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1、沈萍 微生物 第十二章微生物进化系统发育和分类鉴定第十二章微生物的进化、系统发育和分离鉴定地球形成10亿年后开始出现生命,主要是类似简单杆状细菌的原始生物，同期另一些由光合微生物与沉积物形成的片层状化石叠层石stromatolites也发现较多微生物，其类似绿硫细菌和多细胞丝状绿菌，属于不产氧光合细菌。产氧光合细菌蓝细菌最早的叠石层在25-30亿年前形成。蓝细菌给地球带来氧气，而后各种真核微生物才开始出现，多样性大大增加。现代生物进化论认为地球上的生命在地球早期特殊环境下形成，通过“前生命的化学进化”过程，由非生命物质产生的。进化evolution：是生物与其生存环境相互作用过程中，其遗传系统

2、随时间发生一系列不可逆的改变，大多数情况下导致生物表型改变和对生存环境的相对适应。研究微生物系统发育phylogeny 指的就是研究各种微生物进化的历史。地球上有多少种微生物迄今无准确答案，估计有分类记录的各类物种大约150万，其中微生物大约15万，数目还在不断增加。对微生物分类存在两种基本的、截然不同的分类原则：根据表型特征phenetic characteristics 相似程度分群归类，这不涉及进化、不以反映生物亲缘关系为目的；按照生物系统发育相关性水平分群归类，目的是探寻各种微生物间进化谱系，建立反映微生物系统发育的分类系统。生物系统学systematics：以进化论为指导思想的分类学

3、，目标在于通过分类追溯系统发育，推断进化谱系，这样的分类学也成为生物系统学。第一节 进化的测量指标一 进化指标的选择 主要是分析比较生物大分子（蛋白、RNA、DNA序列）一级结构特征。研究表明蛋白、RNA、DNA序列进化变化的显著特点是进化速率相对恒定，这些分子序列进化的该变量（AA or 核苷酸替换数或替换百分率）与分子进化的时间呈正相关。因此这些生物大分子被看做是分子计时器molecular chronomenters。根据这一原理，可通过比较不同种类生物大分子序列的改变量来确定其彼此间系统发育相关性或进化距离。如果同一种大分子序列差异很大，表明它们进化距离远，这两群生物在进化过程中很早就

4、分支，反之，同一种大分子序列相同，说明它们在同一进化水平上。挑选生物大分子时需注意：1 它必须普遍存在于所研究的各种生物类群中，若研究整个生命界的进化，则所选分子应在所有生物中存在，以便于分析比较；2 选择在各种生物中功能同源的生物大分子，催化不同反应的酶的AA序列或具有不同功能核酸的核苷酸序列不能进行比较，故大分子进化研究必须从鉴定大分子功能开始；3 为鉴定大分子序列的同源位置或同源区，要求所选择的分析序列必须能严格的线性排列，以便进行进一步分析比较；4 还应注意根据所比较的各类生物之间的进化距离来选择适当分子序列，比较亲缘关系远的生物类群时，必须选择变化速率低的分子序列，因序列进化速率高的

5、分子在其进化进化过程中共同序列已经丧失。功能重要的大分子或者大分子中功能重要的区域，比功能不重要的分子或分子区域进化变化的速率低，即功能大分子或其功能区域的高度保守性。二 rRNA作为进化的指征（2011考过）最适合揭示各类生物亲缘关系的5S rRAN和16 S rRNA，而16 S rRNA应用更为广泛。16SrRNA所以被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”原因：1rRNA 参与生物蛋白的合成过程，其功能是任何生物不可缺少的，而且在生物进化漫长历程中其功能保持不变；2在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，故能适用于进化距离不同的各类生物亲缘

