动物细胞组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒产品说明书中.docx

1、动物细胞组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒产品说明书中动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂是一种旨在从动物细胞或活体组织中分离出线粒体和细胞浆组分，从而检测细胞色素C的转运，即由线粒体释放到细胞浆，来探测细胞凋亡的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞的线粒体和细胞浆组分的制备。可以被用于后续蛋白质西方杂交等实验。产品不含污染性蛋白水解酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离到位，质量保证。技术背景细胞色素C（CYTOCHROME C）在细胞凋亡中扮演

2、着重要作用。细胞色素C位于线粒体内外膜之间。当细胞凋亡时，它从线粒体内释放到细胞浆里，引起一系列的信号通道的下游反应。产品内容清理液（Reagent A） 毫升裂解液（Reagent B） 毫升净化液（Reagent C） 毫升强化液（Reagent D） 毫升保存液（Reagent E） 毫升活性液（Reagent F） 微升溶解液（Reagent G） 毫升上样液（Reagent H） 微升产品说明书 1份保存方式保存净化液（Reagent C）和活性液（Reagent F）在-20冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4冰箱里；有效保证6月 用户自备HANK平衡盐缓冲溶液（GMS12028）

3、或PBS缓冲溶液（GMS12033）：用于清理细胞硬组织处理液（Reagent I）：用于促进硬组织表面溶解胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离完全细胞培养液（GMS12052）：用于细胞培养所需的培养基15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器1.5毫升离心管：用于样品操作的容器4（微型）台式离心机：用于样品操作DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞抗细胞色素C抗体：用于蛋白质西方杂交实验步骤一、动物软组织线粒体分离（组织匀浆法）实验开始前，将试剂盒里的活性液（Reagent F）冻融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和 x

4、x毫升净化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，放进冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。1手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（注意：实验前务必使动物空腹12至24小时） 2（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管3（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次4即刻用刀片切碎组织5放进一个预冷的15毫升锥形离心管6加入预冷的xx毫升裂解工作液7涡旋震荡5秒，充分混匀8即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项5）9将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管10放进4台式离心机离心10

5、分钟，速度为1500g11小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤去除细胞核和未溶解的细胞12放进4台式离心机离心10分钟，速度为10000g13小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤获得细胞浆组分14即刻放进70冰箱里备用15保留沉淀颗粒此步骤获得线粒体沉淀物16加入xx微升溶解液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中17涡旋震荡15秒18放进冰槽中孵育15分钟19涡旋震荡60秒20放进4微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）21小心移取上清液到新的1.5毫升离心管此为所有可溶性线粒体蛋白系统22若

6、暂时不予后续处理，即刻保存在70冰箱里备用23继续进行下列操作操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测1）分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳1）分别移取20微升（总量10微克）线粒体和细胞浆蛋白溶液（总量50微克）到新的1.5毫升离心管2）加入xx微升上样液（Reagent H）3）涡旋震荡15秒4）放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）5）煮沸5分钟6）上样，进行电泳操作（12SDS-PAGE）7）使用1微克/毫升抗细胞色

7、素C抗体进行西方杂交（注意：建议使用蛋白质西方杂交印迹（化学发光）试剂盒 GMS30005.1）8）比较细胞色素C的浓度变化和差异二、动物软组织线粒体分离（化学处理法）实验开始前，将试剂盒里的活性液（Reagent F）冻融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和 xx毫升净化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，放进冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。1手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（注意：实验前务必使动物空腹12至24小时） 2（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管3（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗

8、1次4移入一个液氮冻存管5即刻放进液氮罐过夜6次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）7放进一个15毫升锥形离心管8加入预冷的xx毫升裂解工作液9涡旋震荡5秒，充分混匀10在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次11加入预冷的xx微升强化液（Reagent D）12涡旋震荡5秒，充分混匀13在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项6）14加入预冷的xx毫升保存液（Reagent E），用手混匀15放入4台式离心机离心10分钟，速度为1500g16小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤去除细胞核和未溶解的细胞17放入4台式离

9、心机离心10分钟，速度为10000g18小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤获得细胞浆组分19即刻放进70冰箱里备用20保留沉淀颗粒此步骤获得线粒体沉淀物21加入xx微升溶解液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中22涡旋震荡15秒23放进冰槽中孵育15分钟24涡旋震荡60秒25放进4微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）26小心移取上清液到新的1.5毫升离心管此为所有可溶性线粒体蛋白系统27若暂时不予后续处理，即刻保存在70冰箱里备用28继续进行下列操作操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测1）分别移取10微

10、升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳1）分别移取20微升（总量10微克）线粒体和细胞浆蛋白溶液（总量50微克）到新的1.5毫升离心管2）加入xx微升上样液（Reagent H）3）涡旋震荡15秒4）放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）5）煮沸5分钟6）上样，进行电泳操作（12SDS-PAGE）7）使用1微克/毫升抗细胞色素C抗体进行西方杂交（注意：建议使用蛋白质西方杂交印迹（化学发光）试剂盒GMS30005.1）8）比较细胞色素C的浓度变

