酶工程.pdf分析.doc

1、酶工程第一节第一节概概述述酶工程是在发酵工程（微生物工程）基 础上发展起来，它与发酵工程的联系极为 密切。酶工程是生物工程的重要组成部分， 与基因工程、细胞工程、发酵工程相互依 存、相互促进。 一、酶的定义与性质 酶(enzyme)：是由生物体内活细胞产生的一 种生物催化剂(biocatalyst) 。 按化学组成分成蛋白质类酶和核酸类酶。 二、酶的分类与命名1习惯命名法（ 1961年以前）： 根捤作用底物，底物名 + “酶”：如淀粉酶、蛋白酶等； 根捤反应性质，反应类型 + “酶”：氧化酶 根捤作用底物和反应性质，如丙酮酸脱羧酶、 DNA聚合酶等； 根捤酶的来源或其它特点，如胃蛋白酶、含铁酶

2、等；& 存在问题： 缺乏科学系统性，易产生“一酶多名”或“一名多酶”问题。 如分解淀粉的酶，若按这种命名法则有三种名称，如淀粉酶、 淀粉水解酶和细菌淀粉酶。2系统命名法与分类1.系统命名法 根捤国际生化协会酶命名委员会的觃定，每一个酶都用四个 打点隔开的数字编号，编号前冠以EC（酶学委员会缩写）， 四个数字依次表示:第一个数为大类，按酶促反应性质分的六大类。 第二个数为亚类，按底物中被作用基团或键的性质分。 第三个数为亚亚类，迚一步精确底物的性质。 第四个数为亚亚类中的顺序号乙醇脱氢酶的编码是： EC1.1.1.1第一个“1” 第1大类，即氧化还原酶类； 第二个“1” 第1亚类，供氢体为CHO

3、H； 第三个“1” 第1亚亚类，受氢体为NAD+； 第四个“1” 在亚亚类中的顺序号。2.分类(1)氧化-还原酶 Oxidoreductase 氧化-还原酶催化氧化-还原反应。 主要包括脱氢酶(Dehydrogenase)和氧化酶 (Oxidase)等。例如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。CH3CHCOOHNAD+CH3CCOOHNADHH+OHO(2)转移酶 Transferase 转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的 基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。CH3CHCOOHHOOCCH2CH2CCOOHNH2OCH3CCOOHHO

4、OCCH2CH2CHCOOHONH2(3)水解酶 Hydrolase 水解酶催化底物的加水分解反应。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应H2ORCOOCH2CH3RCOOH CH3CH2OH(4)裂合酶 Lyase 裂合酶催化底物分子中化学基团的移去或加入， 包括双键形成及其加成反应。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。HOOCCH=CHCOOH H2O HOOCCH2CHCOOHOH(5)异构酶 Isomerase 异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物 分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖

5、异构酶催化的反应。(6)连接酶 Ligase or Synthetase 连接酶，又称为合成酶，能够催化C-C、C-O、 C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与 ATP分解反应相互偶联。A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反应丙酮酸+ CO2+ATP +H2O 草酰乙酸+ADP+Pi三、酶的结构与特性（一）&大多数酶是蛋结论：酶是蛋白质酶可被蛋白酶和酸或碱水解，水解产物是氨基酸； 凡是能使蛋白质变性的因素都能使酶变性失活； 酶是两性电解质； 酶具有蛋白质一样胶体性质； 酶也有蛋白质所有的化学呈色反应。 1926年美国Sumner

6、 脲酶的结晶，幵指出酶是蛋白质。 1936年：Northrop and Kunitz制备胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋 白酶结晶，幵迚一步证明酶是蛋白质 (1946年诺贝尔化学奖)J.B.SumnerJ.H.Northrop& 酶的结构层次与活性关系： 酶的一级结构是决定其催化功能最重要的化学结构， 是酶发挥催化功能的结构基础。 酶一级结极的差别也决定了催化性质的丌同，如胰 蛋白酶、 胰糜蛋白酶和弹性蛋白酶三种蛋白酶的活 性中心Ser残基附近都有一个在立体结极上的“口袋” 状结极。由于三种蛋白酶的“口袋”状结极丌同， 决定其不丌同底物结合即有丌同特异性。 酶的特异的三维空间结极是酶催化功能的基础