6、关系研究；3 16SrRNA相对分子质量大小适中，便于序列分析，在5 SrRNA、16 SrRNA、23SrRNA 3种分子中，5S rRNA约含120个核苷酸，信息量小，应用受限制，23 S rRNA相对分子量大（约2900核苷酸）序列测定和分析比较工作量大，使用时难度较大，而16 SrRNA相对分子质量大小适中（约1540个核苷酸），含有足以广泛比较各类生物的信息量，并且rRNA在细胞中含量大（约占细胞中RNA的90%）也易于提取；4 16S rRNA普遍存在于真核生物和原核生物中（真核生物中其同源分子是18S rRNA），故和作为测量各类生物进化的工具。这一点极为重要，20世纪70年代以

7、前生物进化研究没有取得突破性进展的重要 原因就是没有找到一把可以测量所有生物进化关系的尺子，这把尺子由美国人伍斯Carl Woese 发现，伍斯用这把尺子发现了生命的第三种形式古细菌。三 rRNA的顺序和进化1寡核苷酸编目分析法20世纪80年代中期以前主要采用寡核苷酸编目分析法。序列测定方法：将纯化的16S rRNA用核糖核苷酸酶（如T1核酸酶）处理，水解成片段，并用同位素体外标记，也可在培养微生物时进行活体标记；双向电泳层析法分离这些片段，用放射自显影技术确定不同长度的寡核苷酸斑点在电泳图谱中的位置；根据寡核苷酸在图谱中的位置，小片段寡核苷酸分子序列即可确定。对于不能确定序列的较大片段核苷酸

8、，还需要把斑点切下，再用不用核糖核酸酶或碱水解进行二级分析或三级分析，直至弄清所有片段序列。在此基础上对6个或更多核苷酸片段按不同长度进行编目，将所有比较的微生物序列目录编好后即可对这些序列目录资料进行分类比较，采用相似性系数SAB值来确定微生物之间的关系。相似性系数法是通过计算相似性系数SAB值来确定微生物之间关系。A和B两菌株的相似性系数SAB=2XNAB/(NA+NB)，其中NAB代表两种菌所含相同寡核苷酸的碱基总数，NA和NB分别代表两菌寡核苷酸所含碱基总数。若SAB等于1，说明所比较两菌株rRNA序列相同，是同一进化时间的微生物；若SAB值小于0.1，两菌亲缘关系很远。序列印记法，则

9、是通过序列比较后若发现某些序列仅为某种（群）微生物所特有的，这些序列可作为该种（群）微生物的印记序列（signature sequence）。印记序列通常出现在某一特定系统发育的全部成员或绝大多数成员中，故可作为该系统发育群的标志。印记序列对于把微生物归入适当类群，或用来制备核酸探针鉴定微生物有重要意义。伍斯70年代末发现古细菌认为生命应分三界的理论就是采用寡核苷酸编目分析法对大量微生物进行分析比较后提出来的。2全序列分析法20世纪80年代末发展了rRNA全序列分析法，其中最常用的是直接序列分析法，该法用反转录酶和双脱氧序列分析，可对未经纯化的rRNA 抽提物进行直接序列测定。具体方法如下：抽

10、提细胞总rRNA，用少量与16S rRNA分子中某些高度保守的碱基序列互补的DNA寡核苷酸（15-20个核苷酸）作为引物与其混合；加入反转录酶和32P标记的双脱氧腺苷三磷酸和其他未标记的脱氧核苷酸混合，并分成4等份，往每一份中加入少量4中不同的2,3-双脱氧核苷酸；反转录酶解读rRNA中的16S rRNA模板，并复制DNA拷贝，通过双脱氧核苷酸类似物的随机结合终止在不同位点上的反转录；最后用电泳分离所产生的DNA片段（在4个反应体系中，DNA片段结合分别以A、G、C、T结尾）；根据四个反应体系DNA片段在电泳凝胶上的排序，用放射自显影技术解读互补DNA顺序，从而推断出16S rRNA顺序。更新