11、化和差异三、动物细胞线粒体分离（细胞匀浆法）实验开始前，将试剂盒里的活性液（Reagent F）冻融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和 xx毫升净化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，放进冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。1准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面2分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去3加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面4放进37培养箱3分种5手击振动培养瓶，使细胞脱落

12、6分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液7合并移入到1个50毫升锥形离心管8放进台式离心机离心10分钟，速度为200g9小心抽去上清液10加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞11放进台式离心机离心10分钟，速度为300g12小心抽去上清液13加入预冷的xx毫升裂解工作液14涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群15即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化细胞（约80下）（注意：参见注意事项5）16将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管17放进4台式离心机离心10分钟，速度为1500g18小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤去除细胞核和未溶解的细

13、胞19放进4台式离心机离心10分钟，速度为10000g20小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤获得细胞浆组分21即刻放进70冰箱里备用22保留沉淀颗粒此步骤获得线粒体沉淀物23加入xx微升溶解液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中24涡旋震荡15秒25放进冰槽中孵育15分钟26涡旋震荡60秒27放进4微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）28小心移取上清液到新的1.5毫升离心管此为所有可溶性线粒体蛋白系统29若暂时不予后续处理，即刻保存在70冰箱里备用30继续进行下列操作操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测

14、1）分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳1）分别移取20微升（总量10微克）线粒体和细胞浆蛋白溶液（总量50微克）到新的1.5毫升离心管2）加入xx微升上样液（Reagent H）3）涡旋震荡15秒4）放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）5）煮沸5分钟6）上样，进行电泳操作（12SDS-PAGE）7）使用1微克/毫升抗细胞色素C抗体进行西方杂交（注意：建议使用蛋白质西方杂交印迹（化学发光）试剂盒GMS30005.1）8）比较细

15、胞色素C的浓度变化和差异四、动物细胞线粒体分离（化学处理法）实验开始前，将试剂盒里的活性液（Reagent F）冻融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和 xx毫升净化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，放进冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。1准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面2分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去3加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面4放进37培养箱3分种5手击振动培

16、养瓶，使细胞脱落6分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液7合并移入到1个50毫升锥形离心管8放进台式离心机离心10分钟，速度为200g9小心抽去上清液10加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A）11放入台式离心机离心10分钟，速度为300g12小心抽去上清液13加入预冷的xx毫升裂解工作液14涡旋震荡5秒，充分混匀15在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次16加入预冷的xx微升强化液（Reagent D）17涡旋震荡5秒，充分混匀18在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项6）19加入预冷的xx毫升保存液（Reagent E），用手混匀20放进4台式离心机离心10

17、分钟，速度为1500g21小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤去除细胞核和未溶解的细胞22放进4台式离心机离心10分钟，速度为10000g23小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤获得细胞浆组分24即刻放进70冰箱里备用25保留沉淀颗粒此步骤获得线粒体沉淀物26加入xx微升溶解液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中27涡旋震荡15秒28放进冰槽中孵育15分钟29涡旋震荡60秒30放进4微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）31小心移取上清液到新的1.5毫升离心管此为所有可溶性线粒体蛋白系统32若

18、暂时不予后续处理，即刻保存在70冰箱里备用33继续进行下列操作操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测1）分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳1）分别移取20微升（总量10微克）线粒体和细胞浆蛋白溶液（总量50微克）到新的1.5毫升离心管2）加入xx微升上样液（Reagent H）3）涡旋震荡15秒4）放进台式微型离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）5）煮沸5分钟6）上样，进行电泳操作（12SDS-PAGE）7）使用1微克/毫升抗细胞色

19、素C抗体进行西方杂交（注意：建议使用蛋白质西方杂交印迹（化学发光）试剂盒GMS30005.1）8）比较细胞色素C的浓度变化和差异五、动物硬组织线粒体分离（组织匀浆法）实验开始前，将试剂盒里的活性液（Reagent F）冻融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和 xx毫升净化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，放进冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。1手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量（注意：实验前务必使动物空腹12至24小时） 2（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管3（选择步骤）加入适量的（xx克组织需要xx毫升）清理液（Rea

20、gent A）清洗1次4即刻用刀片切碎组织5放进一个预冷的15毫升锥形离心管6加入预冷的xx毫升硬组织处理液（Reagent I），充分混匀7放进冰槽里孵育3分钟8放进4台式离心机离心2分钟，速度为1000g9小心抽去上清液10加入预冷的xx毫升清理液（Reagent A）和xx毫升 净化液（Reagent C），充分混匀11放进4台式离心机离心2分钟，速度为1000g12小心抽去上清液13加入预冷的xx毫升裂解工作液14涡旋震荡5秒，充分混匀15即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项5）16将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管17放进4台

