样取0.5g空白肝（可用猪肝代替）加0.50mL含内标的乙醇溶液 待测样品准确取0.500mL死者心血（活者静脉血）0.500g死者肝，各加0.50mL内标溶液。或准确取0.100mL被检血，加0.9%生理盐水0.4mL，再加0.50mL内标溶液。顶空色谱分析系列讲座（3） 介绍血

5、中酒精顶空色谱分析条件实验，分别对色谱柱、柱温、样品温度、样品加温时间、进样增压时间、和载气流速等色谱参数进须行筛选结果： 多种单一固定相填充柱和毛细柱均适合醇类顶空色谱分析，选极性大的固定相比较好，如Porapak Q 6080M（2m2mm）、Tenax 6080M（3m2mm）、2%FFAP（4m2mm）、FFAP（30m0.32mm）、SE-54或OV-17（25m0.25mm）等柱 使用不同柱子 , 操作参数稍有不同，下面条件范围用内标来分析醇类效果很好柱温：填充柱在100160，毛细柱在4060柱前压：填充柱在270350kpa，毛细柱在150180kpa样品预加热温：均在7080

6、，样品增压时间：只需14min，根据样品性质确定操作过程固定不变值。样品加温时间：一般选用1520min 其检测器的选择，与气相色谱要求一致，要根据被测样品的成分来决定，如只含C、H、O的挥发化合物选用HS-GC-FID；当还含有其它元素时，含卤素等选用HS-GC-ECD；含N元素选用HS-GC-NPD；含S元素选用HS-GC-FPD（S型）等l 用上述条件测定七种醇回收率结果如下表：七种醇回收率% （n = 5）醇类名称 水中 肝中 标准偏差l/mL 变异系数%甲醇 99.7 77.6 乙醇 99.8 82.8 0.032 1.68异丙醇 99.3 85.4特丁醇（内标）99.8 81.7丙

7、醇 99.4 83.6异丁醇 99.6 87.2丁醇 99.6 84.1l 以上顶空气相色谱条件将柱温改为慢速程序升温的方法，将可测许多挥发性的化合物，如花香气、调味品、化妆品等。用毛细柱进行分析时，起始温50，保留2min后，以5/min升至150以上即可顶空色谱分析系列讲座（4） 用本方法分析交通事故中肇事者或受害者的血液中乙醇含量时，需了解并注意以下几个问题，以利于测试准确可靠 ：l 必须使用内标（特丁醇）分析方法。与一般分析方法相比顶空色谱分析选择合适内标更为重要，对分析结果准确影响也更大。l 血中乙醇含量通常称血醇含量，血醇含量的单位表示有三种：含义 单位 每毫升血中含多少毫克乙醇

8、mg/mL每100毫升血中含多少毫克乙醇 mg%每100毫升血中含多少克乙醇 %通常鉴定报告中使用后两种单位表示，例如，使用系列讲座（3）条件，测得交通事故中司机血醇含量为每毫升血含1.10毫克乙醇，其三种单位表示为：1.10mg/mL 110mg% 0.11%.l 正规鉴定报告中的测得值是具有法律作用的一组准确数据，用来判断司机是酒后开车还是醉酒开车的重要依据，因血醇量不同其生理反应明显不相同见下表 血中酒精浓度与醉酒程度 血醇浓度（mg%） 酒后症状0.9g/mL即达致死浓度。研究了生物体内苯类化合物的顶空色谱法的测试条件、回收率、线性关系、检测限、等。水中回收率能达90%，肝中回收率能达

9、80%，内标定量的变异系数(CV%)0.2-2.6，标准偏差(g/mL)0.55-2.4，检测限分别为：苯2g/mL、甲苯10g/mL、二甲苯30g/mL。仪器sigma2B色谱仪，HS-6型顶空装置（美国PE公司），CR-3A微处理机（日本岛律）.样品制备标准溶液（V/V）： 苯类标准液-苯:甲苯:二甲苯:乙苯（内标）= (0.6:1:3:4.6); 内标溶液-乙苯:己烷 =（2:100）； 苯类标准溶液稀释液-苯类标准溶液:己烷 =1:25。对照样品： 阴性对照样-称0.5g（mL）空白脏器（肝或血等）加25L己烷,再加0.5mL盐水溶液（0.9%生理盐水）； 肝中阳性对照样-称取空白肝组

