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1、氨基酸的分离纯化技术氨基酸的分离纯化技术 化学与材料科学学院2008级* * 摘要:氨基酸是一种重要的生物化工产品,它广泛应用于食品、化妆品、饲料 添加剂以及医药等领域。在氨基酸的工业生产中,其分离及纯化是的一个重要环节,在总投资费用中占有很大比例。本文对目前我国工业上常用的氨基酸分离提取方法的研究进展状况作了较全面的总结。 关键词:氨基酸;分离;纯化 1 引言氨基酸是组成蛋白质的基本单元,是生物有机体的重要组成部分,具 有极其重要的生理功能。氨基酸广泛应用于食品、饲料添加剂及医药领域,也被用作合成特殊化学物质的中间体,如低热质甜味剂、螯合剂及多肽。目前,多数氨基酸采用发酵法生产,与氨基酸发酵

2、等生产技术的发展相比,其分离与纯化的成本可占总成本的50%以上,故提高氨基酸分离的选择性和产率及对分离纯化新技术的研究有着极其重要的现实意义。 2 氨基酸的性质 氨基酸是一种具有两性官能团的物质。氨基酸分子既含有氨基又含有羧基,氨基和羧基的电离取决于溶液的pH值和氨基酸的等电点pI:在pH低于等电点pI 时,羧基的电离被抑制,氨基酸带正电荷;在pH值高于等电点pI时,氨基的电离被抑制而带负电荷;在等电点时,氨基酸的溶解度最小,最易从溶液中析出。按照侧链基团的不同,氨基酸可以分为3类:酸性氨基酸,中性氨基酸,和碱性氨基酸。而各种氨基酸的等电点不同,(酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸)。利用这个性质

3、,可以把它们进行分离纯化。 3氨基酸的分离与纯化 几乎所有的氨基酸分离纯化工艺均利用了氨基酸在不同的pH值时电荷量不同这一特性。氨基酸的分离纯化方法主要有:沉淀法、离子交换法、萃取法、吸附法、膜分离法及结晶法等。 3.1 沉淀法 沉淀法是最古老的分离、纯化方法,目前仍广泛应用在工业上和实验室中。它是利用某种沉淀剂使所需要提取的物质在溶液中的溶解度降低而形成沉淀的过程。该方法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高的优点。氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法,特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。 3.1.1 利用氨基酸的溶解度分离或等电点沉淀法 在生产中常利用各种氨基酸在水和乙醇等溶剂中溶解度的差异,将氨基

4、酸彼此分离。如胱氨酸和酪氨酸在水中极难溶解,而其它氨基酸则比较易溶;酪氨酸在热水中溶解度大,而胱氨酸则无大差别。根据此性质,即可把它们分离出来, 并且互相分开。另外,可以利用氨基酸的两性解离有等电点的性质。由于氨基酸在等电点时溶解度最小,最容易析出沉淀,所以利用溶解度法分离氨基酸时,也常结合等电点沉淀法。 3.1.2特殊试剂沉淀法 其某些氨基酸可以与一些有机或无机化合物结合,形成结晶性衍生物沉淀,利用这种性质向混合氨基酸溶液中加入特定的沉淀剂,使目标氨基酸与沉淀剂沉淀下来,达到与其它氨基酸分离的目的。较为成熟的工艺有:揩氨酸与苯甲醛在碱性和低温条件下,可缩合成溶解度很小的苯亚甲基精氨酸,分离这

5、种沉淀,用盐酸水解除去苯甲醛,即可得精氨酸盐酸盐;亮氨酸与邻一二甲苯一4一磺酸反应,生成亮氨酸的磺酸盐,后者与氨水反应得到亮氨酸;组氨酸与氯化汞作用生成组氨酸汞盐的沉淀,再经处理就可得到组氨酸。特殊试剂沉淀法虽然操作简单、选择性强,但是由于沉淀剂回收困难,废液排放污染严重,残留沉淀剂的毒性等原因已逐渐被它方法取代。 3.2 离子交换法 离子交换法是利用不溶性高分子化合物(即离子交换树脂)对不同氨基酸吸附能力的差异对氨基酸混合物进行分组或实现单一成分的分离。离子交换树脂是一种具有离子交换能力的高分子化合物。它不溶于水、酸和碱,也不溶于普通有机溶剂,化学性质稳定。离子交换树脂作为固定相,本身具有正

