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1、毕业论文拟南芥突变体的鉴定 精品拟南芥突变体的鉴定摘要 在真核细胞的细胞核中， 基因组DNA缠绕在组蛋白上，形成核小体的结构。核心组蛋白的末端会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP核糖基化等。这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用。组蛋白的甲基化发生在赖氨酸和精氨酸位点，这些位点的甲基化参与异染色质形成，X染色体失活和基因转录的激活与沉默等许多重要的生物学功能。早先认为组蛋白上的甲基化是不可逆的。然而近年来在哺乳动物和酵母中相继发现了许多组蛋白去甲基化酶。其中最大的一个基因家族是包含有JMJC结构域的组蛋白去甲基化酶家族。

2、在植物中还没有报道有组蛋白去甲基化酶。我们通过基因组注释以及序列比对从拟南芥中鉴定出21个编码包含有JMJC结构域蛋白的基因。并从SALK突变体库中筛选鉴定了相应的T-DNA插入突变体。利用分子标记，我们筛选出了37个纯合T-DNA插入株系。给我们以后分析这些基因在植物生长发育中所起的作用打下了坚实的基础。关键词 组蛋白密码, 甲基化，去甲基化，T-DNA插入突变体 1 背景介绍1.1 “组蛋白密码”理论与表观遗传学在真核细胞的细胞核中， 基因组DNA与组蛋白和非组蛋白相互结合，构成遗传信息的物质载体染色质。染色质由其基本单位核小体重复连接而成，每个核小体包含一个组蛋白八聚体（H2A/H2B-

3、H3/H4-H3/H4-H2A/H2B）和围绕其上的两圈超螺旋DNA（146KB），核小体之间通过不同长度的超螺旋DNA和H1组蛋白前后相接。组蛋白八聚体的成员作为核小体的基本组成元件，在所有真核生物中高度保守。尽管核心组蛋白均具有一个三螺旋的结构严整的组蛋白折叠区，其两个末端却没有形成固定结构。然而，这些末端却会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP核糖基化等。这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用（1，2）。针对在组蛋白中存在的广泛修饰作用，Allis及其同事在2000年提出 “组蛋白密码”假说（1）。该假说认为：组蛋白

4、尾部的各种修饰是具有位点特异性的；已有修饰可影响后继修饰；各种修饰的综合，作为“密码”被其它蛋白或蛋白复合体所识别，通过调节RNA聚合酶II及其它转录相关蛋白分子接近DNA模板，引起不同的下游反应，影响着染色质的不同功能，例如基因表达，DNA复制和染色体分离。揭示组蛋白修饰的本质及作用机制对于阐明真核细胞复杂的基因表达调控具有非常重要的指导意义。1.2 组蛋白甲基化组蛋白甲基化是组蛋白上各种修饰中最复杂的一种。组蛋白上的甲基化已知可以发生在精氨酸和赖氨酸的氨基上。在组蛋白上有多个位点的精氨酸和赖氨酸上可以发生甲基化。如组蛋白H3上的第4，9，36和79位赖氨酸，第2，17，26位的精氨酸。组蛋

5、白H4上的第3位精氨酸，第二十位的赖氨酸。而且精氨酸甲基转移酶可以催化加上一个或两个甲基。赖氨酸甲基转移酶则可以在赖氨酸上加上一到三个甲基（3）。这些不同的组合使得组蛋白的甲基化有能力调控多种与染色质相关的生物学功能。比如组蛋白第9位的赖氨酸上的甲基化在异染色质的形成，X染色体的失活，转录抑制以及指导DNA的甲基化上起着重要的作用。又如组蛋白H4第二十位赖氨酸的甲基化参与染色质凝集，异染色质形成，转录抑制，DNA损伤修复以及细胞周期等生物学过程。相反组蛋白H3第4位，第36位，第79位赖氨酸的甲基化则被认为与基因的转录激活正相关（4，5）。在植物中组蛋白甲基化酶在基因沉默和植物的发育中起着重要

