综合实验论文双向电泳技术1.docx

1、综合实验论文双向电泳技术1目 录引言 11 材料及试剂 21.1材料 21.2试剂 22 实验设备 43 实验步骤 53.1样品制备 53.2第一向等电聚焦电泳（IEF） 53.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 63.4 考马斯亮兰染色 73.5 图谱分析 74 结果 85 小结 8参考文献 9双向电泳技术xx（指导老师：xx）（xxxx）摘 要：双向电泳是利用蛋白质在两次独立的分离步骤中的特性将蛋白质分开：第一向步骤等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（pI）将蛋白质分离。在第二向步骤中 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）利用蛋白质的分子量（Mr, 相对分子量）大小将它们分离。所得结果

2、的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。本文以提取菠菜叶中的蛋白质为例，详细介绍了双向电泳技术的原理和操作过程。关键词：双向电泳技术；等电聚焦；SDS- PAGE分离；双向电泳技术xx（指导老师：xx）（xxxx）引言双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)在 1975年由 P.H.OFarrel和 J.Klose发明，是分析从细胞、组织或其它生物样品中提取出来的蛋白混合物最有力和广泛应用的方法。这项技术利用蛋白质在两次独立的分离步骤中的特性将蛋白质分开：第一向步骤等电聚焦（Isoelectricfocusing ，简称IEF）根据蛋白质的等电点（pI）将蛋白质分

3、离。在第二向步骤中 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）利用蛋白质的分子量（Mr, 相对分子量）大小将它们分离。双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。自产生以来，双向电泳作为生化分离技术的重要性事实上早已被承认，而由于各方面的改进在最近几年才广泛应用1。具有以下几个方面的优越性：对未处理样本耐受性好，不需要预纯化 (如：色谱层析)； 分辨率非常高； 2D 可以有效的组分收集器； 蛋白在凝胶介质中受到保护； 在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ）； 与其他技术相比，在一次试验

4、中可检测到的蛋白点更多； 与后续分析技术兼容性好 (如. MDLC) 2。双向电泳由于能同时分离上千种蛋白而得到应用。在鉴定转录后和共转录修饰的能力方面双向电泳也是独一无二的，这些修饰不能通过基因组序列预测。双向电泳的应用包括蛋白质组分析、细胞差异性分析、疾病标志检测、治疗检测、药物开发、癌症研究、纯度检测和微量蛋白纯化。1 材料及试剂1.1材料菠菜叶1.2试剂1.2.1 样品提取缓冲液（USB提取液,25 ml）尿素 13.5g 9.0 mol/L NP-40 2.5 mL原液 10(V/V) 两性电解质 pH3-10 250l 0.5(V/V) pH4-6 250l 0.5(V/V) pH

5、6-8 250l 0.5(V/V) -巯基乙醇 1.25 mL原液 5(V/V) 1.2.2 样品覆盖液(2ml，制备时，取1 ml样品提取液，加水至2 ml)4.5mol/l尿素 5NP-40 2.5-巯基乙醇0.75%两性电解质（含0.25pH3-10 ，0.25pH4-6 ，0.25pH6-8）溴酚蓝（微量）1.2.3 丙烯酰胺储液(T=30%, C=2.7%, IEF-PAGE专用，50ml)将14g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，补足体积到50ml。4保存备用。1.2.4 平衡缓冲液（SDS-PAGE电泳加样缓冲液，500ml）10mmol/L Tris-HCl，pH6

6、.85%巯基乙醇(或200mmol/L DTT)4%SDS0.2% 溴酚兰20% 甘油(或40%蔗糖)1.2.5 2%琼脂糖(100ml)2.0g琼脂糖溶于25 ml Tris-Cl/SDS(pH6.8)（4），加水稀释到100ml。1.2.6 IEF-PAGE电极液下槽液（10）：25 mmol/l H3PO4溶液 (1000ml)上槽液（10）：50 mmol/l NaOH溶液 (1000ml) 1.2.7 0.2%考马斯亮蓝R-250染色液(1000mL) 500ml甲醇 400ml蒸馏水 100ml冰乙酸 2.0g 考马斯亮蓝R-2501.2.8 脱色液 5% 甲醇 7% 乙酸 88%

7、 H2O1.2.9 保存液取甘油30ml，加脱色液至300ml 3。2 实验设备 图1离心机 图2 圆盘电泳 图3制胶管 图4 垂直板电泳 图5制胶板 图6 电泳仪图7电泳仪和垂直板电泳 图8扫描仪3 实验步骤3.1样品制备称取菠菜叶片（去叶脉）5g研磨成匀浆，加入丙酮（含10%三氯乙酸）去色素（两次），再加加入丙酮（含0.07%巯基乙醇）去色素（两次），沉淀晾干。取沉淀0.5g，加入USB提取液1 ml，35水浴提取液30min后15000rpm离心，保留上清液（即IEF-PAGE蛋白质样本液）。3.2第一向等电聚焦电泳（IEF）等电聚焦（IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质，从而构成从正

