地区科学基金项目标书范例.doc

1、 国家自然科学基金申请书 2008版申请代码：C1401受理部门： 收件日期：受理编号：国家自然科学基金申 请 书(2008版) 您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:中 方法: Word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中 (如果您是Word97用户，继续执行以下步骤) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击启用宏按钮，即可开始填写本文档或打印了资助类别：地区科学基金项目 亚类说明： 附注说明： 项目名称：急性低血压影响前庭功能的谷氨酸受体机制研究申 请 者： 电话：依托单位：通讯地址：邮政编

2、码：133000 单位电话：电子邮件：申报日期： 2008年3月10日国家自然科学基金委员会基本信息zYleU7IM申 请 者 信 息姓名性别男出生年月1958年2月民族朝鲜族学位博士职称教授主要研究领域神经生理学 电话电子邮件传真个人网页 工作单位延边大学 /基础医学院在研项目批准号 依托单位信息名称代 码13300201 联系人电子邮件电话网站地址合作单位信息单 位 名 称代 码00000000 项 目 基 本 信 息项目名称资助类别地区科学基金项目 亚类说明 附注说明 申请代码C1401:人体生理学 基地类别 预计研究年限2009年1月 2011年12月研究属性基础研究 申请经费25.0

3、000万元摘 要(限400字)：很多研究表明前庭影响血压，而申请人又发现血压反过来也能影响前庭功能。急性低血压通过前庭器官改变前庭神经核（vestibular neuclar, VN）功能，且可能与谷氨酸的释放有关，但其受体机制尚不清。本课题提出低血压通过前庭神经释放谷氨酸并与VN内相应受体参与继发性血压调节的假说，拟在清醒大鼠损伤一侧前庭器官不同时期，用微量透析、高效液相分析等方法，观察VN内谷氨酸含量的变化；结合药理学和免疫组化法，分析受体激动剂和阻断剂对VN细胞pERK1/2和c-Fos表达变化，探讨低血压影响VN功能活动的谷氨酸受体类型和细胞内信号变化关系，揭示前庭可能参与继发性血压调

4、节和血压变化所致眩晕的谷氨酸递质及其受体机制。目前国内外尚未见类似报道，将首次揭示正常和一侧前庭损伤不同时期VN内谷氨酸及其受体与急性低血压的相关性，为前庭参与血压调节的中枢机制研究提供理论依据，并为治疗相关疾病提供新的思路。关 键 词(用分号分开，最多5个)血压，前庭损伤，前庭神经核，谷氨酸，受体 第 23 页 版本1.006.348经费申请表 （金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费18.50001.科研业务费3.5000（1）测试/计算/分析费0.0000（2）能源/动力费0.0000（3）会议费/差旅费2.0000国际国内学术会各1次，（4）出版物/文献/信息传

5、播费1.0000文献复印、文献检索、论文刊登费等（5）其它0.50002.实验材料费15.0000（1）原材料/试剂/药品购置费12.0000动物1.5；免疫2.0；各种试剂3.5；流动相1.5；分离柱3.0；电极0.5（2）其它3.0000透析膜和各种导管1.5；其他消耗品1.53.仪器设备费0.0000（1）购置0.0000（2）试制0.00004.实验室改装费0.00005.协作费0.0000二.国际合作与交流费2.00001.项目组成员出国合作交流1.0000选派1-2名项目组成员出国短期培训和交流2.境外专家来华合作交流1.0000聘请1名国外专家来华进行学术交流三.劳务费3.300

6、0研究生劳务费15%四.管理费1.20005%合 计25.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费0.0000其他经费资助（含部门匹配）0.0000其他经费来源合计0.0000报告正文一、立项依据与研究内容研究意义： 位于内耳的前庭器官中的半规管通过感知角加速运动，椭圆囊和球囊则通过感知线加速运动和重力刺激，导致反射性姿势调节。即末梢前庭感受器感知头部的运动，把传入信号经前庭神经传达到前庭神经核（vestibular neucler, VN）后，诱发前庭-眼球反射；前庭-脊髓反射；前庭-自主神经反射。关于前庭-自主神经反射中，目前很多研究主要集中在对前庭器官的过度刺激或单侧前庭器

