1、1. 主要的作用有:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。所以不能断开二硫键。:还原剂,可以断开二硫键。有些蛋白天然活性结构是二聚体或三聚体,如果加入巯基乙醇,它会还原多聚蛋白之间和内部的二硫键,这样,电泳的样品将会被完全还原成单体形式,不加的样品中则会保持聚体的形式,这时候样品在凝胶中的位置就会处于其2倍或3倍分子量的位置了。2. SDS-PAGE有非还原性(non-reduced)SDS-PAGE和还原性(reduced)SDS-PAGE之分,均是变性条件下的电泳。还原与非还原的区别是在样品处理时加或不加还原剂(如DTT或2-巯基乙醇等)。非变性(non
2、-denaturing)PAGE又称为天然(native)PAGE,操作的基本过程与SDS-PAGE相似,唯一不同的是在实验过程中尽可能保持蛋白质的天然完整性,包括避免使用任何还原剂、缓冲液中避免使用变性剂(如SDS)、样品的预处理以及电泳过程应在低温下进行等。 3. 我现在经过多方面咨询,问了几个海龟和公司的技术顾问,已经搞明白了,就是这个抗体针对的位点含有二硫键,所以所有的western试剂中都不能含有还原剂(如DTT,巯基乙醇等,包括裂解液和上样缓冲液,有些裂解液如果是买公司的,可能公司会加入还原剂)。因为还原剂会打开二硫键而变成巯基。所以抗体就不识别了。蛋白的样品处理方法有3种:还原S
3、DS处理,带有烷基化作用的SDS处理,非还原SDS处理。还原SDS处理:是常规的SDSPAGE,在上样缓冲液中加入还原剂,DTT等,打开二硫键,SDS打开非共价键,所以使蛋白还原变性为椭圆形单体。带有烷基化作用的SDS处理:烷基可以永久并且牢固的保护巯基,维持单体形成,防止蛋白再次形成二硫键的空间结构。非还原SDS处理:样品中只加入,而不加还原剂,此时二硫键不能断裂,所以蛋白没有完全去折叠。保持这一定的级结构。非还原处理因为二硫键的连接,可能会有几条多肽链连在一起,所以最后的分子量要比预期的大,可能是倍或倍。因为我的目的条带已经了,如果有多聚体,那么会大小的蛋白,转起膜来还不累死我啊。所以我已经换抗体了,换了个多抗,常规条件就可以做,方便多了,况且做的话,多抗完全可以。哈哈,已经打电话给晶美换了。