6、离子或负离子基团,和这些离子相结合的不同离子是可电离的交换基团(或称功能基团)。在离子交换过程中,溶液中的离子自溶液中扩散到交换树脂的表面,然后穿过表面,又扩散到交换树脂颗粒内,这些离子与交换树脂中的离子互相交换,交换出来的离子扩散到交换树脂表面外,最后再扩散到溶液中去。这样,当溶液和树脂分离后,其组成都发生了变化,从而达到分离纯化的目的。在生产中,在适当的pH条件下,如在pH=56的蛋白质水解液中,碱性氨基酸解离成阳离子,酸性氨基酸就解离成阴离子,而中性氨基酸基本上呈电中性。选择适当的交换树脂,就能实现单一的或者分组的选择性吸附。然后用不同pH的洗脱液,可把各种氨基酸分别洗脱下来。 离子交换

7、法提取氨基酸处理量大,工艺较成熟。但由于该法是利用各种氨基酸之间等电点的差异,所以只有当欲被分离的混合氨基酸之间的等电点相差较大时才能较好的分开,对于等电点相近的混合氨基酸只能部分得以分开或根本就难以分离。另外,氨基酸离子在树脂中的扩散速度较慢,因此一方面要求料液的流速较低,另一方面对于氨基酸浓度较高的料液在上离子交换柱前还要进行稀释,这就必然导致所需的设备太大。 3.3 萃取法 3.3.1 反应萃取 反应萃取就是选择适当的反应萃取剂,其解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应,生成可以溶于有机相的萃取配合物,从而使氨基酸从水相进入有机相。由于萃取剂与不同的氨基酸反应形成性质不同的萃合物,

8、扩大了那些性质相近的氨基酸的性质差别,从而达到彼此分离和提纯的目的。迄今为止,人们采用了两种不同形式的反应萃取剂,一类是在低pH值下萃取氨基酸阳离子,以酸性磷氧类萃取剂最为典型,如二(2-乙基己基)磷酸、十二烷基磷酸、十二烷基苯磺酸等。且当这些萃取剂中添加诸如煤油、四氯化碳、苯、正辛烷、异戊醇时可增加分相速度。另一种是在高pH值下萃取氨基酸阴离子、季铵盐,如甲基三辛基氯化铵是典型的阴离子萃取剂。 3.3.2 溶剂萃取 由于氨基酸是离子型化合物,它们在非极性溶剂中的溶解度很低,因此物理萃取法难以用来提取氨基酸。早期采用正己胺和含45个碳原子的低级醇作为萃取剂从蛋白水解液中萃取分离十几种氨基酸。但

9、这种萃取剂的分配系数低,分离系数差,对萃取柱的高度要求很高,一般要有3040理论级才能有满意的分离效果。 近些年来先后开发了化学萃取法分离提取氨基酸,其中有机胺类和以有机磷酸为应用最多的两大类萃取剂嗍,尤其是在有机磷酸为萃取剂的萃取过程研究很多,并开发大量的工艺过程。采用高级脂肪酸,如月桂酸、硬脂酸、棕榈酸和油酸可以有效地萃取分离碱性氨基酸。这些脂肪酸无毒、价廉。但是,碱性氨基酸比较容易用离子交换法有效地分离。萃取法分离碱性氨基酸恐怕难有商业应用前景嗍。利用氨基酸不溶于水,而易溶于液氨的性质,发展了液氨萃取技术。应用这种技术,在蒸发了氨后,可获得氨基酸的极好结晶。 化学萃取法分离混合氨基酸主要

