原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制.docx

1、原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制一、杂交前准备（一）DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO2和乙醇）。有些试剂可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1%0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEP

2、C水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。注意：DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。（二）载玻片的处理组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下：（1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗23次，置160以上烤箱中烧烤4h以上，或经15磅高压灭菌20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。（2）HCl处理法试剂: 1M HCL, DEPC 水, 95%

3、乙醇步骤: a. 玻片在室温下于1M HCL中浸泡30分钟 b. DEPC水中洗片 c. 95%乙醇中洗片 d. 空气中干燥 e. 重复一遍 ad. f. 铝箔包好备用.（三）硅化【方法】（1）将一扎新的盖玻片散开，在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷却后,倒掉盐酸。（2）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。（3）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC）液中浸几下，竖入在架子上干燥。（4）收集干燥的盖玻片于一可耐热的petri氏盘（或培养皿）中，用去离子水漂洗数次，彻底清洗。（5）用铝箔将装有盖玻

4、片的培养皿包好，于180烘烤4h过夜。取出待冷至室温后，即可进行后续处理。附：2%DMDCDMDC2ml 三氯乙烷 98ml配制：按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用。用途：硅化玻片（载片、盖片均可）。【方法2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中，并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时，在干燥器中放一盛有约1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）的小烧杯。盖好干燥器（确保密闭），抽真空约5min，然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架，用锡箔纸包埋，于250以上烘烤4h以上，最好过夜。冷却后备用。本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60烧干。

5、【方法3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣）法 试剂: 2%的APES/丙酮(V/V),丙酮,DEPC水 步骤: 1. 玻片先于室温中在APES液中浸泡10秒2. 丙酮中洗涤3.DEPC水中漂洗4.空气中干燥5.4度保存(最好用铝箔包好,避免污染)仪器专场展示：化学试剂标准物质生化试剂常用试剂试剂配制原位杂交组织化学【方法4】（1）49ml氯仿与1mg二甲二氯硅浣（DMDC）配液；（2）倒入每个拟硅化的试管或离心管中，浸泡5min后用乙醇或重蒸水冲洗；（3）玻璃器皿使用前位于180以上烘烤2h以上，塑料器皿应于60烘烤过夜。注意：DMDC有毒且高度挥发，应于通风环境操作并戴口罩、手套，避免接触皮肤

6、或吸入。（四）载片的包被（粘贴）沾附剂（1）多聚赖氨酸(poly-L-Lycine,PLL)储备液（05%）: PLL 25mg,DEPC水 5ml 按上述剂量充分混合，即为浓度为5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分装成1ml的包装，-20存放。该液为储备液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。工作液（0.01%）：0.5% PPL, DEPC水 50ml充分混合，静止待气泡消失。（2）明胶液配方: 明胶 2.4g, 甲明矾 2.4g, DEPC水 1000ml配法：先称取明胶溶于500800ml DEPC水中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解以后，加入甲明矾溶解后即可使用。注意，包被玻片时

7、，明胶液温度最好保持在60左右，效果最佳。方法同PLL包被玻片。2多聚赖氨酸包被玻片的制备方法（其它包被剂相同）（1）将事先准备好的经160以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片），在0.05%（也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4备用。注意：浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象；干燥过程中注意避免尘埃污染；按上法处理的玻片通常可存放在一定时间（室温1月以上，4更长），但仍建议尽早使用。（2）多聚赖氨酸1mg溶于10ml灭菌的去离子水或1mmol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH7.0），将其涂布于玻片上，待

8、干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。（3）将PLL工作液滴至盖玻片上5l/片，用另一盖玻片以推血涂片方法推片，或用另一盖玻片紧贴于其上，相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片，只有一面是包被有PLL，故制备时，待其晾干后，应作好记号，然后保存后备用。多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交，方法简单，结果可靠，有许多其它方法不可比拟的优点。配制好的液体可存放于4或室温，但时间过长会解聚而失效，故建议使用时尽量新鲜配制。（4）Vectabond粘附剂该试剂是Vector公司新近推出的一种新型粘附剂。它与其它粘附剂的主要区别是：一般的粘附剂是通过物理性覆盖在玻片表面，天长日