21、式离心机离心10分钟，速度为1500g18小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤去除细胞核和未溶解的细胞19放进4台式离心机离心10分钟，速度为10000g20小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤获得细胞浆组分21即刻放进70冰箱里备用22保留沉淀颗粒此步骤获得线粒体沉淀物23加入xx微升溶解液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中24涡旋震荡15秒25放进冰槽中孵育15分钟26涡旋震荡60秒27放进4微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）28小心移取上清液到新的1.5毫升离心管此为所有可溶性线粒

22、体蛋白系统29若暂时不予后续处理，即刻保存在70冰箱里备用30继续进行下列操作操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测1）分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳1）分别移取20微升（总量10微克）线粒体和细胞浆蛋白溶液（总量50微克）到新的1.5毫升离心管2）加入xx微升上样液（Reagent H）3）涡旋震荡15秒4）放进微型台式离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）5）煮沸5分钟6）上样，进行电泳操作（12SDS-PAGE）7）使用1微

23、克/毫升抗细胞色素C抗体进行西方杂交（注意：建议使用蛋白质西方杂交印迹（化学发光）试剂盒GMS30005.1）8）比较细胞色素C的浓度变化和差异六、动物硬组织线粒体分离（化学处理法）实验开始前，将试剂盒里的活性液（Reagent F）冻融，然后移出xx微升活性液（Reagent F）和 xx毫升净化液（Reagent C）到xx毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，放进冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。1手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（注意：实验前务必使动物空腹12至24小时） 2（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管3（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reage

24、nt A）清洗1次4移入一个液氮冻存管5即刻放入液氮罐过夜6次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）7放进一个15毫升锥形离心管8加入预冷的xx毫升硬组织处理液（Reagent I），充分混匀9放进冰槽里孵育3分钟10放进4台式离心机离心2分钟，速度为1000g11小心抽去上清液12加入预冷的xx毫升清理液（Reagent A）和2毫升 净化液（Reagent C），充分混匀13放进4台式离心机离心2分钟，速度为1000g14小心抽去上清液15加入预冷的xx毫升裂解工作液16涡旋震荡5秒，充分混匀17在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次18加入预冷的xx微

25、升强化液（Reagent D）19涡旋震荡5秒，充分混匀20在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项6）21加入预冷的xx毫升保存液（Reagent E），用手混匀22放进4台式离心机离心10分钟，速度为1500g23小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤去除细胞核和未溶解的细胞24放进4台式离心机离心10分钟，速度为10000g25小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管此步骤获得细胞浆组分26即刻放进70冰箱里备用27保留沉淀颗粒此步骤获得线粒体沉淀物28加入xx微升溶解液（Reagent G）到线粒体颗粒样品中29涡旋震荡15秒30放进冰槽中孵育

26、15分钟31涡旋震荡60秒32放进4微型台式离心机离心2分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415R）33小心移取上清液到新的1.5毫升离心管此为所有可溶性线粒体蛋白系统34若暂时不予后续处理，即刻保存在70冰箱里备用35继续进行下列操作操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测1）分别移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳1）分别移取20微升（总量10微克）线粒体和细胞浆蛋白溶液（总量50微克）到新的1.5毫升离心管2）加入xx微升上样液（Reagent H

27、）3）涡旋震荡15秒4）放进台式微型离心机离心10秒，速度为500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415R）5）煮沸5分钟6）上样，进行电泳操作（12SDS-PAGE）7）使用1微克/毫升抗细胞色素C抗体进行西方杂交（注意：建议使用蛋白质西方杂交印迹（化学发光）试剂盒GMS30005.1）8）比较细胞色素C的浓度变化和差异注意事项1本产品为10次操作（1克动物组织或5 X 107细胞）2所有操作均须在4或以下状态下进行3操作时，须戴手套4操作时，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）5通常匀化次数为80下达到80的细胞裂解为理想状态，但不

28、同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50可以增加匀化次数6通常孵育5分钟达到80的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50可以增加孵育时间和涡旋震荡次数7对于难以裂解的细胞，例如HeLa细胞，采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理85 X 107细胞约1克重量9建议使用足够的细胞量10建议严格控制操作时间11通常5 X 107细胞或1克动物组织的线粒体含量为50微克线粒体蛋白12建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒（GMS

29、30030.1）测定蛋白浓度13保存在70冰箱里的蛋白样品严格避免反复冻融14本公司提供系列细胞色素C试剂产品 质量标准1本产品经鉴定性能稳定2本产品经鉴定不含污染性蛋白酶使用承诺杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司咨询，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。友情提醒IF IT DOESNT WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。订购信息单组分订购信息编号 名称 规格 GMS10042.1.1 动物细胞/组织细胞色素C释放凋亡检测试剂盒 10次GMS10042.1.1A 清理液（Reagent A） 毫升GMS10042.1.1B 裂解液（Reagent B） 毫升GMS10042.1.1C 净化液（Reagent C） 毫升GMS10042.1.1D