11、的序列分析技术使用人工合成的与16S rRNA保守区内的序列互补的寡核苷酸作为作为引物，用PCR技术来扩增16S rRNA基因（编码16S rRNA的DNA），再用类似上述方法的双脱氧序列分析法进行直接序列分析。该法所需细胞材料较少，适用于大规模研究。相似性系数或表示距离的数据都是表示存在于两个线性大分子之间的各个位点上碱基相同或不同的数量指征。当把序列的异同资料转化为反应生物之间真实性的进化距离evolutionary distance时，要考虑到大分子在进化过程中可能发生回复突变或重复置换等所造成的误差，故需要统计学方法对原始数据进行校正，以便反应生物之间亲缘关系。四 系统发育树 phyl

12、ogenetic tree 简称系统树：生物进化和系统分类研究中，常用一种类似树状分支的图型来概括各种生物之间的亲缘关系，这种树状分支图型称为系统发育树。图形中，分支末端和废纸连接点称为结node，代表生物类群；分支末端的结代表仍生存的种类。系统树可能有时间比例或用两个结之间的分支长度变化来表示分子序列的差异数值。系统树分无根树unrooted tree和有根树rooted tree，无根树是简单表示生物类群之间的系统发育关系，并不反应进化途径；有根树不仅反应物种间亲疏还反映出它们共同的起源及进化方向。进行序列测定获得原始资料后，有计算机排序，使各分子序列同源位点一一对应，然后计算相似性或进化

13、距离。计算机分析系统发育相关性构建系统树时，可采用各种方法，常用简约法parsimony analysis。这种方法推断谱系的原则是：在所有可能的谱系关系中，设计进化改变的序列特征数最少的谱系是最可信的，故比较过程中要找到比较决定性的序列，这种分析方法基于一种假定：进化的发生是沿着最短的途径、发生最少的变化，从祖先进化成今天比较的生物种类。1981 伍斯根据某些生物16 S rRNA（或18 SrRNA）序列比较，首次提出一个涵盖整个生命界的系统树，而后进行了多次修改和补充。伍斯提出的系统树是有根树，根部代表地球上最先出现的生命，是先有所有生物的共同祖先，生物最初的进化从这里开始。rRNA序列

14、分析表明，进化最先分成两支：一支发展成今天的细菌（真细菌），另一只是古细菌真核生物分支，该支进一步分叉分别发展成古生菌和真核生物。古生菌和真核生物属“姐妹群”，它们之间的关系比它们与真细菌之间更为密切，某些古生菌（热网菌和热变形菌等）和真细菌中的产液菌分支离根部最近，表明它们可能是现存生物中进化最少的类群。但它们属于现代生物，不属于原始生物。生物间存在着广泛而频繁的水平或横向基因交换，在域内或在域间广泛存在基因水平转移，真核生物有来自细菌或古生菌的基因，两个原核域的生物也有频繁基因交换，甚至一些细菌也获得过真核生物基因。由此，基因的垂直传递不是影响细胞生物进化的唯一过程，横向基因转移也可能深刻

15、影响生物进化过程，故微生物甚至整个生物进化模型看成线性的可能简单了，而是一种网状结构的树。2004Rivera和Lake提出“生命环”ring of life的观点。五 三界生物的主要特征伍斯根据小亚基单位核糖体RNA(SSUrRNA)比较研究，用寡核苷酸序列编目分析法对60多株细菌的16S rRNA序列研究后发现产甲烷细菌完全没有作为细菌的特征序列，于是发现了地球第三种生命形式：古细菌archaebacteria。包括极端嗜盐菌和极端嗜酸热菌都具有不同于细菌和真核生物的序列，于是提出将细胞生物分为三界：古细菌、真细菌Eubacteria、真核生物Eukaryotes。1990年为避免把古细菌

16、看成细菌一类，又把三界（域）改成：细菌、古生菌Archaea和真核生物。并构建了 三界生物系统树。古生菌与细菌区别除了16S rRNA序列有差异外，还有如下区别：细胞无胞壁酸；有醚键分支链的质膜；tRNA的T或TC臂没有胸腺嘧啶；特殊的RNA聚合酶；核糖体的组成和性状不同。全基因组研究也表明古生菌不同于细菌和真核生物。如第一个古生菌 詹氏甲烷球菌 全基因组序列测定结果显示其只有44%的基因与其他细菌和真核生物同源；该菌在DNA复制、转录和翻译方面的基因类似于真核生物而与细菌差别较大。细菌、古生菌真核生物特征比较特征细菌古生菌真核生物有核仁、核膜的细胞核无无有共价闭合环形DNA有有无复杂内膜细胞

