SNP开发验证的研究方法和技术路线.docx

1、SNP开发验证的研究方法和技术路线SNP开发/验证的研究方法和技术路线1分子标记：分子标记， 我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。 现在，我们没有任 何可用的标记检测我们的定位材料。即使想要验证已经定位的 QTLs，我们也需 要相对应的区间内的分子标记，尤其是 SNP 标记。1.1全基因组 S N PAffymetrix 芯片：一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高 通量。可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。 在国家玉米改良中心，有一套 3k 的 Illumina 芯片，就是用来对玉米材料进行高 通量检测，基因型检测结果通常可以

2、用来 QTLs初定位，育种材料的群体划分与 纯度鉴定以及低密度的关联分析等。 在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型 检测的芯片。目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。 而 Affymetrix 公司目前并没有相应的产品。 但是通过跟 Affymetrix 公司了解， 可 以利用 Illumina 芯片已有的结果进行开发。番茄目前测序结果显示其全基因组大小为 760Mb，而玉米为2,500Mb,但 是他们包括的基因数目 30,000个，整体情况相近。另外，番茄作为自交植物， 其 LD 的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。因此，综合

3、考虑，我建议我们可以开发 3k 芯片，应该可以满足大多数研究材料、育种材料 的基因型检测需求。 虽然目前下一代测序技术蓬勃发展， 但是对于用于基因型检 测来讲， 其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。 总之， 我们番茄处于 刚刚发展阶段， 我认为就基因型检测方面， 芯片有其很高的应用价值。 即使像玉 米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。1.2全基因组 SNPDouglas：当用 Affymetrix 芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后， 1）对于优良的 QTLs 或是基因，我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行 Douglas系统进行分子标记辅助育种，2）对

4、于需要进一步验证的QTLs，我们也 可以利用Douglas系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，而不需要再一次利用 Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图 1.1）。3）对于一些高信息量, 均匀分布在全基因的SNP分子标记，可以用来构建番茄的指纹图谱。因此，一 套完整能够与Affymetrix芯片相对应的SNP标记是必不可少的。图1.1 QTL区间上的SNP标记分布图注：蓝色为深入片段，棕色为背景染色体。1.3Douglas系统下SNP标记的开发通过建立稳定、可靠的番茄DNA提取流程与优化PCR反应体系，筛选具有 一致性、稳定性与多态性SNP分子标记引物，从而构建番茄全基因组 S

5、NP分子 标记。全基因组的SNP分子标记，可以用于番茄QTL定位群体的检测，分子标 记辅助育种的选择以及全基因组选择的群体基因型的检测。 同时，从中挑选高质量，高信息量的分子标记用于构建一套完成的番茄指纹图谱，检测品种一致性。1.3.1供试材料：22份材料的DNA用作特异性引物筛选，2份水作为NTC（ None Template Control），共计24份模板作为SNP引物的初期筛选。以上实验在 Q6仪器上进 行。对于筛选获得的一致性引物，在利用 94株番茄自交系与2份水作为模板,进一步在Douglas仪器上验证。1.3.2 DNA 提取：1.取10mg植物组织，加入研磨介质和 400卩l裂

6、解液，研磨5min，3000g离心5min。2.加入裂解液1/3体积的提取液，旋涡振荡混匀，冰浴（或置于 -20 T冰箱 中）5min，于4C, 3200旳 离心10min，吸取上清300400卩l加入到样品板中。3.按照下表在各96孔板中加入试剂：板号 板型板名成分样品及试剂体积1Microtiter deep well 96plate样品板(Lysis)样品反应液300400 卩无水乙醇400 gl2Microtiter deep well 96plate洗涤板I (W1)PW800 gl磁珠30 gl3Microtiter deep well 96plate洗涤板II (W2)80%乙醇

7、800 gl磁套4KingFisher 96 KF plate洗脱板(Elution )TE1.050100 g4.将各96孔板按仪器提示顺序放入仪器中，运行程序。5.程序运行结束后，将DNA溶液转移PCR板中并测量浓度(100ng/卩), 进行后续实验或于-20 C保存待用。133分子标记命名:分子标记全部采用统一的命名规则，这样有利于结果的修改与维护。例如:名称IDSNP位点正向引物反向引物模板序列SolBeckman-00001-V1Sol00001A/G引物合成：由上海生工公司负责引物合成1.3.4 SNP分子标记的开发：最近，Sim等人利用番茄的lllumina芯片检测410份自交系

