黄立中等阳和汤体外对大鼠成骨细胞及破骨细胞的影响.docx

1、黄立中等阳和汤体外对大鼠成骨细胞及破骨细胞的影响阳和汤体外对大鼠成骨细胞及破骨细胞增殖的影响黄立中1 王云丹2 田莎1 彭吉勇1（1.湖南中医药大学，长沙，410007；2.长沙市中医院，长沙，410100）摘要 目的:探讨阳和汤含药血清对大鼠成骨细胞及破骨细胞的作用。方法:将阳和汤口饲大鼠，每日1次，连续7天，于末次给药后2h采血，分离获得含药血清。取原代成骨细胞，成骨细胞株UMR106，破骨前体细胞RAW264.7接种到培养板中，加入不同含药血清，分别检测不同浓度含药血清组24h、48h、72h时间段细胞的OD值。诱导因子M-CSF和RANK-L诱导RAW264.7分化形成破骨细胞的过程中

2、，加入不同含药血清，在诱导的第4、5、6天，逐日进行TRAP酶活性测定。结果:阳和汤含药血清中剂量、高剂量组在24h、48h、72h都能够明显提高原代成骨细胞OD值，低剂量组在48h、72h也能明显提高细胞的OD值，与空白组比较差异有显著统计学意义（P0.01或P0.05）；阳和汤低、中、高剂量组在24h、48h、72h均能显著提高细胞株UMR106的OD值，与空白组比较差异有显著统计学意义（P0.01或P0.05）；阳和汤低、中、高剂量组对破骨前体细胞RAW264.7的OD值表现出降低趋势，是在整体上升的趋势下略有降低，说明细胞并未死亡，表现出轻微的抑制作用，但与空白组比较差异无显著性（P0

3、.05）；阳和汤高、中、低剂量组对诱导破骨细胞的过程中TRAP酶活性的测定也无统计学意义（P0.05），其表明阳和汤含药血清在体外可能无明显抑制破骨细胞生成的作用。结论:根据原代成骨细胞、细胞株UMR106和细胞株RAW264.7增殖的测定，以及破骨细胞TRAP酶活的测定结果，显示了阳和汤含药血清对成骨细胞的增殖具有显著促进作用，但对破骨前体细胞的抑制作用不明显，同时对阻碍破骨前体细胞向破骨细胞分化的过程的作用也不明显。关键词 阳和汤；成骨细胞；破骨细胞Effects of Yanghe decoction containing serum on Osteoblast and Osteocbl

4、astABSTRACT Objective:To investigate the function of the drug-containing serum of Yanghe decoction effect on the osteoblast and osteoclast of rats. Methods:Rats were fed with Yanghe decoction once per day for 7 days . After 2 hours of the last administration , collected the rats blood and then separ

5、ated it in order to obtain the drug-containing serum. Put the drug-containing serum with different concentrations into the medium of primary osteoblasts, cell line UMR106 and RAW264.7 ,testing their OD value in 24h,48h,72h respectively. While in the process of the RAW264.7 differentiated into osteoc

6、lasts which were induced by the inducing factor M-CSF and RANK-L, adding the drug-containing serum with different concentrations, and then mensurated the TRAP enzyme activity in the fourth, the fifth and the sixth day. Results:The serum containing high dose and medium dose of Yanghe decoction can ma

7、rkedly improve OD value in 24h, 48h, as well as 72h. While low dose of it also can obviously promote the OD value only in 48h and 72h.Compared with the blank group, these differences had notably statistical significance ( P 0.01 or P 0.05 ). Same as it is,all the different dosage of Yanghe decoction

8、 serum can improve the OD value of cells line UMR106 observably in 24h, 48h, and 72h( P 0.01 or P 0.05 ); Serum containing Yanghe decoction also can not prohibit the differentiation of osteoclasts because of the result of the TRAP test. Conclusion: According to the different results of the mensurati

9、on of the proliferation on primary osteoblasts, cells line UMR106, RAW264.7, as well as the TRAP test, it demonstrated the drug-containing serum of Yanghe decoction could significantly improve the proliferation of osteoblasts but the prohibiting effect on osteoclasts was out of statistics significan

