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1、正文模板面上项目基于JAKs/STATs信号通路介导的脊髓IL-8动态参与骨癌痛的机制研究正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；骨癌痛（Cancer-induced bone pain, CIBP）是临床常见癌症性疼痛，也是肿瘤发生骨转移时最常见的症状之一1，常见于乳腺癌、前列腺癌、肺癌等晚期癌症骨转移病人，发病率高达75%90%。临床上主要表现为：持续进行性的基础痛、爆发痛和异样疼痛1,2

2、。因其在癌症患者中发病率高、疼痛剧烈、甚至引起其它系统病变，从而导致患者生活质量的严重降低和死亡率的显著升高3。然而，目前对骨癌痛的临床治疗手段有限，现有镇痛药物具有不可克服的毒副作用（如嗜睡、便秘、呼吸抑制等），使得这一问题显得尤为突出。为了改善患者的生活质量并延长患者的生存时间，加强对骨癌痛防治的研究成为当前迫切需要解决的难题。趋化因子在损伤的神经、背根神经节（Dorsal root ganglia，DRG）、脊髓和大脑中都参与疼痛的发生，对骨癌痛的形成也具有重要作用4。作为趋化性细胞因子的重要成员白细胞介素8(IL-8), 又称为趋化因子CXCL8，是由Th1细胞分泌的细胞因子，通过其受

3、体CXCR1/2产生多种生物学功能，包括促进炎症细胞趋化和诱导细胞增殖，在癌症中高度表达5。早期发现中性粒细胞是其作用的靶细胞，能特异性趋化中性粒细胞进入炎性组织，促使其脱颗粒，产生超氧阴离子，引起呼吸暴发；并激活炎性细胞，促进炎性介质释放(IL-1、TNF-)；形成慢性炎症6。随着研究的深入，发现IL-8可作用于不同细胞包括神经细胞，其受体CXCR1/2不仅表达于中性粒细胞、单核细胞、T细胞，还表达于神经系统神经元及胶质细胞表面7，8，在临床研究中发现，患者外周血IL-8含量的高低与疼痛程度相一致，IL-8含量越高，疼痛程度越重9。而针刺疗法可促进了外周血IL-8含量的下降，从而促进疼痛的缓

4、解。所以，IL-8在疼痛的形成中也起重要作用10。近年来，又发现肿瘤细胞中IL-8的表达明显升高。研究发现，IL-8可诱导内皮细胞的迁移和增生来介导肿瘤组织血管增生，从而促进肿瘤的发生5。Freund, A等也发现给予IL-8可通过促进胶原酶的活性增强肿瘤细胞的侵袭力11。那么，骨癌痛作为骨肿瘤细胞增殖所诱发的烈性疼痛,将其属性与IL-8的作用特点相结合，IL-8是否在外周及中枢水平参与调节骨癌痛的发生发展，目前还知之甚少。JAKs/STATs信号通路是众多趋化性细胞因子信号转导的共同途径，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡以及炎症等过程，具有激活促进各种疾病的发生发展，包括各种实体肿瘤、淋巴瘤、白

5、血病以及炎症性疾病等疾病，针对JAK/STAT信号通路的靶向治疗是目前研究热点12。JAK/STAT信号通路作为一条重要的信号转导途径，各种细胞因子通过JAK/STAT信号通路参与介导机体各种生理病理反应，多种因素可以从不同靶点对其进行调节，在生理条件下，各种细胞因子反应在JAK/STAT信号通路的精确调控下维持内环境的稳定，在病理条件下，各种细胞因子的反应失控，导致细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节异常，促进各种疾病的发生发展13。随着对JAK/STAT信号通路调控环节的深入研究，不仅有助于我们理解人体相关疾病的发生机制，而且有助于寻找一些疑难杂症治疗的新靶点、药物研发的新靶向。在慢性坐骨神经

6、压迫损伤（Chronic constrictive injury，CCI）模型早期，免疫荧光双标显示pSTAT3与小胶质细胞的标志物(ITGAM，Iba1)共存，但2天后才与神经元(NeuN)或者星形胶质细胞(GFAP)标志物共存，鞘内注射JAK2抑制物AG490后，可阻断JAK2/STAT3信号传递，并降低由损伤神经元产生的活化转录因子- 3(ATF-3)，由此可推测JAKs/STATs信号通路发挥的作用也与胶质细胞的活化密切相关14。NMDA受体存在于中枢神经系统和外周神经系统中神经元表面，是疼痛信号传递的主要受体之一，对中枢敏化的形成具有直接作用15。中枢敏化对骨癌痛的形成和维持同样具有

