人用狂犬病疫苗地鼠肾细胞.docx

1、人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）Renyong Kuangquanbing Yimiao(Dishushen Xibao)Rabies Vaccine For Human Use (PHK Cell) 本品系用狂犬病病毒固定毒接种原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液、灭活病毒、浓缩、纯化，加入适宜的稳定剂后制成，用于预防狂犬病。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合凡例有关要求。 2 制造 2.1生产用细胞生产用细胞为原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞。 2.1.1细胞管理及检定 应符合生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程规定。 2.1.2细胞制

2、备 选用1214日龄地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，分散细胞，接种培养瓶，用适宜的培养液进行培养。来源于同一批地鼠、同一容器消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批。源自同一批地鼠、于同一天制备的多个细胞消化批为一个细胞批。 2.2毒种 2.2.1名称 生产用毒种为狂犬病病毒固定毒aG株或其他经地鼠细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。 2.2.2种子批的建立 应符合生物制品生产和检定用菌毒种管理规程规定。 原始种子批为2aG1，主种子批应不超过4aG。毒种在地鼠肾原代细胞和豚鼠脑内交替传代制备工作种子批，在地鼠肾原代细胞的传代应不超过第6代，即不超过10aG；在豚鼠脑内传代应不超过第5代，即10a

3、G5。 2.2.3种子批的检定 主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1-2.2.3.5项检定。 2.2.3.1鉴别试验 用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性。将毒种作10倍系列稀释， 取适宜稀释度病毒液与等量狂犬病病毒特异性免疫血清混合， 同时设立正常血清对照组， 试验组与对照组的每个稀释度分别接种11-13g小鼠6只， 每只脑内接种0.03ml， 观察14天，中和指数应不低于500。 2.2.3.2病毒滴定 取毒种作10倍系列稀释，每个稀释度脑内接种体重为11-13g小鼠至少6只，每只脑内接种0.03ml， 观察14天，病毒滴度应不低于8.0 LgLD50/ml。 2.

4、2.3.3无菌检查 依法检查（附录XII A），应符合规定。 2.2.3.4支原体检查 依法检查（附录XII B），应符合规定。 2.2.3.5病毒外源因子检查 依法检查（附录XII C），应符合规定。 2.2.3.6免疫原性检查 用主种子批毒种制备灭活疫苗，腹腔注射体重为12-14g小鼠，每只0.5ml。7天后重复接种1次作为试验组，未经免疫小鼠做对照组。第一次免疫后的第14天，试验组和对照组分别用10倍系列稀释的CVS病毒脑腔攻击， 每只0.03ml，每个稀释度10只小鼠。保护指数应不低于100。 2.2.4毒种保存 冻干毒种应置-60以下保存。 2.3原液 2.3.1细胞制备 同2.1.

5、2项。 2.3.2培养液 培养液为含适量灭能新生牛血清的乳蛋白水解物、MEM、199或其他适宜培养液。新生牛血清的质量应符合规定（附录XIII D）。 2.3.3对照细胞外源因子检查 依法检查（附录XII C ），应符合规定。 2.3.4病毒接种和培养 当细胞培养成致密单层后，毒种按0.010.1 MOI接种（同一工作种子批应按同一MOI接种），置适宜温度下培养一定时间后，弃去培养液，用无菌PBS或其他适宜洗液冲洗去除牛血清，加入适量维持液，置33-35继续培养适当时间。 2.3.5病毒收获 经培养适宜时间收获病毒液，即为病毒单次收获液。根据细胞生长情况，可换以维持液进行多次病毒收获。同一细胞

6、批的同一次病毒收获液经检定合格后可合并为单次病毒收获液； 236 单次病毒收获液检定 按3.1 项进行。 237 单次病毒收获液保存 于2-8C保存不超过30天。 238 病毒灭活 病毒收获液中按1：4000的比例加入甲醛溶液（应在规定的蛋白浓度范围内进行病毒灭活），置适宜温度、在一定时间内灭活病毒。病毒灭活到期后， 每个灭活容器应立即取样， 分别进行病毒灭活验证试验。 2.3.9合并及超滤、浓缩 同一细胞批制备的多个单次病毒收获液检定合格后可合并为一批，经超滤或其他适宜方法浓缩至规定的蛋白质浓度范围。 2.3.10 纯化 经浓缩后的病毒液采用柱色谱法或其他适宜的方法纯化。 纯化后可加入适量人

