樟树籽油亚急性毒理学实验及其降血脂作用研究.docx

1、樟树籽油亚急性毒理学实验及其降血脂作用研究樟树籽油亚急性毒理学实验及其降血脂作用研究摘 要：以成熟樟树籽为实验材料，研究了樟树籽含油体率与含油量的相关性，进行了SD大鼠亚急性毒理实验以考查樟树籽油的食用安全性，并研究了樟树籽油的降血脂功能。结果表明，樟树籽子叶贮藏细胞内的油体分布较为均匀，子叶中细胞的含油体率最低为37.41%，最高可达42.69%，平均含油体率为40.72%；在亚急性毒理性实验中，实验组大鼠各项血液学指标(红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白含量等)与对照组无显著差异(P0.05)；在降血脂功能研究中，樟树籽油能够降低大鼠体内胆固醇（TC）的含量，增加血清中甘油三酯(TG)的含量

2、，延缓肝脏向脂肪肝转化。关键词：樟树籽油；组织切片；亚急性毒理学；降血脂功能：中碳链甘油三酯Study on the subacute toxicology research and the role in lowering blood pressure of the oil of camphor seed Abstract: In this experiment, with camphor seed oil as the raw material, we studied the relationship between the oil body percentage and oil cont

3、ent of camphor seeds. Food safety analysis of camphor oil was estimated by the subacute toxicological test for SD rats. Analysis on effect of lowering bloody fat for camphor seed oil was also carried out. The results showed that oil bodies were distributed uniformly in storage cells of camphor seed

4、cotyledon , with lowest eleoplast rate 37.41% and highest rate 42.69%, and average rate 40.72% in cotyledon cells. In the subacute toxicological test, no significant difference was observed between the tested group and the control group in hematology indexes, (red blood cell count, white blood cell

5、count, hemoglobin content et al.) (P 0.05). The study on blood lipid-lowering effect suggested that camphor oil could reduce total cholesterol (TC) content of rats, increase serum triglyceride-level and slow the transformation of fatty liver.Key words：Camphor seed oil, Tissue slice, Subacute toxicol

6、ogical test, Blood lipid-lowering function，Medium- chain triglycerides 樟树（Cinnamomum camphora）为樟科（Lauraceae） 樟属（Cinnamomum Trew） 常绿乔木，主要分布在我国长江以南地区1，现亚洲东部地区、太平洋部分岛屿和大洋洲地区也均有分布，其多生长在沟谷中或者山坡上2，是经济价值最大的树种之一。樟树是天然樟脑、芳香油、油脂的重要资源，其木材、根、叶、果实皆含精油3-5，以往主要是对根、茎、叶进行利用与加工，近年来对樟树籽的研究增多6。樟树籽核仁含有40 %左右的油脂，其油脂富含癸酸(

7、59.07 %) 、月桂酸(37.22 %)等中碳链脂肪酸（medium-chain fatty acids，MCFA），含量高达90 %以上7。樟树籽油这种特殊的脂肪酸组成，使其具有很大的开发利用价值。 樟树籽油经GC-MS进行定性和定量分析，脂肪酸组成以C10（癸酸）、C12 （月桂酸）这两种中链脂肪酸为主，同时这两种脂肪酸构成的中链甘油三酯（Medium Chain Triglycerides，MCT）含量占总甘油三酯含量的60%以上。现代医学研究表明，摄入MCT能够减少血清胆固醇和肝胆固醇量，治疗由于摄入高脂肪胆固醇的饮食所导致的动脉硬化和血栓症，也可用于治疗胃肠炎、肥胖症、糖尿病8和

8、脂肪代谢紊乱等病症9。国外许多研究表明10-14，人体摄入的MCT 可促进新陈代谢，因而增加了能量消耗，促进了脂肪氧化，从而使体重有所减轻。在食品加工中，MCT 可作为疏水性风味物的介质，也可作为脱模剂，机械润滑剂，还能赋予食品良好的光泽。MCT 也可作为一种迅速补充能量的功能性能源物质，广泛应用于运动性食品中15。此外MCT 在医药品制剂16和化妆品17中也有广泛的应用。 目前，对樟树籽油的研究主要集中在其提取工艺6,18,19及应用4,20，脂肪酸组成分析21等方面，但对樟树籽中的油体、其油脂的亚急性毒理学及降血脂作用的研究较少。本实验采用冰冻切片、荧光染料尼罗红染色和激光扫描共聚焦显微镜