7、重要作用16，我们的预实验也验证了结论。然而，在骨癌痛的发生发展中，IL-8是否激活JAKs/STATs信号通路，增加神经元NMDA受体钙离子内流导致中枢敏化形成，从而诱发或维持骨癌痛的形成，对其进行研究，将对骨癌痛发病的分子机制及治疗具有重要的意义。基于以往的研究资料和前期的研究结果，首先，本项目将比较骨癌痛组和对照组脊髓痛敏感性神经元的电活性和痛阈值的变化，以及IL-8、CXCR1/2、STATs、pSTATs、TNF-、IL-1、COX-2、IL-6等在脊髓细胞定位分布和表达变化。同时，使用CXCR1/2、STATs、pSTATs等的拮抗剂来研究胶质细胞、炎症因子的表达、C纤维诱发脊髓背

8、角神经元电活动性及骨癌痛大鼠的痛阈值变化。最后，我们还将通过脊髓薄片膜片钳方法来研究骨癌痛大鼠的c-NMDAR电流变化以及IL-8、CXCR1/2、STATs、pSTATs等的拮抗剂对该电流变化的影响，深入阐明IL-8通过JAKs/STATs通路，增强神经元NMDA受体磷酸化介导Ca2+内流，引起神经元的敏感化，从而导致骨癌痛的发生和形成。寻求发现一条新的信号通路在骨癌痛发生中的作用从而揭示其形成机制，与此同时也为骨癌痛的干预治疗提供新的治疗靶点。参考文献1 Clohisy DR，Mantyh PWBone cancer pain JCancer, 97 (3 Suppl)：866-873,

9、20032 Clohisy DRMetastatic skeletal diseaseOrthopaedics M1stedLondon：Mosby lnc, 1078-1088, 2002. 3 Cleeland CS. The measurement of pain from metastatic bone disease: capturing the patients experience J. Clin Cancer Res, 12 (20 Pt 2): 6236-6242, 2006. 4 Zhou, Y. Q., Gao, H. Y., Guan, X. H., Yuan, X.,

10、 Fang, G. G., Chen, Y., & Ye, D. W. Chemokines and Their Receptors: Potential Therapeutic Targets for Bone Cancer Pain J. Curr Pharm Des, 21(34): 5029-33, 2015. 5 Sugimoto M, Yamaoka Y, Furuta T. Influence of interleukinpolym or phisms on development of gastric cancer and pepticulcer J. World J Gast

11、roenterol, 16(10): 1188-2000, 2010. 6 Long, X., Ye, Y., Zhang, L., Liu, P., Yu, W., Wei, F., Yu, J. IL-8, a novel messenger to cross-link inflammation and tumor EMT via autocrine and paracrine pathways (Review) J. Int J Oncol, 3234-7, 2015.7 Goczalik, I., Ulbricht, E., Hollborn, M., Raap, M., Uhlman

12、n, S., Weick, M., Francke, M. Expression of CXCL8, CXCR1, and CXCR2 in neurons and glial cells of the human and rabbit retina J. Invest Ophthalmol Vis Sci, 49(10): 4578-4589, 2008.8 Nguyen, D., & Stangel, M. Expression of the chemokine receptors CXCR1 and CXCR2 in rat oligodendroglial cells J. Brain

13、 Res Dev Brain Res, 128(1): 77-81, 2001.9 Pedersen, L. M., Schistad, E., Jacobsen, L. M., Roe, C., & Gjerstad, J. Serum levels of the pro-inflammatory interleukins 6 (IL-6) and -8 (IL-8) in patients with lumbar radicular pain due to disc herniation: A 12-month prospective study J. Brain Behav Immun,

14、 46, 132-136, 2015. 10 Ang, D. C., Moore, M. N., Hilligoss, J., & Tabbey, R. MCP-1 and IL-8 as pain biomarkers in fibromyalgia: a pilot study J. Pain Med, 12(8), 1154-1161, 2011. 11 Freund, A., Chauveau, C., Brouillet, J. P., Lucas, A., Lacroix, M., Licznar, A., Lazennec, G. IL-8 expression and its

15、possible relationship with estrogen-receptor-negative status of breast cancer cells J. Oncogene, 22(2), 256-265, 2003. 12 Ghoreschi K, Laurence A, O, Shea JJ. Janus kinases in immune cell signaling J. Immunol Rev, 228(1): 273-287, 2009.13 Schindler C，Levy DE，Decker TJAK-STAT signaling：from interfero