6、的作用。如KYP/SUVH4是DNA上一些CNG和不对称的C上的甲基化所必需的（6），ATX1是花器官正常分化所必需的（7），EFS/SDG8则是抑制植物过早开花所必需的（2，9）。1.3 组蛋白去甲基化甲基通过稳定的碳氮键与氨基共价相连。而且早先对组蛋白上的甲基的修饰半衰期的研究认为甲基的半衰期与组蛋白的半衰期相近。因此很久以来组蛋白的甲基化被认为是不可逆的（10）。最近的研究发现。单甲基化的精氨酸可以被PADI4/PAD4脱去氨甲基从而形成瓜氨酸，这是最早的报道能脱去甲基化的组蛋白上的甲基的酶。然而PADI4/PAD4不能对双甲基化的精氨酸起作用，而且脱去甲基的产物并不是原来的精氨酸而成了

7、瓜氨酸，所以该酶仍然不是真正的去甲基化酶（11，12）。LSD1的发现打开了对组蛋白去甲基化研究的大门。LSD1可以通过氧化反映去处组蛋白H3第4位和第9位单或双甲基化的赖氨酸上的甲基（13，14）。然而LSD1只是很小的一个基因家族，与已知的甲基转移酶的数量相比是很少的。同时Yi Zhang实验室通过生物化学手段跟踪去甲基化酶的活性发现了含有JMJC结构域的组蛋白去甲基化酶，并且证明是JMJC结构域是去甲基化的催化中心，随后对JMJC结构域的晶体结构的研究使人们确信了这一点（15，16）。随后对哺乳动物和酵母中包含JMJC结构域的蛋白的研究又鉴定了一大批的组蛋白去甲基化酶。这些发现使得我们对

8、于组蛋白上甲基的动态平衡有了更深刻的理解（16）。1.4 拟南芥中组蛋白去甲基化酶然而在植物中对组蛋白的去甲基化酶仍然没有任何认识。更不知道组蛋白去甲基化酶在植物的生长发育和对环境的响应中起什么样的作用。在拟南芥中，我们通过基因组的注释以及序列比对发现了21个基因编码含有JMJC结构域的蛋白。在这21个基因中有两个基因REF6和ELF6有报道表明参与到植物开花时间的决定中。虽然这两个基因从编码的蛋白质序列上来说非常接近。然而遗传学的分析表明这两个基因参与了不同的开花时间决定的通路中（17）。不过没有报道证明REF6和ELF6具有组蛋白去甲基化酶的活性。对于其他19个包含有JMJC结构域的功能仍

9、然是一无所知。我们期望通过对编码包含JMJC结构域蛋白的基因的突变体的研究来阐述组蛋白去甲基化对维持甲基化的动态平衡以及在植物生长发育中所起的作用。2 材料和方法2.1 实验材料来自SALK库的拟南芥AtPRMTsT-DNA插入突变杂合子种子。包括：SALK_021260（A1）、SALK-021253（A2）、SALK-014109（B1）、SALK-048786（B2）、SALK-037361（B3）、SALK-037362（B4）、SALK-043417（B5）、SALK-043403（B6）、SALK-048777（B7）、SALK-089978（B8）、SALK-089985（B9）

10、、SALK-019427（C1）、SALK-068986（C2）、SALK-024168（C3）、SALK-014455（D1）、SALK-135712（D2）SALK-136058（D3）、SALK-122006（E1）、SALK-001018（E2）、SALK-074694（E3）、SALK-024613（F1）、SALK-024612（F2）、SALK-109924（L1）、SALK-071534（G1）、SALK-029755（G2）、SALK-120904（G3）、SALK-103092（H1）、SALK-020986（H2）、SALK-092672（H3）、SALK-027723（