10、也是利用不同氨基酸之间等电点差别,与离子交换法相似,只有当混合氨基酸之间的等电点相差足够大时才能被萃取分离开,对于等电点相近的氨基酸如中性氨基酸,它们的等电点几乎一致,因此化学萃取法是难以分离混合中性氨基酸的。 3.3.3 反向微胶团萃取 反向微胶团是溶在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级的一种聚体,表面活性剂的极性尾在外与非极性的有机溶剂接触,而极性头则排列在内形成极性核,极性核溶于水后就形成了“水池”。当含有氨基酸的水溶液与含反相微胶团的有机溶剂相混合时,氨基酸以带电离子状态进入反相微胶团的“水池”内或微胶团球粒的界面分子膜层内而被分离。 反相微胶团对氨基酸具有相当强的萃取能力。氨基酸

11、是以离子状态被萃取的,不同带电状态的氨基酸离子的被萃取能力不同。pH变化对氨基酸萃取分配比的影响是通过改变氨基酸在水溶液中的电离状态而影响氨基酸的总分配比的。水溶液中的离子强度变化则是影响氨基酸离子与表面活性剂之间的静电作用强弱来影响氨基酸的被萃取能力的。反相微胶团对氨基酸的萃取由于反萃用的是离子强度更大的盐溶液,所以反萃液尚需进一步将氨基酸与无机盐分离,才能得到纯的氨基酸。到目前为止大多数研究的只是适用于低盐浓度的氨基酸料液如发酵液,对于同时含有多种氨基酸且盐浓度高的料液如胱氨酸母液则不能适用。 3.3.4 液膜萃取 液膜萃取,也称液膜分离,是将第三种液体展成膜状以便隔开两个液相,利用液膜的

12、选择透过性,使料液中的某些组分透过液膜进入接受液,然后将三者各自分开,从而实现料液组分的分离.液膜分离过程是由三个液相所形成的两个相界面上的传质分离过程,实质上是萃取与反萃取的结合液膜萃取兼有溶剂萃取和膜渗透两项技术的特点,按其结构可分为乳化液膜和支撑液膜两大类。 乳化液膜为液体表面活性剂形成的球面,将溶液分为内相和外相,液膜只有几个分子厚,单位体积设备的表面积可达10003000m2/m3 。乳状液膜萃取法提取氨基酸是一种具有工业应用前景的分离氨基酸的新方法,它具有膜分离技术的优点,在常温下操作,能耗少,又不象固体膜需要高压操作,存在膜污染老化而需经常清洗、维修和更换的麻烦。但是,目前大多数

13、研究仍处于实验室阶段,未见工业报道。乳状液膜萃取法要实现工业化,还必须研究解决萃取过程的乳化问题、低毒萃取剂的选择和萃取剂残留物对产品质量影响的问题及萃取平衡和传质 速率问题。 支撑液膜是将起分离作用的液相借助毛细作用同定在多孔高分子膜中,由载体、有机溶剂(或称稀释剂)和多孔高分子膜(或称支撑体)三个组分组成,其体系由料液、支撑液膜和反萃取液三个连续相组成,支撑液膜可以使萃取与反萃取在液膜的两侧同时进行,从而避免载体负荷的限制、减少了有机相的使用量,解决了乳化液膜的乳化液稳定条件及破乳等问题。而且支撑液膜因其结构简单的特点,可用于研究确定传递机理。 3.4 吸附法 吸附法是利用恰当的吸附剂,在