9、久，可能由于包被不完全或局部脱落而致切片等标本易于脱落。而Vectabond试剂是通过化学性作用，改变玻璃表面的分子结构，使标本贴附牢固，不易脱落，且保持时间长久，耗量小，价格便宜，一个包装7ml可配成350ml工作液使用。操作程序：标本（铺片、切片等）丙酮（5min）Vectabond试剂工作液（5min）dH2O(25min)干燥（温箱，数小时过夜）用铝箔包好，室温备用。注意：制备和保存过程中避免污染。经上述处理的载玻片一般可存放半年以上（4可更长）。（五）硅鱼精子DNA的制备（1）在50ml灭菌聚乙烯管中加入1g鲑精DNA，加入15ml DEPC水使其浸泡5min至2h；（2）加入2.5

10、ml 2mol/L HCl，室温放置，DNA形成白色沉淀，充分振摇至沉淀物相互缠绕在一起，用吸头尖端使之形成一球团状（23min）；（3）加入5.0ml 2mol/L的NaOH。摇动小管使DNA悬浮、溶解，将小管置5015min助溶；（4）用DEPC水将混合物稀释至175ml（总体积），充分混合，注意确保管内已无颗粒状；（5）加入20ml/l 1mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.4）；（6）用2mol/L的HCl滴定至DNA溶解pH为7.07.5；（7）用无菌微孔滤膜过滤液体，去除颗粒。260nm测定溶液的OD值，方法是：取20l DNA液混合于980l水中，混匀后测定，吸收值乘以5

11、0即为DNA浓度（g/ml）；（8）制备好的DNA液储于-20备用，用前取出冻融后煮沸。二、关于探针的标记（一）cRNA探针的同位素标记1 标记液（转录标记）5X转录缓冲液 2ulDDT(400mmol/L 1ul线性化DNA探针(模板) (1ug/ul) 1ug32P-CTP(12.5umol/L-50uCi 5ulRNA多聚酶(20u/ul) 1ul2 转录缓冲液Tris-HCl(pH7.5)200mmol/L,MgCl2 30mmol/L, 精眯 10mmol/L,DTT50mmol/L, BSA(不含RNA酶)0.5mg/ml, HPRI 5000u/ml,ATP,GTP,UTP各 2

12、.5mmol/L, CTP*：用地高辛或生物素标记时，用UTP替代。3 标记终止液无RNA酶的DNA酶 1ul,tRNA(10mg/ml)1ul,灭菌去离子水 188ul4标记探针水解液0.4mmol/L 碳酸氢钠20ul, 0.6mmol/L 碳酸钠 20ul, 灭菌去离子水 160ul.先用dH2O悬浮探针，再加入后两种试剂，轻轻振摇混合，于60条件下反应。5探针水解时间注：LO探针初始长度（kb）Lf探针的终长度（kb）K0.11kb/min6探针水解终止液 3mmol/L醋酸钠6.6ul, 醋酸 1.3ul每次加入充分混合，临用前配。7探针沉淀液 7mmol/L醋酸胺 100ul,纯酒

13、精750ul, rRNA(10mg/ml) 2ul每次加入，充分混合，新鲜配制。（二）寡聚核苷酸3端标记（cRNA探针）1 标记反应液寡核苷酸 20ng, 5X转录缓冲液4ul, 32P-dATP(3000Ci/mmol/L) 7ul,CoCl22ul, 末端转移酶 1ul, 灭菌去离子水20ul.2终止液：0.2mol/L EDTA3.探针沉淀液 tRNA 1ul, 7mmol/L 醋酸胺100ul, 纯乙醇750ul（三）cRNA探针非同位素标记（地高辛及生物素）1 标记液5X转录缓冲液2ul, 0.2mmol/L DTT 1ul, 模板DNA(1ug/ul) 1ul,Dig-11-UTP

14、(10mmol/L) * 1ul,32PCTP# 1ul,RNA 聚合酶(20u/ul)1ul, 无菌去离子水3ul*：生物素标记时为10mmol/L的生物素-11-UTP#：为检测标记率而加。2转录标记终止液（1）0.2mol/L EDTA：用于地高辛标记法（2）生物素标记终止液： 无RNA酶的DNA酶(1u/ul) 1ul,tRNA(10mg/ml)2ul,HPRI 1ul,灭菌去离子水 186ul（四）DNA探针标记常用试剂的配制（1）10 缺口平移缓冲液：200mmol/l Tris-HCl,pH7.4含50mmol/L MgCl2;100mmol/L-巯基乙醇、1mg/ml BSA。