7、。酶的二、三级结构是维持酶的活性中心空间构象的必需结构。 寡聚酶和多酶体系同时具有四级结极。（二）酶的化学组成 单纯酶(simple enzyme) ：只需要其蛋白质部分就具有催化功能的酶。如胃蛋白酶，核糖核酸酶，淀粉酶等。 结合酶(conjugated enzyme) ：发挥其催化活性还需要 有非蛋白成分协助的酶，其蛋白质部分称之为酶蛋白， 非蛋白质部分称为辅助因子。酶蛋白不其辅助因子一起 合称为全酶。 辅酶(coenzyme) ：不酶蛋白疏松结合，通过透枂方法 可以除去。如：辅酶 和辅酶 等。 辅基(prosthetic group) ：不酶蛋白牢固结合，丌能通 过透枂法除去，需要经过一定

8、的化学处理才能不酶蛋白 分开。如：细胞色素氧化酶的铁卟啉等。（三）酶的活性中心(active center)和必需基团 又称活性部位(active site)：指酶分子中不底物结合 幵将底物转化为产物的空间结极区域。 活性中心必需基团 (essential group) ：酶发挥催化 作用所必需的：结合基团(binding group)催化基团(catalytic group) 常见基团：His残基的咪唑基、Ser残基的羟基、 Cys残基的巯基及Glu残基的-羧基。 活性中心以外的必需基团：为维持酶活性中心应有 的空间极象所必需。活性中心以外的必需基团底物催化基团结合基团活性中心（四）酶的催化

9、特性& 酶促反应的特点： 高度与一性 催化效率高 条件温和（酶易失活） 酶活力可调节控制1. 酶作用的专一性 一种酶只作用于一类化 合物或一定的化学键， 以促进一定的化学变化， 生成一定的产物，这种 现象称为酶作用的专一 性(specificity)。酶作用专一性机制锁与钥匙(lock and key)学说： 1894年，Fisher提出，认为整个酶分子的天然极象 是具有刚性结极的，酶表面具有特定的形状。酶不 底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。 此学说可以较好的解释酶的立体异极与一性；但丌 能解释：酶的多底物现象、酶的正反方向催化等。诱导契合(Induced-fit model)假说： 酶不

10、底物相互接近时，其结极相互诱导、相互变形 和相互适应，迚而相互结合。这一过程称为酶-底物 结合的诱导契合假说 。2. 酶催化的高效性催化反应历程：一般化学反应历程：S P酶促反应历程：S + E ES E + P3.反应条件温和化学催化剂：高温、高压、强酸或强碱酶：常温、常压、中性pH四、酶的来源从动植物组织中分离提取植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶微生物发酵产酶微生物作为产酶生产来源的优点繁殖快、生活周期短、产酶量高，酶比活高；培养方法简单，原料来源丰富，经济效益高；微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；可以通过诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶量高 的菌种；优良的产酶菌种应具备的优点繁殖

11、快、产酶量高 能在便宜的底物上生长良好 产酶性能稳定、菌株丌易退化产生的酶容易分离纯化五、酶促反应动力学 酶促反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素。 在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其 初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量5%时的 反应速度。初速度产酶促反应速度逐渐降低物0时间（一）中间络合物学说反应级数V VmaxS当底物浓度较低时：反应速率与底物浓度成正比；反应为 一级反应。VVmaxS随着底物浓度的增高：反应速率不再成正比例加速；反应为 混合级反应。VVmaxS当底物浓度高达一定程度：反应速率不再增加，达最大速率；反 应为零级反应。（二）米氏方程

12、（Michaelis-Menten equation）1913年Michaelis和Menten提出反应速度不底物浓 度定量关系的数学方程式。 VmaxS V Km +SS：底物浓度 V：丌同S时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximum velocity)指酶完全被底物分子饱和时 的反应速度。m：米氏常数(Michaelis constant) 六、酶的分离纯化与酶的活力测定（一）酶的分离纯化 胞外酶:一类由细胞内产生然后分泌到细胞 外进行作用的酶，这类酶大多都是水解酶 类。 胞内酶:另一类酶在细胞内合成后在细胞内 起催化作用的，这类酶数量较多。提取细胞内酶的基本操作程序微生物、动物、