14、一定的pH条件下,使混合液中氨基酸被吸附剂吸附,然后再用适当的洗脱剂将吸附的氨基酸从吸附剂上解吸下来,达到浓缩和提纯的目的。常用的吸附剂有高岭土、氧化铝、酸性白土等无机吸附剂。 吸附法具有很多优点,如:不用或少用有机溶剂;操作简便、安全,设备简单;吸附过程pH变化小等。但是吸附法的选择性差,收率低,特别是一些无机吸附剂性能不稳定,不能连续操作,劳动强度大,尤其活性炭影响环境卫生。所以吸附法曾有一段时间很少采用,几乎被其它方法所代替。但随着大孔网状聚合物吸附剂的合成和不断发展,吸附法又重新被人们重视。 3.5 毛细电渗析 电渗析也是对氨基酸发酵液脱盐浓缩的常用方法。其中毛细电渗析以集成电路为基础

15、的毛细电渗析,通过添加少量溶解聚合物,可明显提高肽缩氨酸和氨基酸的溶解与分离。毛细电渗析已成为一种应用广泛的分离大范围多种类无机或有机化合物的方法。它可以与传统的色谱分离方法相媲美。因为它的高分离效率。 3. 6 膜分离法 膜分离法可以实现混合溶液的分离是因为在膜和溶液的界面处存在以下机理:由于亲水性等原因所引起的选择性透过效应;与分子尺寸有关的筛分效应;膜与氨基酸的电荷效应。 国外膜分离工艺已应用于乳制品工业。采用反渗透浓缩乳清,使用超滤法从乳清中制备浓缩蛋白质,使用微米膜分离乳清中的蛋白质、去除脱脂乳中的细菌,使用纳滤膜去除乳清中的矿物质。近些年,又开始研究膜过滤分离蛋白质、肽和氨基酸的可

16、行性。在人体的新陈代谢过程中存在大量生物膜渗透现象。研究氨基酸的膜分离不仅可以找出有效的生物分离技术,而且有助于加深对这些新陈代谢过程的理解。 实验发现,氨基酸的溶液的pH对吸附的影响较大,而氨基酸浓度的影响却并不明显。在大部分氨基酸的膜分离研究中,pH都是最重要的考察参数。因为氨基酸为两性物质,不同pH下的解离状态不同,所带的电荷数不同。此外溶液的pH还会影响到膜上离子基因所带的电荷性质。若膜上的离子基团带负电荷,它能吸引和通过带正电荷的阳离子,而排斥带负电荷的阴离子;而带正电荷的膜则允许带负电荷的离子通过。在特定的分离要求下,选择适当类型的膜以及最佳的pH条件就成了决定分离效果好坏的关键。

17、选择膜时应尽量同时使更多的分离机理起作用,以提高分离的选择性。 其它一些条件,如氨基酸溶液的浓度,盐的浓度也会对氨基酸的选择性透过有一定的影响。研究这些条件对分离效果的影响,可以优化膜分离过程,在对pH要求过于苛刻时,应该考虑改变其它条件(比如在过滤前稀释或浓缩氨基酸溶液,引入其它种类的盐或者是先脱盐再过滤)以减小操作成本,降低对环境的污染。 3.7 结晶法 结晶是纯化物质的有效手段。发酵液和提取液采用上述方法进行初步的分离提取之后,要得到具有一定粒度分布和晶体形状的成品还必须对其进行浓缩结晶和重结晶。这也是决定最终产品质量的关键。医药用输液氨基酸必须具有较高的纯度,这就要求结晶产品具有较大的

18、粒度,以便于与母液分离;较小的晶体也易于形成聚结体,夹杂母液,降低产品的纯度。 发酵法除了得到目标氨基酸外,还会产生与目标氨基酸结构相似的其它氨基酸。通常,在有机物的结晶过程中,若杂质分子与待结晶物质的分子结构相似,即使杂质浓度很低,也会对晶体的成长和晶习产生很大影响。氨基酸分子由亲水的极性基和疏水的非极性基构成,这决定了氨基酸晶格的不对称性以及各晶面极性的差异性,进而导致结晶过程中不同晶面处固液界面性质(如界面张力、吸附性质、荷电性、润湿性等)的差异。这些因素会导致在不同溶剂、温度及杂质浓度条件下成核特性和不同晶面生长特性的复杂性和不确定性,这也是氨基酸结晶过程中产品晶型难以控制、甚至出现无