10、ce. In addition, it had no statistical differences on the influence of preventing the osteoclast of precursor cells differentiating to osteoclasts.KEY WORDS Yanghe decoction;Osteoblast ;Osteoclast骨转移癌最常见的表现为进行性骨痛、病理性骨折。我们用阳和汤治疗骨转移癌确有一定的疗效，为探讨阳和汤抗骨转移癌的作用机制，我们通过体外分离培养的成骨细胞及体外诱导的破骨细胞体系，研究阳和汤含药血清对大鼠成骨细胞

11、及破骨细胞的影响，现将结果报告如下。1 材料11 动物 取2日龄SD大鼠（分离成骨细胞用），3月龄的SD大鼠20只（制备载药血清用），体重20050g，由湖南中医药大学动物实验中心提供。12 药物 阳和汤（由鹿角胶、肉桂、白芥子、熟地、麻黄、姜炭、生甘草组成，经水煎醇沉后浓缩而得实验用药，生药含量为1.5g/ml，药材购置于湖南中医药大学第一附属医院）。13 主要试剂 胎牛血清, DMEM培养液, 磷酸盐缓冲液（PBS）,5mgml四甲基偶氮唑盐MTT（sigma）,二甲基亚砜(DMSO分析纯)，DMEM培养液( GBICOL), 区拉同X-100（上海瑞金生物公司），对硝基苯酚(上海瑞金生物

12、公司)，M-CSF（ Sigma公司），RANK-L （Sigma公司）。14 主要仪器 低速离心机（长沙平凡仪器仪表公司），水浴箱（上海精宏实验设备公司），超净工作台（苏州安泰空气技术公司），CO2培养箱（2300型，USA），倒置显微镜（南京江南光电公司），酶联免疫检测仪（Austria）。2 方法21 阳和汤含药血清制备 本实验采用20只SD大鼠，3d适应后，所有动物被随机分为4组（N=5）。对照组1组，给予蒸馏水，给药组3组，给予阳和汤混悬液（生药量分别为1.3，4，12g/(kg day)）分别为阳和汤高、中、低三个剂量组。每日一剂，连服7天，末次给药2h腹主动脉取血，分离血清，56

13、C灭活30min，用0.22m过滤除菌，分装标记YHT-S1.3,YHT-S4,YHT-S12,CONT-S存入4C冰箱备用。22 大鼠成骨细胞分离和培养参照刘祖德等的方法1取2日龄SD大鼠，在无菌条件下，分离颅顶盖骨，剔除骨膜及其它组织，用D-Hank s液冲洗3次，用眼科剪将骨片剪成1mm1mm的碎块,加入0.25%的胰蛋白酶，于37消化30min，弃上清液D-Hanks冲洗3次，加入含0.05%胰蛋白酶及lmg/ml的I型胶原酶的消化液，37消化2小时，吸取消化液，经140目尼龙网过滤，再用DMEM培养液冲洗消化的骨残集，收集冲洗液，过滤后与消化液混合，以1500r/min离心15min

14、，收集细胞，即为新鲜的成骨细胞，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，调整密度为1X105细胞/ml,接种于100m1的培养瓶中，置37, 5%CO2的孵箱中培养。24小时后换液。以后视细胞生长情况2-3天换液一次。23 MTT测定2原代成骨细胞、成骨细胞株UMR106和破骨前体细胞RAW264.7分别接种于96孔培养板，每孔加入100l细胞悬液(1105个/ml)，每个培养板分为5组，每组设6复孔，放入37、5%CO2孵箱培养24h，使细胞贴壁后，用PBS洗涤3次，随机分组进行实验。换含不同浓度阳和汤含药血清的培养液，A组（不含药大鼠血清组）：加不含药大鼠血清50l20%DMEM 100l；

15、B组（阳和汤高剂量血清组）：加阳和汤高剂量血清50l20%DMEM 100l；C组（阳和汤中剂量血清组）：加阳和汤中剂量血清50l20%DMEM 100l；D组（阳和汤低剂量血清组）：加阳和汤低剂量血清50l20%DMEM 100l；E组（细胞组）：20%DMEM 150l，为不加药的阴性对照组。继续培养24h、48h和72 h后，凋零孔加PBS液，并于结束培养前4 h每孔加入5mg/ml加1的MTT 20u1,继续培养4h后小心吸弃培养液，再在每孔加入150l DMSO(分析纯)，充分震荡5min，使结晶物充分溶解，于酶联免疫检测仪上540nm波长处测各孔吸光度值，结果用OD540表示其活性