8、极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。操作如下：（1） 制备IEF胶条：称取2.0g尿素，加入0.75 ml双蒸水，0.75 ml 10%NP-40，37水浴至完全溶解，加入0.6 ml 30 IEF凝胶储液（28.38Acr/1.62Bis）和两性电解质（pH3-10: 50l, pH4-6: 50l, pH6-8: 50l）混匀，加入10l 10%AP和3l TEMED原液，充分混匀，灌制17cm长的管状胶4。（2）胶液聚合后，在DYY27型圆盘电泳槽中插入管状IEF胶条，尼

9、龙网封住IEF胶条玻管下口，加入下槽液，没过IEF胶条0.5-1cm，用注射器排尽玻管下口气泡。（3）用微量进样器点样100l左右，再加入20l样品覆盖液。每管加入2l不含SDS的1%溴酚蓝溶液。图9 打出的胶条（4）加入上槽液，淹没胶条玻管上口，排除气泡，在25条件下按200V15 min，300V20min，400V30min，500V30min，600V16h）进行等电聚焦电泳。（5）取出玻管，吸去两端的溶液，用双蒸水清洗。将注射器吸满蒸溜水，套上200l 的tip头，从玻管一端将胶条打出。（6）将胶条置于小烧杯中，加入平衡液（含溴酚蓝）使之覆盖，然后放在37恒温震荡箱中震荡30分钟，以

10、用于第二向SDS-PAGE电泳。 3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳第二向按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维 平面上分开。（1）将玻璃板洗净，再用双蒸水润洗，自然晾干。（2）按装玻璃板，确保玻璃板架水平。（3）配制12.5%的丙烯酰胺凝胶（85mL）。丙烯酰胺单体 35.445mL4Tris（1.5M，pH8.8） 21.25mL双蒸水 27.03mL10%SDS 850uLAPS 425uLTEMED 30uL（4）依毛细血管原理使用配置好的丙烯酰胺凝胶先将夹板封底，凝好以后从顶部灌胶，注意避免产生气泡。待凝固后使用。（5）将平衡好的胶条小心的放置于 SD

11、S 胶面顶端，并轻压使胶条与 SDS 胶面充分结合，上面覆盖 2ml 热的琼脂糖溶液(75C)，使琼脂糖在 5 min内凝固。（6）将胶板插入电泳槽中，用夹子夹好后，分别向电泳槽的正负极倒入相应的电泳缓冲液，并打开温控系统，调节温度为 15C。开始电泳。（7） 待溴酚蓝指示剂达到距底部边缘0.5cm时停止电泳。 图10 第二向电泳3.4 考马斯亮兰染色电泳结束后，轻轻取下夹板，并在正极端切角以作记号，用清水将二维胶板冲入染色盒中待固定染色。考马斯亮兰染色程序：（1）固定 20 % TCA 1h（2）染色 0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid 2h（3）脱色

12、40% EtOH&10% acetic acid 2x 30 min（4）强化 1% acetic acid overnight（5）清洗 deionized H2O 30 min3.5 图谱分析将脱色后的胶板放入扫描仪中进行扫描，拍下照片进行图谱分析。4 结果经菠凝胶双向电泳考马斯亮蓝染色提取的菠菜叶总蛋白图谱如下：pH3 8 图19 菠菜叶总蛋白的制备型凝胶双向电泳考马斯亮蓝染色图谱5 小结在整个实验过程中，温度和溶液保存时间对整个实验影响较大。主要表现在以下几个方面：（1）室内温度过低，胶液较易凝固，引起胶条脱节，灌胶不成功；（2）室内温度较高，胶液不易凝固，延长凝胶时间；（3）水浴锅保

13、温不得超过37，否则，一方面导致蛋白质变性，影响提取效果，另一方面导致尿素挥发，提取液提取效果不好；（4）配制母液或药品保存时间过长严重影响实验的整个过程，也是实验成败的关键。参考文献1 应用固相 pH梯度的双向电泳(2-D)原理与方法（中文版）M.原 著Tom Berkelman， Tirra Stenstedt， Bengt Bjellqvist， Nancy Laird ，Michael McDowell， Ingmar Olsson， Reiner Westermeier . Amersham Biosciences2双向电泳技术J梦想启动未来2008年3月3 美F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔.精编分子生物学实验指南M.现代生物技术译丛，科学出版社，1998年.译：颜子颖，王海林.校：金冬雁.4 陈钧辉，陶力，李俊，朱婉华，袁玉荪.生物化学实验M第三版.生物科学类，科学出版社，2004年4月中心地址：湖北省黄石市磁湖路11号邮政编码：435002联系电话：0714-*E-mail：hbnubio网 址：