10、织0.5g，加0.5mL生理盐水溶液，再加25L苯类标准溶液稀释液； 水中阳性对照样-取苯类标准溶液稀释液25L，加1.0mL生理盐水溶液.待测样品：准确称取0.500g（mL）死者脏器(肝、血等)或动物中毒兔脏器， 加25L内标溶液，再加0.5mL生理盐水溶液。顶空气相色谱系列讲座（6） 苯类化合物的顶空色谱分析(6)顶空色谱分析的条件实验l 色谱条件：选用毛细柱有利将邻、对、间二甲苯得到完全分离，中等偏弱极性的毛细色谱柱均可用，极性不同程序升温也要相应改变。如SE-54(25m0.25mm0.25m)；柱温70保持3min，以5/min升至100，保留2min；进样口温120；检测器温（G

11、C/FID）180；载气（N2）97kpa；燃气（H2）138kpa；助燃气（空气）207kpa；样品温80，样品保温平衡时间2025min ，进样增压时间5s，柱分流比为10:1l 回收率测定：取25L苯类标准稀释液两份，一份加1.0mL生理盐水即0.9%医用盐水，（做水中回收率），另一份加0.5mL生理盐水和0.5g空白肝组织（做肝中回收率）苯类化合物的回收率表峰号 化合物名称 回收率 标准偏差 变异系数水中 肝中 L/mL %2 苯 91 88 2.4 1.13 甲苯 96 93 4.9 2.24 乙苯（内标） - - - -5 间二甲苯 94 91 0.55 0.26 对二甲苯 95

12、93 0.75 0.51 7 邻二甲苯 102 100 5.85 2.6l 线性范围和相关系数：分别取苯类标准稀释液5、10、20、25、50L五份，各加1mL生理盐水，在相同前述条件下进行顶空色谱分析，苯、甲苯、乙苯（内标）、二甲苯测得结果见图，本实验定量检测限（g/mL）苯为2、甲苯为10、二甲苯为30.。l 盐效应筛选：取苯类标准稀释液6份，每份25L，分别加入1mL各5%NaCl、CuSO4、K2CO3、KAl(SO4)2、NaAc和生理盐水，用内标计算结果KAl(SO4)2溶液使苯系列的活度系数相对增加较大，但考虑增加值相差不多，而生理盐水的得到、使用、纯度也合要求又方便，我们更喜欢

13、用0.9% NaCl生理盐水。l 保温时间对响应的影响：取苯类标准稀释液25L共七份，各添加1mL生理盐水，在样品温度80下，分别保温时间为10、20、30、40、50、70min和480min，然后进样内标计算结果2030min为好，保温480min之久的样品，有许多组分已测不出来了。l 同时做了二只体重2kg白兔实验，使其空腹16h后，灌服苯类混合标准溶液（苯:甲苯:二甲苯=5:10:15）30mL，10min后大小便失禁，30min内再无其他症状变化，以后出现呼吸急促发颤，6h后击脑处死，立即解剖进行分析，结果各脏器含量递减顺序如下：苯胃内容胃血肝脑肺肠内容肾膀胱眼液心胆腹肌肉腿肌肉大肠

14、脾； 甲苯胃内容肠内容胃脑肝肾膀胱小肠心胆大肠腹肌肉眼液腿肌肉脾二甲苯胃内容肠内容胃脑肝膀胱小肠肾大肠心胆腹肌肉 顶空气相色谱系列讲座（7）五种低碳卤代烃的顶空色谱分析 低碳卤代烃是化学工业的重要产品，又是工业生产上的原材料，也是实验室常用有机试剂。低碳卤代烃中毒死亡案时有发生，生产厂家的污水未经处理直接排入河流造成渔民、鱼鹰死亡，车间空气污染造成工人中毒等。本文通过动物试验，和案例对所建立的顶空色谱分析方法进行阐述。 仪器和试剂SIGMA 2B 气相色谱仪HS-6型顶空进样装置(以上为美国P-E公司产品)CR-3A微处理机(日本岛津公司产品)全部试剂均为分析纯(天津化学试剂二厂生产) 顶空色

15、谱条件进样口温度 100，FID温度 150，毛细柱SE-54 25m0.25mm，柱温度 70， 样品温度 80，样品保温时间 20-25min，进样增压时间 5sec， 分流比 10:1，N2 124 KPa，H2 138KPa，Air 207kpa。 样品制备 标准样品(V/V)浓混合标准液 CH2Cl2：CCl4：CHCl3：C2H4Cl2：C2HCl3= 0.5：1.5：1：0.5 ：1.5内标溶液 C2H4Cl2：CH3OH = 0.4：100稀混合标准液 浓混合标准液：甲醇 = 1：25 对照样品阴性对照样 0.5g空白脏器(肝)加25ml甲醇，再加 0.5ml生理盐水。阳性对照