16、。24 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的活性测定3 RAW264.7接种于96孔板，每孔加入100l细胞悬液(1105个/ml)。:在用M-CSF和RANK-L诱导RAW264.7的第1天，阳和汤不同浓度的含药血清和空白血清各10l分别加入培养体系中。直至在用M-CSF和RANK-L诱导RAW264.7的第4天，第5天，第6天，逐日进行TRAP酶活测定。其操作过程为：首先PBS冲洗细胞2次，加入20l，0.1的区拉通5min以裂解细胞。随后加入反应液(称取对硝基苯酚磷酸二钠0.4g，加入酒石酸甲钠2.0g，用1N的HCl调PH3.5，至终体积为200ml),37反应30min，迅速加入1N的N

17、aOH100ml终止反应。于405nm处测其吸光度。标准曲线为不同浓度的对硝基苯酚溶液在405nm处的吸收值与浓度所作的标准曲线,以每孔生成的对硝基苯酚的摩尔数表示TRAP活性。3 实验结果31 阳和汤含药血清对原代成骨细胞及细胞株UMR106 细胞增殖的影响各组受试样品设6个复孔，观察给各浓度含药血清24h，48h，72h后对原代成骨细胞和细胞株UMR106增殖的影响，结果见表1，图12。 表1 阳和汤含药血清对原代成骨细胞和细胞株UMR106增殖的影响(s) 吸光度值 组别原代成骨细胞 (540nm)UMR106 (540nm) 24h 48h 72h 24h 48h 72h空白血清0.3

18、10.010.500.020.630.030.320.010.490.030.660.02低剂量组0.320.010.540.02*0.710.04*0.330.01*0.550.01*0.720.02*中剂量组0.340.01*0.590.03*0.710.04*0.350.01*0.570.02*0.760.01*高剂量组0.340.02*0.620.04*0.740.04*0.370.02*0.620.02*0.810.04*与空白组比较 P0.05 P0.01 图1 阳和汤含药血清对原代成骨细胞增殖的影响 图2 阳和汤含药血清对细胞株UMR106增殖的影响加以各浓度含药血清后，原代成骨

19、细胞和细胞株UMR106的增殖情况以540nm下吸光度为指标进行测定。其结果显示，原代成骨细胞除了低剂量,24h时间点外，其它各浓度各时间点吸光度均有显著上升；细胞株UMR106情况类似，各浓度各时间点下，体系吸光度均与空白对照组有显著升高。经统计析，和空白对照组相比，给药组含药血清对原代成骨细胞和成骨样细胞株UMR106的增殖具有显著促进作用。32 阳和汤含药血清对破骨前体细胞株RAW264.7增殖的影响各组受试样品设6个复孔，观察给各浓度含药血清24、48、72h后对破骨前体细胞株RAW264.7增殖的影响，结果见表2，图3。表2 阳和汤含药血清对破骨前体细胞株RAW264.7增殖以及破骨

20、细胞分化和形成的影响(s) 吸光度值组别RAW264.7 增殖率 (540nm)破骨细胞 TRAP 酶活性 (nmol/min 100 破骨细胞)24h48h72h24h48h72h空白血清0.310.010.490.030.660.0227.211.2638.012.2440.472.80低剂量组0.310.010.480.040.650.0127.21.4137.91.5838.82.85中剂量组0.300.010.470.030.640.0326.711.9238.811.8736.611.64高剂量组0.300.010.460.020.640.0126.831.7337.991.753

21、9.462.42与空白组相比 P0.05 P0.01 图3 阳和汤含药血清对破骨前体细胞株RAW264.7增殖的影响如表2和图3所示，除低剂量组在24h时间点略有上升外，其它浓度组在各个时间点上，破骨前体细胞株RAW264.7的增殖表现为被抑制，但经检验分析，其抑制作用与空白对照组相比无统计学意义。33 阳和汤含药血清对破骨细胞分化和形成的影响各组受试样品设6个复孔，观察给各浓度含药血清24、48、72h后对破骨前体细胞RAW264.7诱导的破骨细胞4形成和分化的影响，结果见表2，图4， 图57。 图4 阳和汤含药血清对破骨细胞分化和形成的的影响 图5 破骨细胞诱导第四天（400） 图6 破骨