17、器无无有细胞壁含胞壁酸有无无膜脂特征酯键脂、直链脂肪酸醚键酯、支链烃酯键脂、直链脂肪酸tRNA大多有TtRNA的T或TC臂没有胸腺嘧啶有T启动tRNA携带的AA甲酰甲硫氨酸MetMet多顺反子mRNA有有无mRNA剪接、加帽、加尾无无有核糖体大小70S70S80S延伸因子2与白喉杆菌毒素反应无有有对氯霉素、链霉素、卡那霉素敏感性敏感 不敏感不敏感对茴香霉素敏感性不敏感敏感敏感依赖DAN的RNA聚合酶单一类型，4个亚基数种、复杂，8-12个亚基3种、复杂，12-14个亚基聚合酶II型启动子无有有产甲烷种类无有无以叶绿素为基础的光合生物种类有无有固氮种类有有无 化能自养种类有有无有贮存聚-羟丁酸颗

18、粒的种类有有无在细胞中含气囊种类有有无第二节 细菌分类研究微生物分类理论和技术方法的科学称为微生物分类学microbial taxonomy。分类学设计三个相互依存又有区别的组成部分：分类、命名、鉴定。分类classification：是根据一定原则（特征的相似性或系统发育相关性）对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对被分类微生物进行鉴定。命名nomenclature：根据命名法规给每一个分类群一个专有的名称。鉴定identification：借助先有微生物分裂系统 通过特征测定 确定新发现的或未明确分类地位的微生物所应归属分类的过程

19、。一 分类单元及其等级分类单元taxon：是指具体的分类群，如原核生物界、肠杆菌科、枯草芽孢杆菌等都分别代表一个分类单元。细菌分类单元分为7个基本的分类等级rank或cateory或分类阶元：界门纲目科属种。在某些分类单元之间可以增加“亚等级”，与亚界、亚门、亚种等。在细菌分类中，还可在科或亚科和属之间增加族和亚族等级。分类单元的等级只是分类单元水平的概括，并不代表具体的分类单元。常用分类术语：培养物 culture：指一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物，如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。如果某一培养物是由单一微生物细胞繁殖产生的，就称之为该微生物的纯培养物 pure culture。

20、菌株strain：从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以成为微生物的一个菌株；试验方法获得的某一菌株的变异型也可称为一个新的菌株，以便于原来菌株区别。菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体。菌株命名通常用数字编号、字母、人名及地名等表示，如枯草杆菌 ASI.398和枯草杆菌BF7658 前者可产蛋白酶，后者用于生产-淀粉酶。居群population：指一定空间中同种个体的组合。每一物种在自然界中的存在都有一定的空间结构，在其分散的、不连续的居住场所或分布区内，形成不同的群体单元，这些群体单元就称居群。型form或type：常指亚种一下的细分，当同种或同亚种不同菌株之间的形状差

21、异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。如按抗原特征差异分为不同血清型，按对噬菌体裂解反应的不同分为不同噬菌体型。常用的型及含义P335.（特殊生理生化特性）生物型、血清型、（对宿主致病性差异）致病型、噬菌型、（特殊形态学特征）形态型。下面为亚种以上等级正式分类单元含义：种species：是生物分类中基本的分类单元和分类等级。作为分类单元的等级，低于属高于亚种，作为分类单元指的是“物种”。生殖隔离被看成是区分物种的标准。有人根据能否通过转导、转化、接合等途径进行基因物质交换来定种，称之为基因种genospecies。目前根据基因序列资料分种，把DNA杂交同源性在70%以上，或者16SrR