16、ns to cytokines JJ Biol Chem, 282 (28)：20059-20063, 2007. 14 Tsuda M，Kohro Y Yano T, et a1JAKS1 r3 pathway regulates spinal astrocyte proliferation and neuropathic pain maintenance in rats J. Brain, 134: 1127-1139，201115 Castrillon, E. E., Cairns, B. E., Ernberg, M., Wang, K., Sessle, B. J.,Arendt-N

17、ielsen, L., & Svensson, P. Effect of a peripheral NMDA receptor antagonist on glutamate-evoked masseter muscle pain and mechanical sensitization in women J. J Orofac Pain, 21(3), 216-224. 20, 2007. 16 Liu, Y. N., Yang, X., Suo, Z. W., Xu, Y. M., & Hu, X. D. Fyn kinase-regulated NMDA receptor- and AM

18、PA receptor-dependent pain sensitization in spinal dorsal horn of mice J. Eur J Pain, 18(8), 1120-1128, 2014. 2项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题（此部分为重点阐述内容）；2.1研究内容：2.1.1. 分子水平上探讨IL-8通过JAK/STAT信号通路介导NMDA受体磷酸化增强（1）骨癌对大鼠脊髓背角神经元pNR1、IL-8、CXCR1/2、JAK 、p-STATs表达和分布的影响：运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化、荧光双标法检测pNR1、IL-8、

19、CXCR1/2、JAK 、p-STATs表达和分布，探讨骨癌痛大鼠上述蛋白分子的表达变化及其细胞定位。（部分完成）（2）IL-8/CXCR1/2对骨癌痛大鼠脊髓背角p-STATs、pNR1表达的影响骨癌痛大鼠鞘内注射IL-8中和抗体后，运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化分别检测p-STATs、pNR1的表达，探讨IL-8调控骨癌痛大鼠上述蛋白分子的表达。骨癌痛大鼠鞘内注射CXCR1/2抑制剂后，运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化分别检测p-STATs、pNR1的表达，探讨骨癌痛大鼠CXCR1/2调控上述蛋白分子的表达。（3）p-STATs对骨癌痛大鼠脊髓背角

20、pNR1表达的影响骨癌痛大鼠鞘内注射p-STATs抑制剂后，运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化检测pNR1的表达，探讨骨癌痛大鼠JAK/p-STATs通路调控NMDA受体磷酸化。骨癌痛大鼠p-STATs抑制后鞘内注射IL-8，运用RT-PCR、Western Blot、免疫组化法分别检测TNF-、IL-1、IL-6、pNR1的表达，探讨骨癌痛大鼠p-STATs介导IL-8调控pNR1的表达。2.1.2. 在整体动物模型上探讨IL-8通过JAK/STAT信号通路诱导骨癌痛大鼠痛觉过敏（1）IL-8对骨癌痛大鼠和对照组大鼠痛阈的影响：骨癌痛大鼠和对照组大鼠鞘内注射IL-8中和抗体

21、后测其痛阈值，探讨IL-8在骨癌痛大鼠痛敏形成中的作用。（2）CXCR1/2、p-STATs对骨癌痛大鼠痛阈的影响：骨癌痛大鼠鞘内分别注射CXCR1/2、JAK、p-STATs特异性拮抗剂测其痛阈值与对照组比较，探讨CXCR1/2、JAK、p-STATs参与骨癌痛大鼠痛敏的形成。（4）CXCR1/2、JAK、p-STATs分别抑制后IL-8对骨癌痛大鼠痛阈的影响：骨癌痛大鼠CXCR1/2、JAK、p-STATs分别抑制后鞘内注射IL-8测其痛阈值与对照组比较，探讨IL-8通过CXCR1/2、JAK/STATs参与骨癌痛大鼠痛敏的形成。2.1.3. 在整体动物模型上探讨IL-8通过JAK/STA

22、T信号通路介导骨癌痛大鼠脊髓背角C纤维诱发放电（1）骨癌对大鼠脊髓背角C纤维诱发放电的影响：运用在体电生理细胞外记录痛诱发C纤维神经元脊髓放电，探讨骨癌痛大鼠C纤维神经元脊髓放电的变化。（2）IL-8对骨癌痛大鼠和对照组大鼠脊髓背角C纤维诱发放电的影响：运用在体电生理细胞外记录骨癌痛大鼠痛诱发C纤维神经元放电后鞘内注射IL-8中和抗体观察C纤维神经元放电的前后变化并与对照组比较，探讨IL-8对骨癌痛大鼠脊髓背角C纤维诱发放电的影响。（3）CXCR1/2、JAK 、p-STATs对骨癌痛大鼠脊髓背角C纤维诱发放电的影响：分别运用在体电生理细胞外记录骨癌痛大鼠痛诱发C纤维神经元放电后鞘内注射CXC