8、与16份番茄品 种的基因型。本研究在此基础上，利用Illumina开发的7,720条探针序列，选择 其中丢失频率小于10%，等位基因频率大于10%的探针序列，获得3,500条探 针序列，作为SNP引物开发的模板序列(http:/solgenomics.ne)，每条序列的长 度为100bp, SNP上下游各50bp。初期，我们可以从3500条探针中，选取120探针序列作为模板发展引物， 这120条序列要求分布在12条染色体上而且在每条染色体上尽量保证均匀分布。 如果实验成功，我们可以逐步地将剩余的探针序列发展成为 SNP引物。1.3.5正向引物设计：由于我们需要使用KASP基因分型检测试剂盒，本

9、试剂盒对正向引物已经确 定为SNP位点上游20bp （包括SNP位点），同时需要人工加上 FAM或是HEX 序列（图1.2）。因此，我们需要单独设计反向引物。A) KASP Assay mixAllele-specific forward pirimers：.A图1.2正向引物设计1.3.6反向引物设计：利用Primer3.0软件对模板序列进行引物选择，引物参数设定如下：1引物长度为1825bp；2GC 含量为 4060%;3TM 值 5862C。如果其上述模板序列不足以满足引物开发的需要：我们可以利用剩余4,200 条探针，继续开发新的引物。另外，我们还可以利用 PCR产物测序的方式获得ga

10、p中序列，寻找新的SNP位点。1.3.6 PCR 反应：PCR反应体系：PCR反应体系需要保证均一化，这样可以满足将来在Douglas 系统下进行SNP检测。初期我们会在Q6仪器上进行预实验，摸索一致后，再在 Douglas系统中进行。Primer Mix反应体系：名称体积（卩）FAM-Primer12HEX-Primer12Reverse-Primer30ddH2O46Total100PCR反应体系:名称体积（卩）1Reactio n Mix2.5Primer Mix0.7ddH2O0.8DNA1Total5137 PCR反应程序：我们的PCR产物应该都为100bp，因此我们可以采用统一设定

11、，保证均一 化。采用两步法进行PCR反应，前期筛选引物我们设计 3个复性梯度：60C、 57C以及55C，以便找到最合适的复性温度。首先，利用60C的复性温度进行筛选：步骤参数意义125C 1:30min反应前收集荧光294C 10mi n预变性394 C 15s变性460 C 1mi n复性，延伸53-4重复40个循环625C 1:30min反应完收集荧光如果SNP引物在60C复性温度时扩增结果正常，则保留该引物在 60C复 性进行PCR反应。如果得到引物扩增效果不好，则降低复性温度，利用 57OC进 行复性。57 C复性温度PCR反应程序筛选：步骤参数意义125C 1:30min反应前收集

12、荧光294 0C 10mi n预变性394 C 15s变性457 0C 1min复性，延伸53-4重复40个循环625OC 1:30min反应完收集荧光如果SNP引物在57C复性温度时扩增结果正常，则保留该引物在 57C复 性进行PCR反应。如果得到引物扩增效果不好，则降低复性温度，利用 55C进 行复性。最终，如果55C复性温度时，反应结果不好，则该SNP引物剔除去掉。55 C复性温度PCR反应程序筛选：步骤 参数 意义125OC 1:30min反应前收集荧光294 0C 10mi n预变性394 C 15s变性455 C 1min复性，延伸53-4重复40个循环625OC 1:30min反

13、应完收集荧光138 SNP分子标记准确性验证:对于已在21份模板DNA扩增稳定的SNP引物，需要进一步在大群体中验 证其稳定性、一致性、多态性。选择84份番茄自交系或品种的DNA，通过相同 的PCR方法，验证新开发的SNP分子标记。139目标要求:番茄全基因组SNP标记：在番茄的全基因上，我们获得1200对特异的SNP 引物（平均100对/染色体）覆盖番茄的全基因组。已获得在 12份模板DNA能 够稳定扩增的SNP分子标记，全部保留。2分子标记辅助育种: 2.1 ILs 群体:如果利用现在群体不再进一步构建亚群体，ILs群体（L pennellii渐渗系群 体）76个自交系，整个群体数目较小，

14、不利于定位及 QTLs验证（图2.1）。但是对于这些材料的渗入片段都已经注视清楚，因此我们可以直接比较深入系与 M82自交系的表型差异，如果存在显著性差异，则可以定义为有深入片段引起 的表型差异。当鉴定结果与已定位的 QTLs信息一致时，我们就认为此 QTL在区间内。同时我们要检索此 QTL定位时的位置，以此为基础发展 SNP标记，用 于以后分子标记辅助育种。对于每个QTL的区间，需要发展48个SNP标记覆盖其定位区间（图1.1）， 其中，区间外两段各一个标记，内部 26个SNP标记。这样可以保证目标 QTL 被完整的应用。SNP标记的开发，此时的SNP标记只需要在ILs群体的两个亲 本中有多

