ABI3500xL基因分析仪操作流程.docx

1、ABI3500xL基因分析仪操作流程ABI-3500xL基因分析仪操作流程ABI 3500xL基因分析仪操作流程一、标准测序反应（一）质粒测序标准实验流程1对质粒DNA的质量和浓度要求 纯度：OD 260/OD 280= 1.62.0，用量：每反应150300 ng。2测序 PCR 反应 标准反应体系：3测序产物纯化：使用Edge Bio收集柱进行纯化。（1）离心850g，3min柱子，弃掉收集管，换新的EP管。（2）将待纯化样品加到柱子中间，注意不要加到离心柱侧壁上。（3）离心850g，3min，弃掉柱子，即得纯化产物。（4）取10 L Hi-Di Formamide加入96孔板中，再加入1

2、0 L待测样品，振荡混匀离心。（二）PCR 产物测序标准实验流程1.2.和毛细管），若指示针在可用范围内则可继续，若在指示针在红色区域中，则需更换耗材后再继续。3.仪器预热：点击仪表盘上的“Start Pre-heat”按钮预热炉子和泳道。（二）放置待测样品1. 检查确保橡胶隔板均通透后，将其小心盖在加有待测样品的96孔板上，注意孔对孔盖好。2. 将板子放入板架中，盖好固定盖，确保所有孔都一一对齐，即组装好测序板子。3. 按仪器的TRAY按钮，使托盘出仓，之后将组装好的板子放入自动采样器中，注意有标记的一侧面对操作者。（三）创建平板1. 点击Create Plate From Template

3、，在弹出对话框中选择模板Std_Seq_Array_xL_POP7，点击Open，输入详细的平板信息，包括Name, Number of Wells, Plate Type, Capillary Length, Polymer。一般详细如下。1.点击屏幕下方的Assign Plate Contents。（1）输入各个孔的样品名称等信息，Results group：输入结果的保存路径。（2）选中下面控制面板上Assay，Filename convention，Results group三个项目。（3）点击Link Plate for RunOK。2.检查屏幕上显示的各种信息，确定正确无误后点击S

4、tart Run，即启动运行。（四）监控运行仪器正在运行时，可在软件中监控运行情况。1.可查看选中的单孔或某一排的运行情况，查看Instrument Run Views and Flags中各项：EPT（电流、电压、温度），Array中可查看峰图。2.可编辑进样列表：重复进行，改变次序，删除进样，终止进样等操作。3.启动、暂停或继续运行。（五）查看结果点击Review Results即可查看原始的测序结果，分析结果方法见下。二、分析测序结果1.打开软件：双击电脑桌面Sequencing Analysis v5.4图标。2.导入结果：点击工具栏中Add samples 按钮，选择路径，导入待分析

5、的测序结果。3.分析：Sample manager中选择分析方法对测序结果进行分析。一般用BC (baseclling, 将原始结果翻译为对应的碱基序列)。（1）选中BC复选框，点击工具栏中Start analysis 按钮，即开始分析。（2）分析结束后，结果将自动保存为ab1格式文件。（3）点击工具栏中Analysis report 按钮，可查看结果状态(BC status)，不同颜色代表不同测序结果，可判定本次测序成功与否。（4）选中某样品前show复选框，即可查看各样品的详细结果。Asequence显示碱基序列及其QV评分结果。注意：a. 蓝色：High QV = 20+，结果可信；黄色

6、Medium QV = 15 to 19，需查看峰图，判定结果是否可信；红色Low QV15，结果不可信。b.此处可选中序列，右键复制即可将结果粘贴保存到txt文档中。BElectropherogram显示电泳峰图及序列。CRaw显示看到原始电泳图。4.打印：Sample manager中选中P (print)复选框，点击Start analysis绿色按钮，即可将测序结果输出为pdf格式文档。操作注意事项1.测序反应：（1）模板：测序反应对模板质量要求很高，一般需经纯化才可使用；模板用量也有规定。（2）反应体系：一般用标准的反应体系，也可用稀释反应体系（比如序列比较简单时），一般8倍以内稀释

7、比较可靠。（3）反应条件：退火50和延伸60时，升降温速度需降低至1/s，使测序反应充分进行。（4）体系配制：反应体系的制备不能在样品制备区和PCR区进行，移液器不能混用，否则会造成实验室污染。ABI 3500xl日常维护1. 毛细管维护：（1）每周查看阴极缓冲液的液面，避免毛细管露出液面干燥而失效。若液面下降，可在阴极缓冲液中加入双蒸水，保证毛细管插入液面下。下次电泳前换新的缓冲液。（2）防止碰触毛细管针尖，只有在更换新的毛细管时才需打开检测窗口门，之后需在软件中重新校正。包括：A空间校正，maintainancecalibratespeitial，选择fill灌胶后开始，选择no fill

8、不灌胶直接开始start calibrate。结果判定，所有峰只有一个尖且间距在15，16间，峰高比较均一，相差不超过60%，可接受，完成后要点Accept或者reject。B光谱校正，换新毛细管、不同类型试剂盒、不同类型胶时需做maintainancecalibratespectial，G5为片段分析用，Z为测序用calibrate run，chemistry standard：G5。完成后需点Accept。（3）若长期不用仪器时，仍需每周给毛细管灌胶一次。（fill array with polymer）2. 仪器日常维护：（1）可用无尘纸巾、棉签和蒸馏水擦拭仪器表面，勿使用有机溶剂，不能

9、随意搬动仪器。 （2）严禁在电脑上安装其他无关软件，不准用U盘拷贝数据，只能刻盘。（3）长期不用应将POP7胶取下加塑料塞放入4冰箱，用漂洗袋代替。并每周进行一次replenish polymer。（换新胶袋后和每周一次）。（4）若机器使用频繁应每周用contridationing regents清洗灌胶泵(wash pump and channels)一次。（5）fill array with polymer，换毛细管后或认为灌胶有问题时重新灌。（6）shut down ，长期不用时关闭仪器，慎用。（7）remove bubbles，排气泡。（8）灌胶泵维护每月一次：A，水峰，松开泵上方进口旋钮，用注射器注射纯水5-10ml，要缓慢注射，洗去水峰中的杂质，结晶。B，拆掉buffer，胶时可手动洗泵，从泵下方进胶处注射入纯水，也可contridationing regents洗泵。4. 操作注意：（1）操作时必须戴手套。（2）Hi-Di Formamide为变性剂，操作时需注意安全。（3）仪器运行时不能打开仓门，软件运行时勿进行其他软件的操作。