11、H4）、SALK-056556（H5）、SALK-044594（H6）、SALK-061686（I1）、SALK-036420（I2）、SALK-000651（J1）、SALK-004652（K1）、SALK-049065（K2）、SALK-023533（K3）、SALK-006042（K4）、SALK-035608（K5）、SALK-049697（M1）、SALK-052790（M2）、SALK-073422（N1）、SALK-025269（P1）、SALK-041728（P2）、SALK-041737（P3）、SALK-029530（Q1）、SALK-093345（Q2）、SALK-003

12、313（X2-3）注： (括号)内为实验室内种子编号。为方便说明，以下主要以括号内编号为主。2.2 主要药品试剂 2.2.1 常用试剂与药品氯仿、异丙醇、无水乙醇、国产分析纯琼脂糖，上海YITO公司。 2.2.2 试剂配制 2.2.2.1 Arabidopsis Thaliana营养液 大量元素 25X 3L 单位：g NaH2PO42H2O12.72KNO3225(NH4)2SO410.05MgSO47H2O37.5CaCl28.496铁盐200X 1L单位：gNa2-EDTA7.46FeSO47H2O5.56微量1000X 1L 单位：mg NaMoO42H2O250CuSO45H2O25

13、CoCl26H2O25KI750H3BO33,000MnSO4H2O10,000ZnSO47H2O2,0002.2.2.2 CTAB溶液配方：2 x CTAB200ml 2L2%CTAB4.0g40g100mM Tris(pH8.0)20ml*1MEDTA200ml*1MEDTA20mM EDTA16ul*0.25molEDTA80ul*0.5molEDTA1.4M NaCl16.4g164g2%PVP404.0g40g使用前加入2%的-巯基乙醇，20ul/10ml。注：CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中

14、，CTAB可与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体中制备纯化DNA.2.2.2.3 PCR 10xbuffer 配方：a.500mmol/L KCl, b.100mmol/L Tris-Cl(pH8.3)，c.15mmol/LMgCl2 在1.05KG/CM2高压下蒸汽灭菌10min。分装后贮存在-20。C。2.2.2.4 电泳缓冲液50xTAE储存液/L配方： a.242g Tris碱，b.57.1ml冰醋酸，c.100ml0.5mol，d.LEDTA(pH8.0)，e.ddH2O，用时稀释50倍用2.2.2.5 溴化

15、乙锭贮存液：在100ml水中加入1g溴化乙锭，溶解后于4棕色瓶内保存。2.2.2.6 6凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%(W/V)蔗糖水溶液，4保存。2.2.2.7 10mM dNTP, 从-80度冷柜中取出10mM dGTP, dCTP, dATP&dTTP, 各10ul加入60ul ddH2O混匀，配得100ul 10mM dNTP,，保存于-20度，减少反复冻融。2.3 主要仪器设备电泳仪：DYY6C电泳仪，DYY7B电泳仪,北京六一仪器厂超净工作台：北京昌平长城空气净化工程公司制造-80超低温冰箱：Heto ultra freeze制冰机：日本SANYO公司超纯水仪：ELGA高

16、速冷冻离心机：Eppendorf Centrifuge 5417R凝胶成像系统：KODAK,EDAS290,Transilluminnator 2020D,Coldspring.高压灭菌锅：江明滨江医疗设备厂，手提式压力蒸汽消毒器，YX-280型37恒温水浴仪：北京通达科技有限公司PCR仪：Eppendorf2.4 实验方法及原理 2.4.1 植物材料准备 2.4.1.1 配制营养液，160ml大量元素+ 20ml铁盐+ 4ml微量元素+水=12升营养液 2.4.1.2 往小盆里倒入蛭石，营养液浸润使其湿润，轻压实。 2.4.1.3 将种子倒于EP管中，用移液器逐粒种于土中，每碗5颗 2.4.