7、官损伤所致恶心、呕吐、眩晕、心率加快、出汗等自主神经症状上。有文献报道，参与血压调节的前庭-自主神经反射是末梢前庭感受器的传入信号到达VN后，通过多种中枢神经通路从延髓吻侧腹外侧区神经元传达到交感神经，构成作用于心脏和血管的神经传导径路。众所周知，前庭器官通过感知头部运动后参与血压的调节。但是，血压的变化对前庭器官功能的影响方面研究甚少。原发性低血压、心衰、心梗、心率不齐患者常伴有眩晕症状，但其发生机制并不确切。目前认为可能也与末梢前庭感受器的血流变化有关。血压的降低常常引起眩晕，提示末梢前庭感受器可能对血压的变化起反应，并可能参与继发性血压调节。本实验室利用电生理学和免疫组织化学方法，在麻醉

8、动物发现急性低血压不仅改变前庭神经和VN细胞的自发放电活动，而且也能增加VN神经细胞内细胞8兴奋标志物pERK1/2蛋白和c-Fos基因的表达、增加谷氨酸的含量，这些变化可被破坏前庭器官所反转。考虑急性低血压时前庭器官的功能改变与前庭神经释放谷氨酸有关，设想若能在清醒动物观察诱发急性低血压时结合药理学方法，观察VN区的谷氨酸、pERK1/2和c-Fos的变化，将有助于阐明前庭器官参与血压变化引起的继发性血压调节和血压变化所致眩晕的谷氨酸及其受体机制。谷氨酸的受体有促离子型受体和促代谢型受体，他们被激活后通过细胞内各级酶的级链磷酸化反应或通过调控基因表达改变细胞的功能活动。但是尚无在血压变化时谷

9、氨酸通过什么受体影响VN细胞功能的相关研究报道。本研究为了阐明血压的变化通过前庭系统继发性地参与血压调节和急性低血压、心衰、心梗、直立性低血压患者常伴有的眩晕症的谷氨酸受体机制，在清醒自由活动大鼠，利用核团微量透析、高效液项分析、药理学、免疫组化和行为学等方法，观察正常和破坏一侧外周前庭器官不同时期，诱发急性低血压时VN内谷氨酸含量、pERK1/2和c-Fos基因的变化和动物行为的改变。国内外研究现状：1974年Doba 等首次报道前庭器官参与直立性低血压的调节后，开始了对前庭-自主反射的研究。发现刺激前庭器官可使呼吸变得急促、心律加快、血流重新分布1-2，并参与动脉血压的调节3。那么，血压是

10、否也会影响前庭系统的功能活动？有学者指出4，基底动脉短暂缺血性眩晕患者脑干听力诱发电位也受到抑制，而且老年性眩晕症的90以上是由于脑血管缺血所致5。但是尚无内脏功能尤其是血压变化也影响前庭功能的直接报道。根据用硝酸甘油（sodium nitroprusside, SNP）引起低血压和脑血流量改变的相关研究发现，SNP使血压降低50以上时脑血流量明显减少，而血压降低不足50时脑血流量不出现明显变化，但是耳蜗的血流量随着血压的降低成比例减少。认为血压降低1030时脑血流量并不降低，只改变了前庭器官的血流量。推测这是血压降低可能通过激活VN使体循环血压反射性升高的一种代偿性反应6，提示前庭器官可能继

11、发性地参与血压的调节。我们的研究7-11也发现，SNP诱发急性低血压改变前庭传入神经和VN神经元的自发放电活动，并增加VN内c-Fos基因表达，这种作用被破坏外周前庭器官所反转。由图1可见急性低血压增强VN内型神经元的活动，却使型神经元的活动则有降低倾向，而在破坏单侧前庭感受器后这种现象发生反转。VN内c-Fos表达实验又发现（图2），正常动物诱发急性低血压引起两侧VN内c-Fos基因表达明显增加，破坏单侧前庭器官的动物损伤侧VN内c-Fos表达并不增加。Kim12等又报道，失血性急性低血压增加VN内pERK1/2表达，破坏前庭器官时pERK1/2表达则明显减少。提示，血压的降低可以通过前庭器