23、R1/2、JAK 、p-STATs特异性拮抗剂后观察C纤维神经元放电的前后变化并与对照组比较，探讨CXCR1/2、JAK 、p-STATs参与骨癌痛大鼠脊髓背角痛敏感神经元敏感化的形成。（4）CXCR1/2、JAK 、p-STATs分别抑制后IL-8对骨癌痛大鼠脊髓背角C纤维诱发放电的影响：骨癌痛大鼠CXCR1/2、JAK 、p-STATs分别抑制后，鞘内注射IL-8记录脊髓背角C纤维神经元细胞外诱发放电并与对照组比较，探讨IL-8通过CXCR1/2、JAK 、p-STATs参与骨癌痛大鼠脊髓背角痛敏感神经元敏感化的形成。2.1.4. 在离体脊髓切片上探讨IL-8通过JAK/STAT信号通路促

24、进脊髓神经元c-NMDA受体电流的增大（1）骨癌对大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响：运用离体脊髓切片膜片钳法记录骨癌痛大鼠c-NMDA受体电流并与对照组比较，探讨骨癌对脊髓背角c-NMDA受体电流的影响。（2）IL-8对骨癌痛大鼠和对照组大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响：运用离体脊髓切片膜片钳法记录骨癌痛大鼠c-NMDA受体电流后灌流IL-8中和抗体观察c-NMDA受体电流变化并与对照组比较，探讨IL-8对骨癌痛大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响。（3）CXCR1/2、JAK 、p-STATs对骨癌痛大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响：骨癌痛大鼠脊髓切片分别进行CXCR1/

25、2、JAK 、p-STATs特异性拮抗剂孵育后，运用离体脊髓切片膜片钳技术记录c-NMDA受体电流并与对照组比较，探讨骨癌痛大鼠脊髓背角CXCR1/2、 JAK 、p-STATs对神经元c-NMDA受体的电流影响。（4）CXCR1/2、JAK 、p-STATs分别抑制后IL-8对骨癌痛大鼠脊髓背角c-NMDA受体电流的影响：骨癌痛大鼠脊髓切片分别进行CXCR1/2、JAK 、p-STATs特异性拮抗剂孵育后，运用离体脊髓切片膜片钳技术灌流IL-8，记录c-NMDA受体电流变化并与对照组比较，探讨骨癌痛大鼠脊髓背角IL-8通过CXCR1/2、JAK 、p-STATs影响神经元c-NMDA受体电流

26、的改变。2.2研究目标：通过研究本项目将发现胫骨骨癌导致脊髓神经元敏感性增强，脊髓背角内IL-8释放增加，IL-8作用其受体CXCR1/2通过JAK/STAT信号通路又介导神经元NMDA受体的活性从而进一步使神经元发生敏感性，该过程形成了一个诱导和维持脊髓背角痛敏感神经元敏感化的通路，为骨癌痛镇痛药物的研发提供新的理论依据。2.3拟解决的关键问题：首先，本项目将比较骨癌痛组和对照组大鼠脊髓痛敏感性神经元的电活性和痛阈值的变化，以及神经元NMDA受体、IL-8及其受体CXCR1/2、JAK/STAT的分布和表达变化。同时，使用IL-8、CXCR1/2、p-STATs的拮抗剂来研究C纤维诱发脊髓背

27、角神经元电活动性及骨癌痛大鼠的痛阈值变化。最后，我们还将通过脊髓薄片膜片钳方法来研究骨癌痛大鼠的c-NMDAR电流变化情况以及IL-8/CXCR1/2、JAK/STAT通路对该电流变化的影响，深入阐明脊髓背角内维持痛敏感神经元敏感化的发生和形成机制。3拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）；3.1研究方案（1）Walker-256乳腺癌细胞腹水传代：将冻存于液氮中的Walker-256乳腺癌细胞37水浴1min内快速复苏，用Hanks液洗涤3次，离心吸弃上清液，细胞计数后，取0.5ml（约1107肿瘤细胞数）种植于SD大鼠腹腔，饮水中加地塞米松12支，