17、2 总DNA提取方法（CTAB法）2.4.2.1 取2-3片叶片置于含液氮的研钵中，用研棒研磨。研磨的过程中加入适当的液氮保持低温。 2.4.2.2 加入700ul的CTAB溶液(0.2%BME), 融化后转入EP管中。 2.4.2.3 65。C煮0.5小时（使核蛋白复合物完全解体） 2.4.2.4 离心5-10min,13000rpm 2.4.2.5 取上清加入等体积氯仿，颠倒混匀2-3min（去蛋白等杂质） 2.4.2.6 离心5min,12000rpm 2.4.2.7 转移上层无色水相加入等体积异丙醇，颠倒混匀2-3min，20。C 沉淀30min2.4.2.8 弃上清，75%乙醇洗涤沉

18、淀一遍2.4.2.9 充分干燥后，加100ul的纯水溶解沉淀，-20保存。2.4.3 PCR筛选2.4.3.1 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降低，由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；延伸：DNA模板-

19、引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR反应受到很多因素的影响，如PH值、各种盐离子的浓度等，在这些影响因素都是最适条件的情况下，即使模板和引物的条件稍差，也可扩增出近乎完美的产物。在做PCR实验之前，最好先对实验做优化设计，然后再对每一个影响因素一一进行实验分析，以确定每一个因素对实验结果是如何影响的。一般

20、情况下，优化实验要做各个因子的正交组合，通过这样的大量的组合试验，来确定一个相对来说最优的实验条件，只有这样，试验结果才有很大程度的重复性。2.4.3.2 PCR反应体系和流程图 20ul体系3 primers2 primers10Xbuffer 2ul2ul10umdNTP0.4ul0.4ulH2O14.2ul14.6ulE.TAQ1ul1ulPrimer10.4ul0.4ulPrimer20.4ul0.4ulPrimer30.4ul 无模板DNA1.2ul1.2ul 表2-2 PCR 反应体系 图2-2 PCR反应流程图 2.4.4 PCR产物的检测 PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是

21、否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小。2.4.5 T-DNA单拷贝插入突变体T-DNA单拷贝插入突变体筛选示意图：A 图2-1 T-DNA单拷贝突变体筛选示意图A, B,C分别表示了野生型基因组，T-DNA单拷贝插入杂合子和T-DNA单拷贝插入纯合子的情况。绿色部分表示可以被插入的GENE，蓝色部分表示插入的T-DNA，A，B代表基因组上与引物结

22、合的位点，I代表T-DNA上与引物结合的位点，为了解释的方便，我们用a,b,i用来代表与A，B，I位点结合的引物。每组两条带表示同源染色体上的一对等位基因。A图表示野生型基因组，无T-DNA插入。当反应体系中同时加入三种引物a,b,i时, 引物a,b与基因组上A，B位点结合，扩出1KB左右的特异性片段。当反应体系中加入两两组合的引物时，只有同时含有a,b引物的体系才能扩出野生型片断。B图表示T-DNA单拷贝插入杂合子，一条同源染色体上GENE无T-DNA插入，可在同时含有a,b引物的体系中扩出900BP左右的片段; 另一条同源染色体上GENE有T-DNA插入，此时A，B间距相对延长，超过1KB

23、，而根据反应流程，72度延伸一分钟只能扩出1KB以下的片段，这时，即使A，B位点结合引物，但由于二者距离过远，没有办法扩出插有T-DNA的GENE全长。同时，I位点结合引物i, 与A或B位点搭配，可扩出相对较小的片段。因此，在含有三种引物的反应体系中，杂合子的一对等位基因可扩出大小两个片段；而在含有两两组合的引物的不同反应体系中，杂合子将在含a,b引物的体系中扩出和野生型大小相同的片断，在含有a,i或 b,i引物的体系中扩出一条小于野生型的片断。C图表示T-DNA单拷贝插入纯合子。与杂合子同理。在含有三种引物的反应体系中，杂合子的一对等位基因可扩出一条小于野生型的片断；而在含有两两组合的引物的

