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1、western blot操作规范Western blot 操作流程1. 样品的准备a收集蛋白样品 (Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用相应的蛋白抽提试剂盒进行抽提。 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Wes

2、tern及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。b样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2或5的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液的配置 100或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 如果不立即电泳，样品可放置于-20或者-80保存。2. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) a准备SDS-PAGE凝胶1.按产品说明将制胶玻璃板装配到制胶器上。(注意一定要将玻璃板洗净，最后 用ddH2

3、O冲洗一遍，晾干)2.装配好后，可加水检查是否密封，防止漏胶。3.根据表1确定凝胶浓度体积，按表3配制分离胶溶液。按表中成分顺序加入烧杯配制。4.小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，灌到足够高度。注意：为浓缩胶留有足够空间（分离胶面距加样孔底1cm，即梳齿长再加1 cm。）。5.轻轻在顶层加入几毫升覆盖物（无水乙醇、去离子水或正丁醇），以阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用。6.凝胶充分聚合。时间约3060min, 聚合后在覆盖层和凝胶的界面间有一清晰的折光线。7.倒掉覆盖层，用无离子水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残存的液体。8.按表2配制浓缩胶，并注入分离胶上端。插入梳子。插入梳

4、子子应小心避免梳子顶端留有气泡。9.浓缩胶充分聚合，时间3060min。10.浓缩胶聚合好后，将制胶装置从基座上取下，放入电泳槽。11.上下槽均加入新鲜Tris-甘氨酸电泳缓冲液（至少负极槽使用新鲜电泳缓冲液）。12.小心拔出梳子，若孔间隔离凝胶条倾斜，用小号注射器针头扶正。13.用电泳缓冲液冲洗梳孔。b上样与电泳 将蛋白样品解冻后直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。按照一定顺序在加样孔中加入样品，根据SDS-PAGE电泳玻璃板间隙厚度不同，选择加入样品量，一般0.75 mm间隙15孔的上样量10 l/孔，1 mm间隙10孔的上样量20 l/孔。上样量根据实际经验自己掌握。1.上样前将胶

5、板下的气泡赶走。2.所有蛋白样品调至等浓度后上样，最外两泳道易跑歪，尽量不用，Marker加在最边上的加样孔中。3.电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,电压设定为50V左右，而在溴酚蓝进入分离胶时使用高电压恒压电泳，电压设定为120V左右。电泳过程中最好设置定时时间，以免电泳过头。4.在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。3.转膜（槽转印）卸下电泳装置，用绿色的塑料片轻轻撬开玻璃板，用塑料铲或者干净的刀片小心切去浓缩胶，保留分离胶，在分离胶左上切角（以区分胶的上下）为避免污染，请佩戴手套接触凝胶、印

6、迹膜和滤纸1. 相对于每一张凝胶，需要按尺寸裁剪出一张PVDF膜（5.5 cm 8.5 cm）、两张滤纸（6.5 cm 10 cm）。将切好的PVDF膜浸入甲醇中不少于15 min 才可以使用。2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转印夹、两块纤维衬垫、滤纸（2张超厚滤纸或者6张普通滤纸）和浸泡过的PVDF膜。3. 打开转印夹将黑色的一面浸入转膜缓冲液中，从下往上依次放入纤维衬垫、滤纸、分离胶、PVDF膜、滤纸、海绵。注意：整个过程在转膜缓冲液中进行。在铺每一层时都要用玻璃棒轻轻赶走气泡，尤其是胶和膜之间一定不能留有气泡。4. 将转印夹合好，放到转印槽中，要使转印夹的黑面对着转印槽的黑面，转印夹的红