22、NA序列同源性达97%以上的菌株定为一个钟。亚种 subspecies或变种variety：当某一个种内不同菌株存在少数明显而稳定的变异特征或遗传性状而又不足以区分成新种时，可将这些菌株细分成两个或更多小的分类单元，即亚种。亚种是证实分类单元中地位最低的分类等级。属genus：介于种和科之间的分类等级，也是生物分类中基本分类单元，通常把具有某些共同特征或密切相关的种归结为一个高一级的分类单元，称为属。把具有某些共同特征或密切相关的属归结为科，依次类推。二 分类单元的命名生物命名分两类：区域性的俗名vernacular name；学名scientific name。现在有国际动物命名法规，国际植

23、物命名法规和国际细菌命名法规。1 命名单元的命名正式分类单元（含亚种和亚种以上的）学名，必须用拉丁词或其他源于拉丁化的词。（1）属名 用一个单数主格名词或当做名词用的形容词来表示，可以是阳性、阴性、中性，首字母大写。亚属分类命名单元的命名和属名相同。（2）种名 细菌种名和其他生物一样 用双命名法 binomial nomenclature命名，即种的学名由属名和种名加词两部分组成。第一个词为属名，首字母大写；第二个词为种名加词，常用形容词、人名、地名、病名或其他名词，首字母不大写。繁殖某一属细菌而不特指该属中任何一个种时，可在属名后加sp.或spp.（3）亚种名 为三元式组合 即 属名、种名加

24、词和亚种名加词构成。（4）属级以上分类单元名称 亚科、科以上分类单元名称是拉丁或其他词源拉丁化的阴性复数名词命名，首字母都大写。名称后面可附上命名人姓名和命名年号，应用斜字体印刷。2 命名模式及其指定种和亚种指定模式菌株 type strain，亚属和属指定模式种type species，属以上至目级分类单元指定模式属type genus。故 当某一菌株被鉴定为一个新种或新亚种时，该菌株就应指定为该种或该亚种的模式菌株；若有几个菌株同时被鉴定为一个新种或新亚种时，必须指定一个较有代表性的菌株作为该种或该亚种过的模式菌株。模式菌株应交送菌种保藏机构，以便查考或索取。3 新名称的发表必须在公开发行

25、的刊物上发表，在菌种目录、会议记录、会议论文摘要等均不能视为有效发表。此外新名称在国际系统细菌学杂志IJSB（现名为IJSEM）以外的杂志上发表，需要取得国际上承认和学名优先权还必须经过新名称的合格化发表，即将有效发表的英文附本送到IJSB审查，被认为合格在该杂志上定期公布，命名日期从公布之日算起，否则不合格。新种属分类后缀一个.nov。三 细菌分类和伯杰氏手册70年代以后，对细菌进行全面分类、影响最大的是伯杰氏手册，该书已成为目前对细菌进行分类鉴定的主要工具书。1923年问世以来已经修订8次，现在发行第9版。1伯杰氏系统细菌学手册第1版1984-1989分类一些类群增加了核酸杂交、16S r

26、RNA寡核苷酸序列等系统发育方面的资料。但未能全面按照界门纲目科属种系统分类，而是从实际需要出发分类描述，分为33组。虽未真正进行系统分类，但仍是目前国际上细菌分类和鉴定的主要参考文献。2 伯杰氏系统细菌学手册第2版分类与第一版最大区别是很大程度上根据系统发育资料而不是根据表型特征对分类群和整体安排进行较大调整。第2版将原核生物分为古生菌域和细菌域。古生菌域分2门8纲，细菌域24门32纲。第1卷 古生菌、蓝细菌、光合细菌以及系统发育最早分支的细菌，第2卷 变形杆菌（包括形态学和生理学特征极为多样的G-菌），其第3卷 低G+C含量（50%mol以下）的G+菌，第4卷为高G+C含量（50%mol以