24、不同反应体系中，只在含有a,i或 b,i引物的体系中扩出一条小于野生型的片断。因此，当反应体系中同时加入三种引物时，我们根据扩出片断大小可以反映有无T-DNA插入。而当反应体系中加入两两组合的引物时，我们根据扩出片段的引物组合可以反映T-DNA插入的方向和基因组的类型（杂合或纯合）。1，D图是通过含有三种引物的反应体系PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定植株类型的示意图，3 结果与讨论我们从SALK突变体库中拿到了所有21个基因的37个T-DNA插入突变，即T-DNA 插入到基因的中间的株系。利用分子标记，寻找纯合的T-DNA插入株系。然后通过分子生物学的手段检测T-DNA的插入是否破坏了基因的正常表

25、达。基因名称T-DNA插入突变体编号引物（LP RP）At1g09060SALK-021260 A1Cx1816 /cx1817 SALK-021253A2CX1816/Cx1817At1g63490SALK-014109B1Cx1818 /cx1819SALK-048786B2Cx1820 /cx1821SALK-037361B3Cx1820/Cx1821SALK-037362B4Cx1820 /cx1821SALK-043417B5Cx1824 /cx1825SALK-043403B6Cx1825/Cx1826SALK-048777B7Cx1820/Cx1821SALK-089978B8C

26、x2301/Cx2302SALK-089985B9Cx2301/Cx2302At4g21430SALK-019427C1Cx1827 /cx1828SALK-068986C2Cx1829/Cx1830SALK-024168C3Cx1829 /cx1830At4g20400SALK-014455D1Cx1831/Cx1832SALK-135712D2Cx1833 /cx1834SALK-136058D3Cx2303/Cx2304At3g48430SALK-122006E1Cx1835 /cx1836SALK-001018E2Cx1837/Cx1838SALK-074694E3Cx1803 /cx

27、1839SAIL-747-A07CS876460E4Cx2305/Cx2306At5g63080SALK-024613F1Cx1840/Cx1841SALK-024612F2Cx1840 /cx1841At5g63080SALK-109924L1Cx1840 /cx1841At5g19840SALK-071534G1Cx1846/ Cx1847SALK-029755G2Cx1846/ Cx1848SALK-120904G3Cx1846/Cx1848At4g00990SALK-103092H1Cx1849/Cx1850SALK-020986H2Cx1851/ Cx1852SALK-092672H

28、3Cx1851/ Cx1852SALK-027724H4Cx1853/ Cx1854SALK-056556H5Cx1855/ Cx1856SALK-044594H6Cx1855/ Cx1856At1g119501SALK-061686I1Cx1857/Cx1858SALK-036420I2Cx1859/Cx1860At1g78280SALK-000651J1Cx1861/Cx1862At3g07610SALK-004652K1Cx1863/ Cx1864SALK-049065K2Cx1865/Cx1866SALK-023533K3Cx1867/Cx1868SALK-006042K4Cx1867

29、/ Cx1868SALK-035608K5Cx1869/Cx1870At1g62310SALK-049697M1Cx1871/ Cx1872SALK-052790M2Cx1872/ Cx1873At1g30810SALK-073422N1Cx1874/ Cx1875At2g38950SALK-025269P1Cx1876/ Cx1877SALK-041728P2Cx1878/Cx1879SALK-041737P3Cx1878/Cx1879WiscDsLox376H12CS853364P4Cx2313/Cx2314At1g08620SALK-029530Q1Cx1880/ Cx1881SALK-

30、093345Q2Cx1880/ Cx1881At3g20810SAIL-811-H12R1Cx1882/Cx1883At2g34880GABI-257F10S1Cx1884/Cx1885SAIL-563-F10CS874918S2Cx2311/Cx2312At5g06550SAIL-680-G02CS829824T1Cx2299/Cx2300At5g04240SAIL-371-D08CS873586U2Cx2309/Cx2310At3g45880SALK-003312X1Cx1949/Cx1950SALK-003313X2Cx1949/ Cx1950 表1 来自SALK库的拟南芥AtPRMTs T-DNA插入突变体 所用引物结合位点所在的位置序列CX0101LBb1GCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCX0102LBa1TGGTTCACGTAGTG