7、面对着转印槽的红面。转印槽通电后会产热，在转印槽有较大空隙的一边放入冰盒（事先置于- 80 ）用来降温。将整个电泳槽放入一个大的容器中（大的塑料泡沫盒子最好），在这个容器中盛满冰。接通电源，设定转膜电流为300mA，转印30 min60 min（目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间 越长）。5. 关闭电源，取出膜，然后用ddH2O漂洗12 min。注意膜上要做好标记。4.封闭及杂交1. 将膜放在塑料盒子，加入适量封闭液，于37 恒温振荡器上放置1 h，或4过夜。必要时可先用丽春红染色（2 % 乙酸， 0.5 % 丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白m

8、arker则可省略此步骤。2. 参考一抗说明书，按照适当比例用封闭液稀释一抗。将膜转入干净密闭的塑料小盒中，加入用封闭液稀释的一抗，于37 或室温孵育反应1 h或者4 过夜。3. 一抗孵育结束后，小心地倾倒出一抗杂交液，用PBST或者TTBS漂洗后再浸洗3次，每次1015 min。4. 参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释二抗，加入稀释好的二抗，继续在37 或室温孵育反应30 min60 min。5. 二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次1015 min。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。5. ECL化学发光，显影，定影 （1） 将A和B两种试剂

9、等量（常用各500l）在5ml离心管中等体积混合；打开X-光片夹，铺上保鲜膜，将NC膜面朝上放于保鲜膜上，滴加此混合液1-3min后（见到荧光），用保鲜膜包好。 （2）将1显影液，自来水和定影液分别到入盘中；在红灯下 取出X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min到5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果； 曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为12min（2025），温度过低时（低于16

10、）需适当延长显影时间； 显影结束后，先用自来水洗一下X-光片，然后再放到定影液中进行定影（这样可以延长定影液使用时间，从而节约定影液）。定影时间一般为510min，以胶片透明为止； 6.凝胶图象分析：将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。 附录:各种溶液和试剂的配置SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围（表 1）不同体积SDS-PAGE 浓缩胶的配方（表 2）不同浓度不同体积SDS-PAGE 分离胶的配方（表 3）各种溶液和试剂的配置1.30%聚丙烯酰胺单体贮液： 14.55 g丙稀酰胺 + 0.45 g N，N-甲叉双丙稀酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液

11、变成透明，再用双蒸水稀释至50 ml，0.45m滤膜过滤。用棕色瓶储存于 4。注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。（参照分子克隆二版P924）2.分离胶缓冲液：1.5M Tris-HCl, pH8.8。 配制方法：9.08 g Tris溶解在40 ml 双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值8.8，再用双蒸水加至50ml。4保存。3.浓缩胶缓冲液：1.0M Tris-HCl, pH6.8。 配制方法：6.06 g Tris溶解在40 ml双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节

12、pH值6.8，再用双蒸水加至50 ml。4保存。4.10% SDS（十二烷基硫酸钠）(电泳级)：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。5.10%过硫酸铵 (AP)：0.1 g过硫酸铵溶解于 1ml双蒸水中。过硫酸铵会缓慢分解，应每周新鲜配制。6.TEMED (N，N，N，N-四甲基乙二胺)：原液使用。应使用电泳级TEMED。7.5Tris-甘氨酸电泳缓冲液：125mM Tris，1.25M甘氨酸，0.1% (m/v) SDS，pH8.3。配制方法：在900 ml去离子水中溶解15.1 g Tris碱和94 g甘氨酸(电泳级) (pH8.0)，然后加入50 ml 10% SD

13、S（电泳级），用去离子水补至1000 ml。8.Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mM tris，250mM甘氨酸，0.1% (m/v) SDS，pH8.3。9.1SDS样品缓冲液：50mM Tris-Cl (pH6.8)，100mM DTT, 2 (m/v) SDS，0.1(m/v)溴酚蓝，10%（v/v）甘油。不含DTT的1SDS样品缓冲液可在室温保存。DTT配成1M 的贮存液，临用前加入。5 ml配制方法1称量下列试剂置于10ml 塑料离心管中。1 M TrisCl (pH 6.8)1.25 mlSDS （电泳级）0.5 g溴酚蓝（BPB）25 mg甘油2.5 ml2加去离子水溶解后定容至