9、观察相结合技术，建立了快速观察樟树籽油体的方法，研究结果可为樟树高油品系的选育提供理论依据。通过亚急性毒理性实验研究，确认了樟树籽油的食用安全性，为其开发利用提供安全保障。通过研究樟树籽油对大鼠血脂相关各项生化指标、肝脏脂肪含量、肝脏细胞结构及主动脉结构的影响，探讨了樟树籽油的降血脂功能、预防和治疗脂肪肝及动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的作用，为利用樟树籽油生产健康的具有降血脂功能性油脂的开发提供理论依据。1材料与方法1.1实验材料 成熟樟树籽：10-11月份，采自南昌大学前湖校区，去果皮后于60烘箱中干燥，置于阴凉干燥处贮存备用。大豆油（精炼一级）：益海嘉里食品有限公司

10、。樟树籽油：自制，经热压榨法获得。基础饲料：购于南昌大学实验动物科学部。高脂饲料22：80%基础饲料、2%胆固醇、0.5%胆酸、20%油脂。配制方法：热油脂中加入胆固醇、胆酸，充分混匀后趁热倒入普通饲料，用手揉搓拌匀，捏成饼，60烘干备用。1.2实验动物雄性SD大鼠（Male Sprague-Dawley rat，SD rat，动物合格证号96-021），体重(23020)g，南昌大学实验动物科学部提供。1.3实验仪器冰冻切片机：Leica CA 1950；激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）：ZEISS LSM 710 ；SHB- A 循环水式多用真空泵：河南太康教材仪器厂；YBS-液压榨油机：

11、北京环球同创科技发展有限公司 ；脱臭锅：安陆粮食机械厂；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；TDL-5-A型低速台式离心机，厦门精艺兴业科技有限公司；血细胞分析仪（百特，41-2400型）；台式高速冰冻离心机：德国Eppendorf公司；756紫外分光光度计：上海精密；101-2型恒温干燥箱：上海市实验仪器厂；DK-S14型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；LXJ-型离心机：上海医用分析仪器厂；CA 1950恒冷箱冰冻切片机：德国Leica；Dm5000B正置自动显微镜：德国Leica；10ml 注射器，5ml 促凝管，2ml 抗凝管，解剖工具等。1.4实验方法1.4.1 樟

12、树籽子叶贮藏细胞内油体的形态观察切片：在冰冻切片机冷箱温度-15，冷台温度-20下进行。染色：切片放入尼罗红染液中分别避光孵育15、20、25分钟，期间用移液器吸头吹打几次，促使染料与细胞内油脂充分结合23。切片厚度分别设定为 10、15、20m。制片：用0.1 M的PBS缓冲液漂洗3-4 次，然后用 Immersion oil封片。观察：在LSCM下使用 20倍和 40倍物镜扫描观察并拍照，激发波长为 483 nm，吸收波长为566-670 nm。1.4.2樟树籽油的制备将干燥种子炒热，以20kg/30min的速率压榨法得到的毛油，4000 r/min离心1h，收集油层，4%白土吸附20 m

13、in脱色，过滤，0.1 MPa的真空条件下，将油吸入脱臭锅，加热至160 ，从锅底部通入少量水蒸汽，持续升温至180 ，恒温脱臭4 h，停止加热，冷却降温至70 ，破真空，放出油脂，过滤，得精炼的樟树籽油24。1.4.3樟树籽油的亚急性毒理学实验雄性SD大鼠，随机分为3组，每组10只。实验组喂食樟树籽油，对照组喂食大豆油，最后一组仅喂食基础饲料。实验组与对照组中基础饲料中油脂含量为20%，实验期间动物自由饮水与摄食，连续35d观察大鼠的行动、摄食及死亡等一般状况。35d后3-4ml 10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，测定白细胞、红细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、嗜酸性粒细