15、（2）缺口平移反应终止液：200mmol/L NaCl;10mmol/l Tris-HCl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS。（3）DNase:干粉状DNase(20003000u/mg)溶于20mmol/l Tris-HCl, pH7.5中（1mg/ml）,10l分装，-20保存一年。（4）10DNA聚合酶（Klenow片段）缓冲液：500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA。（5）10激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4,50mmol/L MgCl2;20

16、mmol/L DTT; 1.0mmol/L亚精胺。（6）10随机引物标记缓冲液；500mmol/l Tris-HCl,pH6.6;100mmol/L MgCl2;10mmol/L -巯基乙醇；500g/ml BSA。（7）1加尾缓冲液：100mmol/L二甲胂化钾，pH7.0,1mmol/l CoCl2 0.2mmol/L DTT。（8）1mol/L MgCl2:MgCl2 47.60g溶于500ml水中，100ml分装，高压灭菌，室温保存。（9）0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g溶于400ml水中，调pH至8.0，加水至500ml，100ml分装，高压灭菌，室

17、温保存。（10）4mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠82g溶于200ml水中，用醋酸调pH至6.5，加水至250ml，高压灭菌，或0.45m膜过滤，室温保存。（11）10% SDS：10g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于50ml水中，加水至100ml，分装后室温保存。（12）20SSC：取NaCl 175.3g;柠檬酸钠88.2g;加水至1000ml，用10mol/l NaOH调pH至7.0；高压灭菌，室温保存。（13）无菌水：100ml去离子水或双蒸水，分装，高压灭菌，室温保存，开瓶后仅限一周使用。（14）10激酶缓冲液：500mmol/L Tris-HCl,pH7.4;100mmol/L MgC

18、l2;50mmol/l DTT;10mmol/L亚精胺（非必需）。（15）T4多聚核苷酸激酶：10u/l，保存在甘油中，-20。（16）TE缓冲液（Tris/EDTA）：Tris,10mmol/l pH7.4(0.5ml 2mol/L贮存液)，1.0mmol/l EDTA,pH8.0(20l 0.5mol/L)贮存液，加水至100ml，室温保存。（17）2mol/L Tris-HCl pH7.4:Tris242.2g溶于850ml，加浓HCl 75ml ,边加边缓慢搅动，至pH7.4,于加水至1000ml。（18）1mol/L DTT(二硫苏糖醇)：3.0g DTT溶于20ml水中，分装，于-

19、20贮存。（19）0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）：在烧杯中先加入300ml水，加入93.5g EDTANa22H2O,充分混匀，加10mol/l NaOH调pH至8.0,加水至500ml。（20）10mol/L NaOH：200g NaOH溶于450ml水中，混匀，再加水至500ml。（21）5mol/L NaCl：292.25g NaCl,加水至1000ml。（22）1mol/L HCl：加86.2ml浓盐酸至913.8ml水中。（23）1mol/L CaCl2：147g CaCl2：2H2O,溶于1000ml水中,高压灭菌,室温保存。三、固定剂进行原位杂交的组织或细胞标本

20、常需经固定处理。尽管许多化学物质对组织/细胞有固定作用，但核酸原位杂交的理想固定液应具备如下特点：能很好地保持组织细胞的状态；对核酸无抽提、修饰及降解作用；不改变被检核酸分子在组织细胞内的定位；对核酸及探针的杂交过程无阻碍作用；固定液本身对杂交信号无遮蔽、掩盖作用，如不使本底增加等；理化性质稳定、价格低廉。1 4%多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）PFA 40g,DEPC水 500ml, 2XPBS 500ml 配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至6065，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.0，

21、使呈清亮状（滴加），再加入约500ml 2PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4保存备用。注意：配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因PFA有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；加热时，温度不宜过高，常为6065，否则，PFA降解失效；配制好的PFA虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，建议尽早使用。配法：按上述比例称取试剂，溶于DEPC水（也可用蒸馏水加DEPC）500800ml中，过滤后，加水定容至1000ml，高压灭菌。通常配制成10PBS的储备液，2PBS和1PBS可用DEPC

22、水稀释获得。除用DEPC水配制PFA外，也有用灭菌蒸馏水或经DEPC处理的0.010.1mol/L的PBS配制的，方法及注意事项同上。4% PFA是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好。通常组织块固定412h，载片固定时间在1015min以内，RNA含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。2甲醛10%甲醛（Formaldehyde,FA）量取市售甲醛(约40%)10ml和DEPC水90ml充分混合而可。较适于检测RNA的组织及细胞固定，也可用于新鲜冰片切片后固定。10%福尔马林