16、样 0.5g空白脏器(肝)加25ml稀混合标准液，再加 0.5ml 生理盐水 待测样品准确称取0.500g（mL）中毒死亡兔各脏器(包括体液)，各加25ml内标溶液，再各加 0.5ml 生理盐水。 回收率的测定称取0.5g空白肝，加0.5ml 生理盐水，再加25ml稀混合标准液，混匀后做肝中回收率(n=4) (图1)，数据见下表：顶空气相色谱系列讲座（8） 五种低碳卤代烃的顶空色谱分析（8）5 线性关系、检测限的测定分别取稀混合标准液0.2、0.4、0.8、1.0、2.0ml，各加生理盐水溶液至 1ml，以C2H4Cl2为内标测得曲线图很满意。检测限分别为CH2Cl2 1mg/ml， CHCl

17、3 1.5mg/ml，CCl4 20mg/ml，C2HCl3 20mg/ml。6 动物实验2kg的灰兔空腹16小时后，灌服混合卤代烃(CH2Cl2： CHCl3：C2H4Cl2：C2HCl3 =5：5：5：10)约25ml，5分钟后灰兔侧卧倒下，10分钟后嚎叫急喘，30分钟后喘粗气流涎，约1小时后死亡。立即解剖以CCl4为内标，测试各脏器各卤代烃的含量分布如 下：7 讨论l 以上八讲共介绍了十多种有机溶剂的顶空色谱分析方法。与一般色谱法相比，省去了繁琐的样品处理手续，避免了因样品处理引入对被测成分的干扰及对柱子的污染。这是一种用于分析易挥发成分的有效方法。具有简单、快速、灵敏、可靠的优点。 l

18、 测试顶空色谱的标准曲线必须使用同一时间配制的不同浓度的系列样品。对已配好装入密封顶空瓶内的样品，在低温冰箱内储存不能超过7天。尤其对混合组分其蒸气压相差较大的样品，要随配随做。l 本方法误差主要来自配制样品时所选择的溶剂、样品平衡时间的长短、添加内标浓度大小匹配实测样品成分浓度、以及空白脏器有吸附作用的差别影响回收率。应选择能完全溶解被测成分的溶剂，测出较合适的恒温平衡时间，添加内标浓度准确性，增加顶空瓶内载气（N2）压力，调节增压时间，使不同黏度的气态化合物混合均匀，以获得分析结果的良好重现性。l 顶空色谱法对内标物选择十分重要，除一般色谱定量分析对内标物的要求外，还应注意对单一成分样品要

19、求内标物的蒸气压接近样品组分的蒸气压；对混合组分样品要求内标物蒸气压接近样品混合成分的中间值，或选多个内标物的分析方法。l 由于液面上的浓度通常很低，为防止对含量很低的挥发组分漏检，可以通过增加样品温度，加大瓶内载气压力，用盐效应增加活度系数和用选择性高的检测器等来提高灵敏度。目前的样品前处理用来富集痕量成分的方法有：用固相微萃取、吸附浓缩/电热脱附、固相抽提等本文阐述的顶空色谱检验方法，已实用于办理刑事案件。顶空气相色谱系列讲座（9） 介绍一种土法顶空色谱定量分析生物样品中的乙醇方法（9）当本单位的顶空进样器出了毛病或暂没有顶空进样器的时候，为应急使用土法顶空，即无全自动顶空进样器，采用人工

20、控制、手动进样也能解决实际分析挥发成分的需要。举一案例来说明1998年年底河北省某村肖小宝与本村吕某打架，双方均有小伤，吕生急时操起猎枪将肖打死，现需排除两人是否酒后斗欧。一、仪器和设备仪器HP5890 GC/FID 和岛律QP5000 GC/MS，无顶空进样器设备进样前样品处理使用的主要设备顶空气相色谱系列讲座（10） 介绍一种土法顶空色谱分析方法-2上面（9）中将土法顶空色谱分析方法常用的设备拍成照片，图-1样品瓶有两种体积（9mL,12mL），根据样品用量不同选用；图-2密封钳（红色为封瓶口钳，黑色为开瓶口钳）；图-3取样器（从50L1000L）能准确吸取液体样品的重要工具；图-4加热块