14、胞计数、嗜碱性粒细胞计数、中性粒细胞百分率、淋巴细胞百分率、单核细胞百分率、嗜酸性粒细胞百分率、嗜碱性粒细胞计数、血红蛋白、红细胞体积分布宽度、红细胞压积、红细胞平均体积、单个红细胞平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、血小板计数、血小板平均体积、血小板压积等血常规指标。1.4.4樟树籽油的降血脂功能研究1.4.4.1 喂养实验 雄性SD大鼠实验环境下适应性喂养5天，随机分为3组。对照组喂食基础饲料，实验组喂食高脂饲料，加入的油脂为95%樟树籽油和5%大豆油，高脂对照组喂食高脂饲料，加入的油脂为大豆油，连续5周，实验期间动物自由饮水和摄食。1.4.4.2观测指标及检测方法 实验周期5周，分组时称

15、重一次，以后每周称重一次。喂养结束后，空腹12h后，取3-4ml 10%水合氯醛对大鼠进行全身麻醉，经腹主动脉取血。血样于4，6000rpm离心20min分离血清后测定各项指标，同时，对应取大鼠肝脏及其主动脉，用0.9%生理盐水清洗后放入 -70冰箱中待用。检测血清总胆固醇( TC)、甘油三酯( TG)、高密度载脂蛋白( HDLC) 、低密度载脂蛋白( LDLC)25、动脉硬化指数(Atherogenic index, AI)、肝脏粗脂肪含量、肝脏病理组织学检查26和主动脉病理组织学检查。3结果与分析3.1 樟树籽子叶贮藏细胞内油体的形态观察从图1可以观察到，樟树籽子叶贮藏细胞形状多为多边形，

16、少数为椭圆形。细胞内的油体分布较为均匀，部分油体为椭圆形或不规则形状，少部分为球形，且子叶贮藏细胞内油体间排列紧密。经过多次随机选择和计算，子叶中细胞的含油体率（含油体率(%)=单个细胞内油体截面积整个细胞面积大小100%）最低为37.41 %，最高可达42.69 %，平均含油体率为40.72 %。通过对玉米27、芝麻28、油菜29等高含油量植物中进行油体变化与含油量关系研究发现，油体在子叶中分布越广，种子中含油量越高，因此樟树籽的含油量与含油体率成正相关。 图 1 樟树成熟种子子叶贮藏细胞内油体的LSCM观察（Bar=10m）Fig 1 Observation of oil bodies i

17、n the cotyledon storage cells of mature seeds from Cinnamomum camphora. with LSCM（Bar=10m）3.2樟树籽油的亚急性毒理学实验 Table 1 Hematology results of rats in subacute toxicity test(S)表1 大鼠亚急性毒理性实验血液学检查结果 (S)血常规指标实验组对照组参考值白细胞（109/L）11.34.5614.6911.3810.1-15.2红细胞计数（109/L）7.830.426.882.566.56-9.83中性粒细胞计数（109/L）1.60

18、1.392.662.370.79-1.44淋巴细胞计数（109/L）8.652.9310.277.556.66-12.87单核细胞计数（109/L）0.930.511.491.310.84-1.36嗜酸性粒细胞计数（109/L）0.050.050.110.110.03-0.85嗜碱性粒细胞计数（109/L）0.060.060.130.170.03-0.1中性粒细胞百分率（%）12.816.1916.754.316.3-24.8淋巴细胞百分率（%）78.287.4271.54.9165.1-82.9单核细胞百分率（%）8.001.779.902.016.5-11.8嗜酸性粒细胞百分率（%）0.4

19、10.290.900.660.6-1.3嗜碱性粒细胞百分率（%）0.500.230.950.770.3-1.0血红蛋白（g/L）136.286.77119.2443.98130.6-172.3红细胞体积分布宽度（%）11.540.4411.610.6810.2-10.7红细胞压积（%）44.842.2538.7714.4740.6-50.2红细胞平均体积（fl）57.32.0456.311.7655.8-61.9平均血红蛋白含量（pg）17.410.4915.116.1317.5-19.9平均血红蛋白浓度（g/L）304.113.26243.50121.02306-322血小板计数（109/L