12、官和VN引起前庭反应，其中有前庭感受器的参与，而且前庭器官的刺激不仅影响血压，反过来血压的变化也能影响前庭器官的活动。这种活动可能意味着急性低血压通过前庭器官参与继发性的血压调节。VN区的神经递质种类繁多，其中至少有谷氨酸可能作为前庭传入神经的初级神经递质或调质发挥作用13。有文献报道，前庭代偿与其末梢释放谷氨酸及其离子型和代谢型受体14，也与GABA递质15有关，而在前庭-眼球反射时前庭器官的传入神经到达VN后其末梢释放的递质中有氨基酸类递质（谷氨酸、天冬氨酸、GABA）16。本室的最近研究发现17，用药物或放血等方法在麻醉大鼠诱发急性低血压时，正常动物VN内谷氨酸的含量明显增加而牛黄酸含量

13、明显减少，但是损伤单侧前庭器官动物慢性期损伤侧VN内谷氨酸和牛黄酸含量没有明显变化。表明急性低血压兴奋末梢前庭感受器，使其传入信号传达到VN后分泌谷氨酸来改变VN神经元的活动。申请人的预实验已经发现18，在清醒无麻醉正常大鼠诱发急性低血压时，VN谷氨酸含量明显增加而牛磺酸含量却明显降低。这种现象在一侧迷路损伤慢性期，损伤侧VN区谷氨酸含量则无明显变化，但是牛磺酸含量仍然明显下降，而在健康侧VN内谷氨酸和牛磺酸含量都明显增加（图3和4）。但是到目前为止，尚未见到关于急性低血压通过兴奋外周前庭器官，其末梢释放谷氨酸等氨基酸类递质以后，通过何种受体改变VN的功能活动的研究报道。主要参考文献：1 Wi

14、lson TD, Cotter LA, Draper JA, et al. Vestibular inputs elicit patterned changes in limb blood flow in conscious cats. J Physiol. 2006 Sep 1;575(Pt 2):671-84.2 T. D. Wilson, L. A. Cotter, J. A. Draper，et al. Effects of postural changes and removal of vestibular inputs on blood flow to the head of co

15、nscious felines. J Appl Physiol. 2006,100: 1475-1482, 3 Gotoh TM, Fujiki N, Matsuda T, et al. Roles of baroreflex and vestibulosympathetic reflex in controlling arterial blood pressure during gravitational stress in conscious rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2004.286: R25R30, 4 唐开雄，陈瑞陶，蔡

16、瑞等. 椎基底动脉短暂缺血性眩晕患者脑血流量与脑干听力诱发电关系研究华西医大学报2000，31(1)：8081 5 殷国华. 老年人眩晕的病因分析. 山东医大基础医学院学报. 2001，l5（6）；328-330 6 Hamaguchi M, Ishibashi T, Katsumata N, et al. Effect of sodium nitroprusside(MR7S1) and nitroglycerin on the systemic, renal cerebral and coronary circulation of dogs anesthetized with enflur

17、ance. Cardiovasc Drugs Ther. 1992;6:611-6227 Byung Rim Park, Min Sun Kim, Ggue hyn Yee, et al. Changes in vestibular nerve activity following acute hypotension in rats. Korean J physiol pharmacol. 2003,7;85-898 Min Sun Kim, Jae Hyo Kim, Davy kry, et al. Effects of acute hypotension on expression of

18、cFos-like protein in the vestibular nuclei of rats. Brain Research. 2003,962:111-121；9 Min Sun Kim, Jae Hyo Kim, Yuan Zhe Jin, Davy kry, Byung Rim Park. Temporal changes of cFos-like protein expression in medial vestibular nuclei following arsanilate-induced unilateral labyrinthectomy in rats. Neuro