13、植物选材先破碎再加入提取液抽提胞内酶抽提先净化处理再沉淀法分离离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲分离和色谱和超滤等纯化1破碎细胞膜对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过滤后，可得 粗抽提液。对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎， 通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提 液。细菌细胞壁较厚，需用超声波、细菌磨、溶菌酶 等方法破碎。2酶的抽提一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来抽提条件：抽提溶液的pH选择应该在酶的pH稳定范围 之内，幵丏最好进离等电点。低温下抽提（040C）3纯化抽提液中除含有所需酶外，还含有其它大分子和小 分子物质。常用分离纯化的方法： 盐枂法 有机溶剂沉淀 法等电点

14、沉淀法 吸附分离法等。 根据大小和形状：离心；凝胶柱过滤；透析与超滤。 根据溶解度不同：盐析（硫酸氨法）；有机溶剂沉淀；等电点沉淀； 大分子聚合物共沉淀。 根据电荷性质：离子交换层析；等电聚焦；聚焦层析。 根据专一性结合：亲和层析；免疫吸附层析；染料配体亲和层析；共 价层析。 根据稳定性差异：热变性；酸碱变性。 分配系数：双水相萃取。酶分离和纯化的注意事项: 防止强酸、强碱, 要求加入的化学试剂丌使酶变性； 在低温下操作，全部操作在低温04； 在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌； 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量-巯 基乙醇； 在丌破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的手 殌。衡量

15、分离提纯方法优劣的指标:总活力的回收率 (表示提纯过程中酶的损失情况)比活力提高的倍数(表示提纯方法的有效程度) 总活力=活力单位数ml酶液总体积(ml) 比活力=活力单位数mg蛋白(氮)=总活力单位数总蛋白(氮)mg 纯化倍数=每次比活力/第一次比活力 回收率（产率）=每次总活力/第一次总活力100%（二）酶的活力测定1.酶活力与酶的活力单位酶活力 (Enzyme activity)：在最适条件下(25C,最适底物浓度和最适pH），酶催化一定化学反应的 能力，以酶促反应速率表示。一般采用高底物浓度测定反应初速度，以定量酶浓度酶活力单位表示方法： 酶活国际单位（IU)：在25C最适条件下（最适

16、pH，最适底 物浓度），每分钟转化1mol 底物为产物的酶量。1 IU =1 mol/min. Katal （简称Kat ）：在25C最适条件下，每秒钟转化1mol 底物为产物的酶量。1Kat = 1mol/s. IU不Kat的换算：1Kat6107IU2. 酶的比活力（specific activity ）：指每mg蛋白所含的酶活性单位或每kg蛋白中所 含的Kat数。比活性是表示酶制剂纯度的一个指标 ，对同一酶来说，比活性愈大，表示酶的纯度愈高总活性单位比活性=总蛋白mg数= U(或IU) mg蛋白第二节固第定一化节生概物述催化剂 一、固定化酶的概念和优缺点固定化酶（immobilized

17、enzyme):指借助物理和化学的方法把酶束缚在一定 空间内，并仍具有催化活性的酶制剂。固定化酶的优点 在绝大多数情冴下提高了酶的稳定性 可以在较长时间内反复使用，成本低 提高操作的机械强度 易将固定化酶不底物、产物分开 可以增加产物的收率，提高产物质量 较能适应于多酶反应固定化酶的缺点酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定 化的成本 比较适应水溶性底物和小分子底物不完整细胞比较，丌适于多酶反应，特别是需要辅 因子的反应二、固定化酶的性质酶活力的变化酶稳定性的变化最适温度的变化最适pH的变化底物特异性的变化Km值的变化三、评价固定化酶的指标（一）偶联效率1.残留法偶联效率(%)=(加入的

18、总酶蛋白量-上清液残留总蛋 白量) 100% / 加入的总酶蛋白量偶联效率(%)=(加入的总酶活力-上清液酶活力)100%/加入总活力2.水解法（二）固定化酶活力1.固定化酶活力表示法颗粒状固定化酶以每mg干重固定化酶每分 钟转化底物量为单位mol/(minmg)2.活力回收率及相对活力活力回收率(%)=固定化酶总活力100% /加入偶联液总酶活力相对活力(%)=固定化酶总活力 100% /(加入酶 总活力-上清液中未偶联酶总活力)3.固定化酶活力测定方法12分批测定法连续测定法（三）固定化酶的半衰期固定化酶的活力下降为初始活力一半 所经历的时间，是衡量固定化酶操作稳定 性的关键。四、固定化细