15、态性就可以应用。引物设计同全基因组 SNP引物设计相同。性状验证：对于确定的QTLs，我们需要开发对应的SNP标记，利用这些标 记重新验证定位结果：图2.1深入系材料的基因型2.2IBLS 群体:IBLs群体本身就是分离群体，因此可以直接用作定位（图 2.2）。如果该群体基因型已经被鉴定，我们可以直接利用鉴定的基因型结合我们自己调查的表 型，获得QTL初定位的结果。同时，利用 Affymetrix芯片进行全基因组的SNP 检测，然后与表型数据相结合进行分析。然后，需要查看定位的 QTL区间内是否存在3 Douglas系统下SNP标记，如果满足分子标记辅助育种的应用，可以直 接应用。如果QTL区

16、间内的没有或是过少的 SNP标记，则需要重新开发 SNP 标记（标记开发同上）。ly. I. IJlww 聞划申UM inured 址Um-lij- uif L弹川屮1、宜片&血v T. l障书站ihf 岛4 iWnifL th riit SsLUnM.1 pdJdl*Efi他片iBe, e3 9C#.frr*nAHrKiri J* IcELiH图2.2 IBLs群体构建2.3性状调查:从我的观点出发，对于分子育种比较有价值研究的 QTL，应为育种家需求的性状所对应的QTL。我认为我们需要跟番茄育种家合作并讨论育种需求与育 种目标。鉴于目前ILs群体定位情况（表1,表2）,我认为我们可以从中选

17、择一些我 们能够鉴定测量的性状进行研究，例如：糖分，可溶性固形物的含量，果实形状 与大小等。总之我们要能够测量这些性状。同时，对于需要研究性状，我们需要对其进行界定，比如果实大小，我们需要测量成熟后几天的果实，作为统一的判定。以保证性状测量的准确性。宴梢用几詳体定世的豪茄果实品质基因3 QTI.Taw nOcnH/QTLG 血i* toDUBln frail 冲lit” aiivg ILpspHlmlHinft諄 mrbw of OeuEiyTTj PbencrtypeReitTeiicEITh童tiwfEbJ, MO?16弭产期2可瞄性丙带関的禽即Saxler rt *L. 300530R

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19、eIU虽空呼310Eu彌 ct d.r TM進SfykrJ f2nwesBl.m-r白?E1Gdfw n *L:KRfitil HIK.!tS.7Vander d aL JCVKnXI悴*斡芋衣出4为了能够获得准确的田间试验数据，应该采用良好的田间试验设计。在此， 建议：现有的两个群体材料都为永久性群体， 一般可以采用随机区组或是裂区设 计，每个系23个重复，鉴定表型。因此我认为我们应该进行田间实验设计，保 证表型数据的准确性。3 SNP指纹图谱构建:通过已经获得的全基因 SNP分子标记，进一步可以从中挑选出稳定、一致的48对SNP分子标记构建番茄的指纹图谱。挑选参数为: 3.1 等位基因频率

20、(Allele Frequency)在一个二倍体的某特定基因座上某一个等位基因占该基因座上等位基因总 数的比率，是群体遗传结构的一个最基本的尺度， 该基因座上所有等位基因的频 率之和为1,对于SNP分子标记，一般只包括两种等位基因。因此，其等位基因 频率在0.5时为最适宜值。3.2 多态性信息含量(Polymorphism In formation Conten t， PIC): 多态信息量(Polyt no rphism In formation Con te nt, PIC)由 Botstei n 等在 1980 年提出，用来评价一个多态性基因座使用价值的一个量化概念。 PIC由该基因座的等位基 因数、等位基因频率分布两个因素决定。 标记基因座的等位基因数越多、 各等位 基因频率分布越均匀，PIC越大。i=第j个分子标记中第i个等位基因 n =第j个分子标记的等位基因的数目 p=等位基因频率3.3核心引物分组：另外，还需要根据SNP分子标记在全基因上的分布进行筛选，要求4个SNP 分子标记/染色体，并且要求其分子标记之间的距离越远越好。在玉米中，利用 40对SSR引物构建指纹图谱，他们针对这40对引物分成两组。我们可以采用相 同策略，将我们的48对引物分成两组，用于将来的检测。4经费预算:项目名称单价总价PCR引物1兀/碱基PCR反应试剂盒DNA提取试剂盒