23、试剂：较适于固定细胞。10%中性福尔马林市售甲醛100mlNa2HPO44gNaH2PO46.5gDEPC水1000ml常用于石蜡样品切片的固定。10%的甲醛由于有促进DNA双链分子交联的作用，干扰DNA变性，故不适于DNA杂交。在组织或细胞原位杂交中，可通过使用含50%甲酰胺的杂交液使DNA变性解链而解决。这类固定液在DNA/RNA杂交中有较好的效果。34%戊二醛效果较40%差。40.1%戊二醛常用于固定组织，适于新鲜组织冰冻切片及石蜡切片的后固定，常用于检测DNA的原位组织杂交方法。5乙醇/醋酸（或冰醋酸）将乙醇与醋酸按3：1的体积比充分混合即可。该液较适于固定细胞的原位杂交，尤其检测DN

24、A时。乙醇/醋酸虽广泛应用于原位杂交中，但RNA保留较差，可本底很低，即背景染色淡。6甲醇/醋酸（3：1）用前按体积比3：1比例充分混合即可。7甲醇/丙酮（1：1）适于培养细胞的原位杂交技术。84%多聚甲醇-0.5%1%戊二醛溶液在pH7.4磷酸缓冲液中，用于免疫电镜样品固定。四、LB培养基（一）液体LB培养基（Luria-Bertani培养基）配制：取一1000ml的烧杯，将事先称取好的试剂加入杯内，加H2O约500800ml搅拌使其溶解完全。用5N的NaOH调pH至7.0,加入H2O定容至1000ml。15磅高压灭20min。（二）琼脂糖平板培养基细菌培养用琼脂（或琼脂糖）15g液体培养基

25、（如LB）1000ml按浓度比例，将琼脂加入液体培养基（如LB）中，稍加搅拌，用纱布或纸封好瓶口，15磅高压灭菌20min。五、小量质粒提取主要液体(见试剂盒)六、杂交前处理1蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：精心称药，将二

26、者充分混合后，分装成小份，-20存放，用时再取出冻融，余者弃去。（2）工作液（临用前配）：取储备液（1mg/ml）按1：40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。称取上述试剂，充分混合即可。1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：0.5mol/L的EDTA：2甘氨酸（1）1mol/L甘氨酸：（2）甘氨酸工作液（0.1mol/L）：30.25%醋酸-0.25%醋酸酐配制：按上述配方，先以少许DEPC水溶解NaCl 5g，然后加入三乙醇胺13.2ml及浓HCl 4ml。DEPC水定容至约1000ml(997.5ml)，临用前，一边摇动溶液一边加入醋酸酐2.5ml，充分

27、混合。注意操作时避免浓HCl 溅出，最好在通风条件下进行。生物体内有些组织，如神经组织中的蛋白质，对带负电荷的核酸探针较易吸附。经该液乙酰化处理后，可使切片标本表现带上负电荷，有排斥带负电的核酸探针，减少非特异吸附，降低反应背景的作用。4RNA酶 A溶液取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中，分装成小份（1ml,10mg/ml），-20储存。临用前，取RNA酶A储备液，用2SSC溶解配成工作液（0.01mg/ml）.取2ml Triton X-100加入998ml PBS中，充分振荡使其充分混合。七、杂交用液1SSC（Standard Saline Citrate, SSC）通常配成10，

28、20，50的储备液.2Denhardts液通常配成10，50或100的储备液3杂交液及予杂交液变性被打断的无关DNA（常为鲑精DNA或鲱精DNA）可在予杂交及杂交前加入。此外，有许多物质如肝素、多聚腺甘酸、醋酸钠等多种成份，可根据需要加入杂交液中，上述配方所列只是不可缺少的基本成份。配制好的杂交液不宜反复冻融，否则易产生硫酸葡聚糖沉淀现象。使用前最好加热至50，使其充分溶解后再加入探针分子。至于探针的浓度视实验目的、探针类型及标记方法而异。通常RNA探针分子浓度为0.52g/ml，DNA探针浓度为1g/ml,此外，如使用35S标记的探针，还需加入终浓度为100mmol/L的二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）至杂交液及杂交后的洗脱液中。八、杂交后漂洗溶液无论用何种标记方法及何种信号显示方法，在杂交后洗脱则是大同小异。