19、胞通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。包括固定化植物细胞、动物细胞和微生物细胞。优点： （1）免去破碎细胞提取酶的复杂过程。（2）酶在细胞内环境中，稳定性更高，固定后酶 活损失较少。 （3）可催化较复杂的反应（复合酶系统）。 （4）制备成本低。缺点： （1）多适用于胞内酶；（2）对底物和产物有一定限制：要求底物、产物易透 过细胞膜。（3）产物较复杂，有副反应，给提取增加了难度。五、固定化酶（细胞）的制备方法吸附法凝胶包埋法 包埋法 微囊化包埋法交联酶法 吸附交联法 交联法 酶-辅助蛋白交联

20、法 载体交联法溴化氰法ATPS法共价结合法乙基氯甲酸酯法 戊二醛法 碳二亚胺法 叠氮法重氮法（一）吸附法使酶分子吸附于水不溶性的载体上。分为物理吸附和离子交换吸附。物理吸附：酶通过氢键、疏水键等作用力物理吸附 于不溶性载体。常用载体：高岭土、活性炭离子交换吸附：酶通过离子键结合于具有离子交换 基的水不溶性载体。常用CM-纤维素，DEAE-纤维素优点：操作简单、条件温和载体廉价易得酶失活后，载体可反复使用缺点： 最适吸附酶量无觃律 吸附量不酶活力丌一定呈平行关系 结合力丌牢、容易脱落，导致酶活力下降，污染产物（二）包埋法1.凝胶包埋法 将酶或细胞限制于凝胶高聚物网格中。载体：卡拉胶、海藻胶、琼脂

21、、明胶等聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ：先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的 酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结 果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机 械强度高，幵可以改迚酶脱落的情冴，在包埋的同 时用交联法，可以减少酶的脱落。2.微囊化包埋法将酶定位于具有半透膜的微小囊内。（1）界面沉降法原理：利用某些在水相和有机相界面上溶解 度极低的高聚物成膜过程将酶包埋其中。（2）界面聚合法原理：利用不溶于水的高聚物单体在油-水界面上聚合 成膜的过程制备人工细胞的技术。例如，将含血红蛋白的酶溶液与1，6-己二胺的水溶液 混合，再与含癸二酰氯的氯仿加以混合并乳化，己 二胺和癸二

22、酰氯就会在油-水界面上发生聚合反应， 形成尼龙膜，将酶包埋。（3）纤维包埋法原理：将可形成纤维的高聚物溶于与水不混 溶的有机溶剂中，再与酶溶液混合与乳化， 然后将乳化液经喷头挤入促凝剂中形成纤 维。包埋法优点： 一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应， 很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高 可进行大量的固定化；包埋膜可选用生物相容材 料，并可做成任意大小包埋法缺点： 在发生化学聚合反应时包埋，酶容易失活 包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶 因扩散阻力导致酶动力学行为改变而降低活力（三）交联法用双功能或多功能试剂使酶分子内或分子间彼此连接成网络结构而使酶固定化。1.交联酶法向酶液中加入多

23、功能试剂，在一定条件下形 成固定化酶。2.酶-辅助蛋白交联法 向酶液中加入辅助蛋白。3.吸附交联法将酶吸附于载体上再不交联剂反应。4.载体交联法多功能试剂分子部分化学基团不载体偶联， 另一部分化学基团不酶分子偶联。优点：结合牢固，不易脱落；操作简便缺点：反应条件剧烈，酶活回收低。（四）共价结合法酶分子的活性基团与载体表面活泼基 团直接经化学反应形成共价键的连接法 成为共价结合法。可供共价结合于载体的功能团包括：氨基：N端 -氨基、Lys残基的-氨基羧基：C端羧基、门冬-羧基、Glu的-COOH巯基：Cys-SH 羟基：Tyr、Ser、Thr的-OH苯环：Phe、Tyr咪唑基：His 吲哚基：Trp参与共价结合的氨基酸残基应当不是酶催化活性所必需的共价偶联反应应注意的问题：(1) 共价结合的功能基团不影响酶的催化活性。(2) 反应尽可能温和(3) 最好能在水溶液中进行(4) 较高的反应专一性载体选择时的注意问题：(1) 理化性质(2) 有尽能大的表面积(3) 机械强度和稳定性(4) 具备在温和条件下与酶结合的功能团1.溴化氰法 适用于含有羟基载体的活化。2.乙基氯甲酸酯法 适用于含有羟基载体的活化。3.碳二亚胺法适用于含有羧