21、（俯视和正视可调温度加热块图，用来加热样品瓶）。一般用1025L注射器抽取液上气体进样。二、试剂和样品 标准样品 含内标的乙醇溶液：用0.9%生理盐水配制0.4%乙醇和0.2%特丁醇（内标）；内标溶液：用0.9%生理盐水配制0.2%特丁醇（内标）；混合标样：用0.9%生理盐水配制甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇和特丁醇七种醇各0.7%。 被测样品 提取死者肖小宝心血和胃内容各5mL 吕某的静脉血各4mL，密封、冰冻保存立即送检三、条件和图谱 色谱条件柱温：填充柱在100160，毛细柱在4060。柱前压：填充柱在270350kpa，毛细柱在150180kpa。样品瓶加热温度：均在7585。

22、样品瓶加温平衡时间：一般选用2025min。 结果图谱四、结果和讨论 加有内标（特丁醇）含乙醇样品的定量分析，在数据处理条件设置合适情况下（如在含量低时，内设值峰宽不能用5而应改为2、最小面积相应改为100，不能设为500等），实践证明，采用土法顶空进样分析结果一样准确可靠，保留了顶空色谱分析方法的全部优点。 样品加热平衡时间长点好，一般设为20min-25min，边加热边小振摇，有利乙醇的挥发。注射器在使用之前也需预热，并用被测样品瓶中气体洗涤饱和后方可进样。 当顶空进样器坏了或分析不准确时，也有采用三氯乙酸沉淀蛋白，高速离心后，直接将上清液进样，这是一种要求在高温下进样，对柱子的污染会少点

23、，但容易造成分离不彻底，计算不准确的后果。 土法顶空进样与顶空进样器进样主要不同在加热块升温、样品瓶加热和振摇、抽取液上气体和注入色谱仪进样口等，全过程均为人工控制，手动完成，与顶空进样器全过程是自动化不同，容易造成重现性差。如内标物选择适当，操作误差不影响分析结果，但同一时间内平行操作十分重要。 土法顶空进样需用注射针，一般使用10-25L或1.0mL体积，在进样前需将注射针先预热，用被测液上气相抽洗或饱和注射针，然后抽取所需体积的气体注入气相色谱进样口，全部操作在相同条件下进行。顶空气相色谱系列讲座（11） 石油液化气和天然气的HS/GC/FID和HS/GC/MS检验利用液化气和天然气自杀

24、和他杀的刑事案时有发生，这些气体的都是亲脂性物质，作用人们中枢神经系统，先引起人的兴奋渐渐转为抑制的中毒过程，严重时产生呼吸麻痹而死亡。石油液化气是一种混合物，属于石油裂解加工中的一种气体产品，主要成分含C1C4的烷烃和烯烃，但常能闻到臭味是由于其中还含有少量的硫化氢。天然气俗名为沼气，是石油开采过程中从石油中分离出来的气体，也称油田气，其主要含甲烷、乙烷，占总体积的6590%，还有少量的低碳烃。一、毒性和中毒症状中毒症状表现为头昏、头痛、咳嗽、食欲减退、乏力、失眠；重者头痛、失去知觉、小便失禁、呼吸变慢变浅，最后呼吸抑制而死亡。液化石油气的爆炸极限为1.9%8.5%(V/V)，在美国空气中允

25、许的浓度为800ppm（1900mg/m3）。二、检材要求和保存通过呼吸渠道中毒死亡的检材以心血和肺组织最好。检材应装满或至少达盛装容器的4/5以上，必须密封容器口，贴上明确信息的标签，低温冰箱保存，对气体毒物要求即时检验。三、检验方法 检材预处理取检材血35mL、肺组织快速搅碎称35g、三份空白血（正常献血者血），一份通石油液化气（阳性对照样），一份通天然气（阳性对照样），第三份空白血作阴性对照样。置于顶空瓶中，加适量的饱和氯化钠蒸馏水溶液，不超过瓶体积的1/21/3处封口、摇匀、70水浴或电热块加热1015min后，抽取液上平衡气体50100L进样 定性、定量检验预处理后的检材用顶空方法进样，做气相色谱定量分析（见图-1 天然气HS-GC-FID色谱）或气-质联用定性分析（见图-2液化石油气HS-GC-MS总离子流） 气相色谱法条件色谱柱：Plot Q 80100（10ft1/8in,od ss pw），柱温35，载气(He)50mL/min60mL/min，检测器：FID温度为250 气-质联用法条件色谱柱：porapak弹性石英毛细管柱（25m0.25mm0.32m），柱温：50保持1min（做天然气要保持10min），程序升温10/min，升至240。扫描范围10amu200amu，无溶剂延迟。