19、定形的内在原因。 为了得到具有特定粒度分布、主粒度和晶型的氨基酸晶体产品,必须对氨基酸结晶的整个过程进行良好的控制。 多数氨基酸能溶于水,难溶于有机溶剂。其在水溶液中的溶解度和存在状态受pH的影响很大。相比之下,L-脯氨酸、L-精氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-鸟氨酸盐酸盐在水中的溶解度较大;L-丙氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸的溶解度适中,且随温度变化不明显。L-胱氨酸和L-色氨酸在水中的溶解度较小。在已知溶解度的基础上选择适当的结晶方法,并使溶液过饱和度在整个结晶过程中维持在一个较低的水平。过高的过饱和度会使杂质分子嵌入到晶格降低产品纯度,而且会增加二次成核的几率。在考虑成核影

20、响的基础上运用程序降温的系统方法,可以有效地抑止二次成核。对于间歇冷却法生产氨基酸具有一定的指导意义。 在工业结晶中,生物产品的多晶型现象必须给予足够的重视。因为许多情况下,只有特定的晶体形态才具有药理作用。对于多晶型现象最有可能的解释为,何种晶型最先出现是由稳定形态和较稳定形态晶体的相对成核和成长速率决定的,也就是说动力学因素起决定作用。 许多氨基酸存在多种晶型。例如:单晶X光衍射表明,L-谷氨酸具有两种晶型,-谷氨酸(亚稳态)为颗粒状,-谷氨酸(稳态)为针形。何种晶型会优先出现与晶体析出的温度有关。从工业结晶的角度看,-型晶体更易与母液分离,更可取。母液中加入L-苯丙氨酸不仅有助于得到-型

21、晶体,还能抑制- 型晶体向-型晶体转变。 4 展望 随着氨基酸发酵技术的发展,产酸率、糖转化率等指标都有了很大的提高。我国氨基酸生产的产量、质量、规模和效益都有一个较大幅度的提高。利用我国来源充足、价格低廉的自然资源为原料生产氨基酸前景是十分广阔的。相比之下,氨基酸分离与纯化传统方法因其工艺过程复杂,费用高等原因,在工业生产中的应用有着很大的局限性。所以,在新型分离纯化方法方面的研究也也倍受重视。从相关报道的数量上来看,膜分离、液膜和反向微胶团萃取精制氨基酸研究的受关注程度更高。但是,在工业生产中大多采用的还是传统的分离技术。可见,新方法应用到实际生产中仍需进一步的完善。但新方法在操作、分离效

22、率和能力等方面己经显现出相当的优势,相信一定会有良好的应用前景。 参考文献: 1.刘艳梅,周美华. 氨基酸的分离与提纯. 浙江化工 2004,35(7) 2.张伟国,钱和. 氨基酸生产技术及其应用M. 北京:中国轻工业出版社, 1997 3.张金龙,王静康,尹秋响. 氨基酸的提取与精制. 化学工业与工程 2004,21(2) 4.白云峰,丁玉,张海燕. 氨基酸分离纯化的研究进展. 食品研究与开发 2007,28(2) 5.刘宇红. 氨基酸分离提纯的研究进展. 内蒙古石油化工 2006,32(5) 6.冯骉,王文. 纳滤技术用于氨基酸溶液的提纯. 食品与生物技术学报 2006 7. 乔丹. 双轴往复筛板塔萃取氨基酸的研究. 四川大学硕士学位论文 2007 8. 刘红,潘红春. 液膜萃取技术在生物工程领域的应用研究进展. 膜科学与技术 1998,18(3) 9. 李秀芬,陶丽佳,李溯,陈坚. 反萃取条件对支撑液膜法提取有机酸的影响期刊论文. 食品与生物技术学报 2010(1)