27、上）的G+菌，包括放线菌及相关G+菌。第三节 微生物分类鉴定的特征和技术一 形态学和生理生化特征1 形态学特征 作为微生物分类和鉴定的依据 有两个原因：易于观察和比较；许多形态学特征依赖于多基因表达，具有相对稳定性。常用的形态学特征如培养特征、细胞形态、形状、大小、排列、鞭毛、芽孢、孢子、超微结构、细胞内含物、染色反应、运动性等。因普通光学显微镜、相差显微镜操作简单，故是观察个体形态特征最常用工具，扫描电镜和透射电镜用于超微结构观察、结构特征观察。2 生理生化特征 与酶和调节蛋白的本质和活性直接相关，故选择该指标原核生物的种和属仅靠形态学特征不能区分和鉴别，故需要生理生化特征，例如肠道菌科细菌

28、属和种的分类鉴定。由于很多生理生化特征是染色体外遗传因子编码，加上影响生理生化特征的因素比较复杂，所以根据生理生化特征判断亲缘关系进行系统分类时，必须与其他特征特别是基因型特征进行综合分析，否则易得出错误结论。二 血清学试验与噬菌体分型1 血清学试验 serologic test一种细菌的抗原除了可与其自身抗体其特异性反应外，若与其他种类细菌具有共同抗原组分则它们的抗原和抗体之间就会发生交叉反应，故可用血清学试验来进行微生物分类。使用方法如下：凝集反应agglutination test：颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电解质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见

29、的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。沉淀反应（免疫沉淀反应immunoprecipitation主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验）（凝胶扩散、免疫电泳）。补体结合、直接或间接的免疫荧光抗体技术、酶联免疫、免疫组织化学immunohistochemistry，IHC：是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位

30、、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。通常对全细胞或细胞壁、鞭毛、荚膜或黏液层的抗原性进行分析比较，此外也可用纯化的蛋白进行分析，以比较不同细菌同源蛋白之间的结构相似性。比较成功的应用是对种内及个别属内不同菌株血清型划分，如根据鞭毛抗原（H抗原）苏云金芽孢杆菌分成40多个血清型、根据荚膜抗原肺炎链球菌分成近百个血清型、根据菌体（O）抗原、H抗原和表面（Vi）抗原将沙门氏菌属细菌分成约2000个血清型等。由于某些传染病与特定血清型密切相关，其分布有一定区域性，故血清型划分在流行病研究中有重要意义。研究表明血清学试验主要适用于抗原结构同源程度高（蛋白同原序列70%以上）的微生物种内血清型的分类鉴定

31、。高等级分类单元中，除已发现肠道菌科细菌具有共同抗原ECA外，其他属以上分类单元的分类鉴定未定普遍应用。2 噬菌体分型 phage 对宿主感染和裂解作用常具有高度特异性，即一种噬菌体往往只能感染和裂解某种细菌，甚至只裂解种内的某些菌株。故可根据噬菌体的宿主范围将细菌分为不同的噬菌型和利用噬菌体裂解作用的特异性进行菌株鉴定。这对于追溯传染病来源、流行病调查以及病原菌的检测鉴定有重要意义。例如用鼠疫耶尔森氏菌噬菌体对该菌进行快速鉴定。在金黄色葡萄球菌和肠沙门氏菌引起的流行病调查中，噬菌体分型发挥了作用。工业生产中噬菌体分型对防止噬菌体危害也有指导意义。该技术主要过程：将烈性噬菌体悬液滴在新鲜的、处在对数生长期的细菌平板培养物上，或者将噬菌体滴入新鲜的细菌液体培养物中，适温培养16-48h，若平板上出现噬菌斑（透明斑），或者使液体由浑浊变澄清，即说明噬菌体对该菌有裂解作用，否则为阴性结果。三 AA顺序和蛋白质分析同源蛋白AA序列相似性越高，其亲缘关系越近。因此可根据蛋白AA序列资料构建系统发育树和分类。一般来说蛋白AA序列进化速率大体上恒定，但功能不同的蛋白以不同的速率进化，功能重要的分子序列或序列区域往往进化变化速