20、）724.62269.71606.50373.26636-948血小板平均体积（fl）6.990.357.210.356.7-7.3血小板压积（%）0.500.180.430.270.47-0.61整个实验过程中，SD大鼠无一例死亡，摄食正常，无任何异常行为。表1中，大鼠各项血液学分析检验均在正常范围30，实验组、对照组和高脂对照组三组之间均无显著差异（P0.05）。血液学中，红细胞为血液中数量最多的一种血细胞，它含有的血红蛋白能够使其可以在血液中输送氧等物质，红细胞平均体积和红细胞体积分布宽度可结合分析大鼠的贫血状况。实验结果显示，经樟树籽油饲喂的大鼠造血功能良好，无贫血情况。3.3 大鼠体

21、重变化 SD大鼠适应性喂养5天后，每周称重，连续喂养5周，大鼠体重增长见表2。实验组和高脂对照组中，喂养基础饲料中2%胆固醇和0.5%胆酸进行建模，饲料中原有脂肪酸含量改变，脂含量比重增加导致凝结度降低，同时口感、气味、形状等均与基础饲料有差异，在实验过程中，前期体重增加均低于对照组，可能原因是大鼠前期需要对新的食物进行适应性进食一段时间，从而导致体重增加较慢。表2樟树籽油对大鼠体重的影响(S, g)Table 2 Effect of camphor seed oil on the body weight of rats (S, g) 组别 Group第0周第1周第2周第3周第4周第5周对照组

22、234.2713.89311.8210.62363.6015.12421.8217.12456.4519.36492.0027.05实验组234.209.63278.9518.55308.3027.95349.8539.08374.8539.07432.4438.09高脂对照组236.909.19294.1512.16323.2013.57387.3023.49411.2035.13454.7835.62第1周三组体重增加情况为：对照组高脂对照组实验组，第2周对照组体重增加最大，实验组和高脂对照组相差不大，而从第3周至第5周三组体重变化情况为：高脂对照组对照组实验组，大鼠长期食用樟树籽油会使其

23、体重降低。随着时间的推移，实验组大鼠的体重增加量逐渐减少，实验表明，长期食用樟树籽油有利于保持体重或使体重降低，而短期实验不能有效证明其减肥效果。同时观察到：前期三组大鼠均表现活跃，取食积极；到实验后期，实验组和高脂对照组与对照组大鼠相比，运动较少，取食不积极。 对照组 实验组 高脂对照组Control group Experimental group High High lipidic group图2三组大鼠外观（解剖前）Fig 2The appearance of rats of three groups（before being dissected） 3.4樟树籽油降血脂作用研究 从表3

24、可以看出，大鼠喂养5周后，与对照组相比，实验组大鼠胆固醇（Total Cholesterol，TC）水平显著（P0.05）增加，高脂对照组大鼠TC水平极显著（P0.01）增加，实验组TC水平低于高脂对照组，但差异不显著。高脂对照组中甘油三酯（Triglyceride，TG）水平与对照组和实验组相比显著（P0.05）降低，但是实验组与对照组相比差异不显著。结果表明，樟树籽油能够有效改善大鼠血清中TAG水平。三组大鼠高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）之间差异不显著，但检测低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）时，结果显示，实验组比对照组显著（P0.05）增加，而高脂对照组比对照组极显著（P0.01）增加，

25、实验组与高脂对照组相比差异不显著。表3 SD大鼠血清生化指标检查结果及AI值 (S，mmol/L)Table 3 Biochemical indicator in blood serum of SD rats and AI (S, mmol/L)分组TCTGHDL-CLDL-CAI实验组1.850.27a0.940.49c0.650.140.820.16 a1.850.93高脂对照组1.960.36b0.380.16 a0.610.120.910.18 b2.210.35对照组1.310.261.190.660.470.110.560.111.790.36a：P0.05，b：P0.01与对照组

26、比较，c：P0.05与高脂对照组比较。TC、TG含量是高脂血症的重要指标，血清中TC，TG，LDL-C均是AS形成的促进因子，LDL-C升高是心肌梗塞的危险因子，而HDL-C能转运胆固醇，其中载脂蛋白又能激活卵磷脂胆固醇转脂酰基酶，催化卵磷脂分子中-脂肪酰基与胆固醇作用生成胆固醇酯，使TC与TG含量降低，所以HDL-C是高脂血症的辅助标志31，由于其可将外周血中多余的胆固醇带回肝脏代谢生成胆汁酸，因此HDL-C升高也是抗心肌梗塞的安全因子。这些结果表明，樟树籽油对脂质代谢失调有明显改善作用。3.5 大鼠肝脏肉眼观察和粗脂肪含量的测定 对照组 实验组 高脂对照组Control group Exp