19、science Letters.2002,319: 9-1210 Yuan Zhe Jin. Guang Shi Jin. Min Sun Kim. Byung Rim Park. Role of central vestibular pathway on control of blood pressure during acute hypotension in rats. J Korean Balance Soc. 2005:4(2):189-20011 Park BR, Kim MS, Kim JH, Jin YZ. Effect of acute hypotension on neuro

20、nal activity of vestibular nuclei in rats. Neurorport. 2001,12.3821-3824.12 Min Sun Kim, Myoun Ae Choi, Dong Ok Choi, et al.Asymmetric activation of extracellular singal-regulated kinase 1/2 in rat vestibular nuclei by unilateral labyrinthectomy. Brain research. 2004,1011;238-242.13 Sasa M, Takeshit

21、a S, Amano T, et al.Primary neurotransmitters and regulatory substances onto vestibular nucleus neurons. Biol Sci Space. 2001，15(4):371-414 Gliddon CM ，Sansom AJ，Smith PF，et al. Effects of intra-vestibular nucleus injection of the group I metabotropic glutamate receptor antagonist AIDA on vestibular

22、 compensation in guinea pigsExp Brain Res，2000，134(1)：74-8015 Giardino L, Zanni M, Fernandez M, et al.Plasticity of GABA(a) system during ageing: focus on vestibular compensation and possible pharmacological intervention. Brain Res. 2002 Mar 1;929(1):76-8616 Andrianov GN, Puyal J, Raymond J, et al.

23、Immunocytochemical and pharmacological characterization of metabotropic glutamate receptors of the vestibular end organs in the frog. Hear Res. 2005,204:200-209.17 于海玲、安英、邴艳华、金清华、崔勋、金元哲*. 急性低血压对前庭神经内侧核区谷氨酸和牛磺酸含量的影响. 生理学报.2006，58（2）177-182.18 安英，于海玲，邴艳华，金清华，崔勋，金元哲*. 急性低血压对清醒大鼠前庭神经内侧核区谷氨酸和牛磺酸含量的影响。中国临

24、床康复.2006;10(30):82-852项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题。研究内容：本研究拟用清醒大鼠，药物或外科手术制备外周前庭器官损伤模型后，用核团内微量透析、高效液相色谱、免疫组织化学、药理学、行为学等方法，探讨急性低血压兴奋VN时VN内谷氨酸等氨基酸类神经递质含量的变化及谷氨酸受体机制。将有助于阐明血压影响前庭功能，并继发性地参与血压调节的谷氨酸及其受体机制，并为临床治疗相关疾病提供新的思路。实验动物选用250-300g的清洁级Wistar系雄性大鼠，在清醒状态下进行实验。诱发急性低血压用静脉注射SNP（15g/kg/min,3min），使动脉血压下降30%左右。为了

25、研究前庭代偿的不同时期，急性低血压对VN区神经递质含量变化的相关性，实验分前庭感受器损伤后急性期(24, 48小时)和慢性期(两周后)两个部分进行。外周前庭器官的永久破坏用对氨基苯基砷酸盐行化学性损毁法或外科手术损毁法。（1）正常清醒动物VN区谷氨酸含量、pERK1/2和c-Fos的表达。利用神经核团微量透析法和免疫组织化学法，观察VN内谷氨酸等氨基酸类神经递质含量、pERK1/2和c-Fos的表达。明确正常清醒动物VN内氨基酸类递质的含量和细胞兴奋标志物的表达情况。（2）急性低血压对正常清醒动物VN区谷氨酸含量、pERK1/2和c-Fos表达的影响。观察正常清醒动物诱发急性低血压时，VN内神

26、经递质含量变化、pERK1/2和c-Fos的表达。证实本实验条件下，急性低血压是否兴奋VN，同时证明谷氨酸参与其中。 （3）前庭损伤不同时期急性低血压对清醒动物VN区神经递质含量、pERK1/2和c-Fos表达的影响。一侧前庭损伤急性期（损伤24、48小时）和慢性期（损伤2周），观察诱发急性低血压前后双侧VN区神经递质、pERK1/2和c-Fos的表达差异。阐明前庭损伤不同时期（A）VN内上述指标的变化；（B）急性低血压与上述指标的关系。（4）受体兴奋剂和阻断剂对前庭损伤不同时期清醒动物VN区pERK1/2和c-Fos表达的影响。一侧前庭器官损伤后的不同时期用药理学和免疫组织化学法，脑室注入受