22、细胞诱导第五天（400） 图7 破骨细胞诱导第六天（400）破骨前体细胞株RAW264.7在加入诱导因子M-CSF(30ng/ml),RANK-L(25ng/ml)的作用下进行培养，前3天为前破骨细胞期，第4天，50%RAW264.7已被诱导转化成破骨细胞，第6天，其转化率已达到90以上（如图57），说明该诱导方法成功有效，且具有可操作性。将不同浓度的含药血清加入到诱导体系中46天。据表2、图4结果显示，各浓度给药剂量在各个时间点上，破骨细胞的分化形成表现被抑制，其TRAP酶活下降，但经统计学分析与空白对照组相比不具有显著性意义。该结果提示，阳和汤含药血清对RAW264.7诱导转化成破骨细胞的

23、过程抑制作用不具有显著性。4 讨论正常的骨代谢是通过成骨细胞的成骨作用与破骨细胞的骨吸收作用进行调节，从而保持一种动态平衡。在这个过程中，大量的相关因子参与其中，成为骨微环境主要部分。研究表明，大部分乳腺癌病人的骨转移为溶骨性转移，约15%20%的病人同时有成骨性特征4。溶骨性转移中，骨的破坏主要是由破骨细胞引起的，乳腺肿瘤细胞的主要作用是分泌一系列因子来启动和生成破骨细胞而溶骨。在体内骨微环境系统中，如果成骨细胞数目的增长到达一定比例，使机体产生相应细胞因子，从而对破骨细胞的形成分化产生抑制作用。因此，促进机体内骨形成和骨吸收之间出现正平衡，成为抗骨质破坏的重要治疗机制5。阳和汤源于王洪绪外

24、科证治全生集原方用于治疗阴疽。中医认为，骨转移癌局部肿块坚硬不移、疼痛、入夜尤甚、皮色不变等临床特征，与“寒主收引、主凝滞、主痛”等中医理论相符，属阴寒证。黄立中教授在临床用阳和汤加味治疗骨转移癌取得了明显的疗效6，王氏7用阳和汤加味合云克治疗骨转移癌30例、施氏8用阳和汤合帕米磷酸二钠（博林针）治疗恶性肿瘤31例也取得一定疗效。我们的研究显示，阳和汤含药血清中剂量、高剂量组在24h、48h、72h都能够明显提高原代成骨细胞OD值，低剂量组在48h、72h也能明显提高细胞的OD值，与空白组比较差异有显著统计学意义；阳和汤低、中、高剂量组在24h、48h、72h均能显著提高细胞株UMR106的O

25、D值，与空白组比较差异有显著统计学意义，说明阳和汤含药血清对成骨细胞的增殖具有显著促进作用。这可能是阳和汤抗骨转移癌的重要作用机制。这为阳和汤抗骨转移癌的临床应用提供了理论依据。参考文献1 刘祖德,臧鸿声,欧阳跃平.新生大W颅盖骨体外生长过程的研究.解剖学报，1995, 26(2):157-159.2 边兴艳.MTT比色法及其应用M.国外医学临床生物化学与检验学分 册.1998,83-85.3 Yan GM, Lin SZ, Irwin RP, et al. Activation of muscarinic cholinergic recePtors blocks aPoPtosis of c

26、ultured cerebellar granule neurons. Molecular Pharmacology, 1995, 47:248-2574 Coleman RE, Seaman JJ. The role of zoledronic acid in cancer: clinical studies in the treatment and prevention of bone metastasesJ. Semin Oncol, 2001,28:Supll:11-165 匡梨,谢正强.唑来磷酸治疗骨转移癌的机制研究.中国肿瘤临床J.2009， 36(6)：678-6796 黄立中,蒋益兰,曾松林,等.阳和汤加味治疗骨转移癌疼痛63例.湖南中医学院学报J.1997,11(1).7 王云启.阳和汤加味合云克治疗骨转移癌30例临床观察J.浙江中医药杂 志.2005,1(17):17.8 施航.阳和汤和帕米磷酸二钠治疗恶性肿瘤骨痛观察J.实用中医药杂 志.2005，21（6）：359.