14、5 ml。3小份（500 ul/份）分装后于室温保存。4使用前将25 ul的2-ME加到每小份中。5加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。10.2SDS上样缓冲液：100mM Tris-HCl (pH6.8)，200mM DTT，4% (m/v) SDS，0.2% 溴酚蓝，20%甘油。11.5SDS样品缓冲液：250mM Tris-HCl (pH6.8)，500mM DTT，10 (m/v) SDS，0.5(m/v) 溴酚蓝，50%（v/v）甘油。不含DTT的5SDS样品缓冲液可在室温保存。DTT配成1M 的贮存液，临用前加入。12. 预染蛋白质分子量标准物（ma

15、rker）13.考马斯亮蓝凝胶染色液：将0.25 g考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）R-250溶解在90ml甲醇：水（1：1，v/v）和10ml冰乙酸中，用滤纸过滤，室温保存。14.1 mol/L DTT (20 ml)1称取3.09 g DTT，加入到50 ml塑料离心管中。2加20 ml的0.01 M NaOAc (pH5.2)，溶解后使用0.22m滤器过滤除菌。3分装后20 保存。（参照分子克隆二版P884）15.3 M 醋酸钠 (NaOAc) (100 ml)1称取40.8 g NaOAc3H2O置于100200ml烧杯中，加入约40ml的去离子水后搅拌溶

16、解。2加冰醋酸调节pH值至5.2。3定容至100 ml，高压灭菌后室温保存。（参照分子克隆二版P884） 0.01 M NaOAc (pH5.2) 参照此配方配制。16.10转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存, 用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。 通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀） 17.10TBS缓冲液Tris（MW121.14） 24.2g NaCl 80.0g 蒸馏水至 1000ml （浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温

17、保存。 18.1TBST缓冲液10TBS缓冲液 100ml 蒸馏水 900mlTween-20 1 ml因Tween-20较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。溶解后室温保存。19.封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)1TBST缓冲液 95-100 ml脱脂奶粉 5g溶解后4保存，可于一周内使用。20.丽春红储存液（10）丽春红 2 g三氯乙酸 30 g磺基水杨酸 30 g加水至 100 ml。用1份上述储存液加9份去离子水即成丽春红使用液，使用后应予废弃。21.显影液与定影液表 1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 双丙烯酰胺：丙烯酰胺为1：29 浓度（%）线性分离范围（K

18、D） 1512-43 1016-48 7.536-94 5.057-212表 2 不同体积SDS-PAGE 浓缩胶的配方表3 不同浓度不同体积SDS-PAGE 分离胶的配方1.分离胶的配方溶液成分不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）5101520253040506%水2.65.37.910.613.215.921.226.530%丙烯酰胺溶液1.02.034568101.5 mol/L Tris (pH8.8)1.32.53.856.37.51012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40

19、.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.048%水2.34.66.99.311.513.918.523.230%丙烯酰胺溶液1.32.745.36.7810.713.31.5 mol/L Tris (pH8.8)1.32.53.856.37.51012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.0310%水1.945.97.99.911.915.919.830%丙烯酰胺溶

20、液1.73.356.78.31013.316.71.5 mol/L Tris (pH8.8)1.32.53.856.37.51012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.0212%水1.63.34.96.68.29.913.216.530%丙烯酰胺溶液2468101216201.5 mol/L Tris (pH8.8)1.32.53.856.37.51012.510% SDS0.050.10.150.20.250

21、.30.40.510%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.0215%水1.12.33.44.65.76.99.211.530%丙烯酰胺溶液2.557.51012.51520251.5 mol/L Tris (pH8.8)1.32.53.856.37.51012.510% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.022.配

22、制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶（浓缩胶）所用溶液溶液成分不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）123456810水0.681.42.12.73.44.15.56.830%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.8311.31.71.0 mol/L Tris (pH6.8)0.130.250.380.50.630.7501.2510% SDS0.010.020.030.040.050.060.080.110%过硫酸氨0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01