27、体兴奋剂和阻断剂（如谷氨酸和谷氨酸的拮抗剂Dizocilpine, MK-801等）后比较观察正常和损伤前庭动物双侧VN内pERK1/2和c-Fos表达变化。进一步阐明前庭损伤不同时期受体兴奋剂和阻断剂对VN不对称兴奋的影响。同时通过动物行为变化，观察兴奋剂和阻断剂对前庭失代偿行为的影响。（5）受体兴奋剂和阻断剂对前庭损伤不同时期清醒动物诱发急性低血压后VN区pERK1/2和c-Fos表达的影响。一侧前庭器官损伤后的不同时期，诱发急性低血压前后观察损伤侧和健侧VN内pERK1/2和c-Fos的表达，比较分析两侧的差异。确定前庭损伤不同时期，急性低血压影响VN功能受体功能变化。最终验证急性低血压

28、兴奋外周前庭器官，通过前庭神经至少释放谷氨酸并通过相应受体改变VN功能的假说，同时阐明前庭损伤不同时期这些递质和受体功能变化的相关性。研究目标：1阐明一侧前庭损伤不同时期，两侧VN区谷氨酸含量变化的相关性。2在正常清醒动物，通过诱发急性低血压，观察VN内神经递质含量变化，证明急性低血压与VN内谷氨酸含量变化的相关性。通过pERK1/2和c-Fos表达变化证明急性低血压兴奋VN。3一侧前庭器官损伤的清醒动物，通过诱发急性低血压，观察前庭器官损伤不同时期动物双侧VN内神经递质含量的变化，证明前庭损伤不同时期急性低血压与VN内谷氨酸含量变化的相关性。同样通过pERK1/2和c-Fos表达变化，阐明前

29、庭损伤不同时期急性低血压前后VN功能活动变化。4使用受体兴奋剂或阻断剂后，观察一侧前庭器官损伤的清醒动物VN内pERK1/2和c-Fos表达的影响，阐明一侧前庭损伤后，前庭代偿不同时期VN的兴奋与相应受体的关系。通过动物行为变化，观察兴奋剂和阻断剂对前庭失代偿行为的影响。5使用受体兴奋剂或阻断剂后，观察急性低血压对一侧前庭器官破坏动物VN内pERK1/2和c-Fos表达的影响，确定前庭损伤不同阶段参与急性低血压兴奋VN的谷氨酸受体功能变化。拟解决的关键科学问题： 1明确清醒动物VN区谷氨酸等氨基酸类递质的含量；2阐明清醒动物急性低血压兴奋VN的谷氨酸的受体机制；3阐明清醒动物前庭损伤不同时期，

30、急性低血压与VN的谷氨酸含量及其受体功能的关系；4揭示清醒动物一侧外周前庭器官损伤不同时期，前庭代偿与谷氨酸含量及其受体的相互关系；3拟采取的研究方案及可行性分析。拟采取的研究方法和实验手段：（1）动物：本实验选用250-300g的清洁级Wistar系雄性大鼠。为了消除麻醉对动物心理和行为的影响，实验观察全部在清醒状态下进行。（2）破坏前庭器官：外周前庭器官的永久破坏行化学和手术损毁法。化学损毁法：水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉。从外耳穿透鼓膜向中耳注入对氨基苯胂酸盐（sigma公司产品，用0.3M碳酸钠溶液配成100mg/ml）后放入脱脂棉，并置动物仰卧位，使药物持续缓慢吸收。可使动物在6个小时后开始出现前庭损伤症状。手术损毁法：水合氯醛麻醉，在耳廓后去毛，常规消毒，暴露颞骨下缘、钻开骨缘，露出水平半规管，抽吸外淋巴液，并用聚乙烯管向前庭壶腹处灌注无水酒精后留管，缝合皮肤，肌肉注射抗