7、血白蛋白作为稳定剂， 即为原液。 2311原液检定 按3.2项进行。 2.4 半成品 2.4.1 配制 用疫苗稀释液将原液按同一蛋白质含量及抗原量进行配制，总蛋白质含量应不高于80g/剂，并加入适宜浓度的稳定剂和一定量的硫柳汞作为防腐剂，即为半成品。 24. 半成品检定 按3.3项进行。 25成品 2.51分批 应符合生物制品分批规程规定。 2.52分装 应符合生物制品分装和冻干规程规定。 2.53规格 每瓶1.0ml。每1次人用剂量为1.0ml，狂犬病疫苗效价应不低于2.5IU。 2.54包装 应符合生物制品包装规程规定。 3 检定 3.1单次病毒收获液的检定 3.1.1病毒滴定 按2.2.

8、3.2项进行，病毒滴度应不低于5.5 LgLD50/ml。 3.1.2无菌检查 依法检查（附录XII A）,应符合规定。 3.1.3支原体检查 依法检查（附录XII B）,应符合规定。 3.2原液检定 3.2.1无菌检查 依法检查（附录XII A）,应符合规定。 3.2.2病毒灭活验证试验 取病毒灭活后供试品经透析后， 接种25ml于原代地鼠肾细胞或其他适宜敏感细胞， 每3cm2单层细胞接种1ml供试品 ，37吸附60分钟后加入细胞培养液，与供试品量比例不超过1：3， 每7天传1代， 将培养21天后的培养液混合取样，分别进行动物法和酶联免疫法检测。 动物法为脑内接种体重为11-13g小鼠20只

9、，每只0.03ml， 观察14天，应全部健存（3天内死亡的不计， 动物死亡数量应不超过试验动物总数的20%）；采用酶联免疫法检查，应为阴性。 3.2.3蛋白质含量 取纯化后未加稳定剂的供试品，依法测定，应不高于80g剂（附录VI B第二法）。 3.2.4抗原含量 采用酶联免疫法，应按批准的标准执行。 3.半成品检定 无菌检查 依法检查（附录XII A）,应符合规定。 3.成品检定 3.1鉴别试验 采用ELISA法检查， 应证明含有狂犬病病毒抗原。 3.2外观 应为无色澄明液体，无异物。 343 装量 按附录I A装量项进行， 应不低于标示量。 3.4化学检定 3.41pH值 应为7.2-8.0

10、（附录V A）。 3.42硫柳汞含量 应不高于50ug/ml(附录VII B)。 3.43游离甲醛含量 应不高于100ug/ml(附录VI L)。 3.4.44 牛血清白蛋白残留量 应不高于50ng/剂（附录VIII F）。 3.4.45 地鼠肾细胞蛋白残留量测定 采用酶联免疫法，应不高于24ug/ml， 并不得超过总蛋白质含量的30%。 3.5效价测定 应不低于2.5IU/剂（附录XI A）。 3.6热稳定性试验 疫苗出厂前应进行热稳定性试验。于37放置14天后，按3.5项进行效价测定。如合格，视为效价测定合格。 3.6无菌检查 依法检查（附录XII A），应符合规定。 3.7异常毒性检查 依法检查（附录XII F），应符合规定。 3.8 细菌内毒素检查 应不高于50EU/剂（附录XII E 凝胶限量试验）。 3.4.11 抗生素残留量检查 细胞制备过程中加入抗生素的应进行该项检查， 采用酶联免疫法， 应不高于10ng/ml。 4 保存、运输及有效期 于2-8避光保存和运输。自生产之日起，有效期为12个月。 5说明书