27、erimental group High lipidic group图3肝脏截面Fig3 Cross section of liver 解剖后肉眼观察发现（图3），对照组大鼠肝脏为鲜红色，实验组大鼠肝脏偏黄色，表面有红色小斑点，高脂对照组形成脂肪肝，表面出现一些黄色斑点。实验组和高脂对照组的肝脏研磨后呈现明显的油浸状，色较深，尤其是高脂对照组更为明显，对照组肝脏较硬，研磨后呈干粉状，色较浅。采用索氏抽提法测定各组粗脂肪含量，结果见表4。表4 肝脏粗脂肪含量(s，%) Tab 4 The content of raw fat in the liver (s，% )组 别粗脂肪/肝湿重抑制率（%）

28、高脂对照组26.254.21 -实验组18.494.5829.56对照组8.152.4768.95 从表4可知，本实验所用高脂饲料可使大鼠形成脂肪肝，对照组和实验组肝脏粗脂肪含量极显著低于高脂对照组，同时，实验组显著低于高脂对照组，实验组抑制率为29.56%，对照组抑制率为68.95%。实验结果表明，樟树籽油对食源性脂肪肝有较好的预防作用。3.6 肝脏病理组织学检查 从图4-A对照组肝脏冰冻组织切片上可以看出，利用基础饲料喂养SD大鼠，大鼠肝脏呈现淡灰色，可以观察到极少数颜色较深的酯滴，同时因卡红溶液可对细胞核着色，还可观察到部分细胞核，可从侧面说明由南昌大学动物科学部自主研发的基础饲料适合大

29、鼠的喂养，不易造成脂类物质在肝脏的堆积。从图4-B实验组肝脏组织切片中可以看出，肝脏切片颜色加深，变为蓝黑色，且脂类分布较为均匀。从图4-C高脂对照组中可以看出，肝脏细胞大小不一，脂类分布不均，且多集中在细胞内。三组大鼠通过5周的喂养，血清中TAG和胆固醇等的含量有差异。通过对比对照组、实验组和高脂对照组肝脏组织切片，结果显示，实验组和对照组在细胞分布和脂类分布上差异不大，说明实验组大鼠肝脏未发生病变或病变较小，实验组切片颜色为蓝黑色，而对照组仅为淡灰色，表明实验组大鼠肝脏中TAG和胆固醇含量较对照组高；高脂对照组和对照组相比，高脂对照组细胞大小差异大，脂类分布不均，造成此种情况，可能由于肝脏

30、组织产生病变或者是肝脏组织形成非酒精性脂肪肝。综上所述，在相同条件下，喂养樟树籽油能够有效抑制或延缓大鼠肝脏病变形成脂肪肝。 A：对照组 B：实验组 C：高脂对照组 A:Control group B:Camphora seed oil group C:Soybean oil group图4 肝脏组织学切片图(400) Fig 4 Histological slices of live tissue of rats(400)3.7 主动脉病理组织学检查 对照组(图5-A)大鼠主动脉内膜较为平滑，且内膜、中膜及外膜分布较为清晰；实验组(图5-B)大鼠主动脉中膜和外膜界限较为模糊，内膜局部有向内的突起，且有少量的油滴依附其上；高脂对照组(图5-C)大鼠主动脉中内膜、中膜及外膜界限模糊，内膜增厚且突起较多，揭示内膜外依附其上的脂质较多。长期食用富含高胆固醇的食物可能会引起动脉粥样硬化，三组大鼠的主动脉切片显示，实验组中樟树籽油对主动脉粥样硬化速度有所抑制。有研究表明，经常食用富含胆固醇的食物，由于脂类物质堆积在血管壁内侧，引起动脉粥样硬化从而导致血管通道变窄，增加动脉输血负担，主要是由于脂类物质堆积血管壁导致血管通道变窄，从而造成供血困难，严重者有可能导致死亡。 A：对照组 B：实验组 C：高脂对照组