28、常规饲养710天可出现大量腹水（50200ml）；腹部局部消毒后抽取腹水1020ml，用Hanks液或1640培养液（未加小牛血清）洗涤3次去除异体蛋白，第3次洗涤前吸取癌细胞混合液及200l清洗液便于细胞计数，制备浓度约2107个/ml的癌细胞悬液。注射10l（即2105细胞数）癌细胞悬液到大鼠左胫骨骨髓腔内。（2）模型制备：建立骨癌痛模型：大鼠腹腔注射4水合氯醛400mg/kg麻醉后，于左侧胫骨上端内侧纵向切开皮肤约5mm，用5号注射器针头在切口与骨面呈45向干骺端方向穿刺打孔，随后用微量注射器抽取癌细胞悬液10l(即2105细胞数)，匀速缓慢注入骨髓腔内，停留30s后拔出注射器，用医用胶

29、水封堵针孔及切口全层。含灭活的Walker-256乳腺癌细胞的Hanks液10l注入的大鼠作为对照组。（3）鞘内置管模型制备：胫骨癌痛大鼠模型制备2天后，行脊髓蛛网膜下腔置入PE-10微导管，置管时可见清亮脑脊液流出，第2天鞘内注射2%利多卡因10l，30s内出现双下肢麻痹表明置管成功，有肢体瘫痪、跛行、感染、活动异常或导管脱出的大鼠或其数据摒弃不用。（4）大鼠脊髓标本处理：大鼠腹腔注射4%水合氯醛600mg/ml深麻醉，仰卧固定，剪开胸腔暴露心脏，将灌注针于心尖部插入至主动脉根部，血管钳固定灌注针，剪开右心耳，快速灌注生理盐水200300ml，待流出透明液体时，再缓慢灌注0.1mol/L P

30、BS(含4多聚甲醛)200300ml，2h后大鼠四肢僵硬停止灌注。（5）痛觉行为学（机械性痛觉过敏）：分别测定骨癌痛大鼠和对照组大鼠的痛阈值。：分别测定鞘内注射CXCR1/2抑制剂后骨癌痛大鼠及鞘内注射DMSO后骨癌痛大鼠的痛阈值。：分别测定鞘内注射p-STATs特异性抑制剂后骨癌痛大鼠及鞘内注射DMSO后骨癌痛大鼠的痛阈值。清醒大鼠在室温、安静状态下适应10-20 min后，手抓大鼠并把左后肢足背部置于压爪仪压杆下，并在足背部皮肤做一标记，脚踩踏板不断加大压爪强度，当大鼠出现缩腿反应时，记下此时的游标读数。当游标达到25 g，而大鼠仍无反应时便停止压爪，以免损伤皮肤，并以25 g作为最高痛阈

31、。痛阈测定时连测三次，每次间隔1-2 min，取三次的平均值作为机械痛阈值。（6）免疫组织化学：实验大鼠，麻醉后灌流，取脑组织，4多聚甲醛固定46 h，30蔗糖脱水，4冰箱过夜。冰冻冠状切片(厚约30 m)，放入20孔有机玻璃板中，滴加一抗，4孵育24 h，0.01 mol/L PBS冲洗3遍5 min；暗室内加入二抗室温反应1.5 h，0.01 mol/L PBS冲洗3遍5 min；将切片贴于载玻片上，迅速转移至荧光显微镜下( 200)进行观察并拍照，随机选择5张切片，采用Image-Pro Plus 6.0软件，计数小胶质细胞，取其平均值。（7）RT-PCR：测定同侧脊髓骨癌背角NR1、I

32、L-8、CXCR1/2 mRNA的表达水平，Trizol试剂一步法提取总RNA，取RNA 5 ttg，以MMLV酶逆转录为cDNA。加入上述蛋白分子上下上游引物；-actin上游引物为：5-GAGACCTrCAACACCCCAGC-3 ，下游引物为：5-CACAGAGTACTYGCGCTCAG-3 ，产物长 度281 bp。PCR过程：94 5 min预变性，94 1 min变性，55 1 min退火，72 1 min延长，72 7 min再延长。-actin在35个内循环中的退火温度选用58。反应结束后，行2琼脂凝胶电泳，利用Labworks凝胶成像分析系统观察分析PCR条带，以目标蛋白与-actin灰度值的比值反映目标蛋白mRNA的表达水平。（8）Western blotting检测：Western blotting检测骨癌痛大鼠及对照组