纤维素酶产生菌的分离及其酶活力测定.pdf

1、安徽农业科学。J o u r n a lo f A n h u iA 卵S c i 2 0 0 9 3 7C3 5)：1 7 3 2 3 1 7 3 2 5 1 7 3 5 7责任编辑王森责任校对卢瑶纤维素酶产生菌的分离及其酶活力测定巫小琴1,2 徐强1，李羰1，陶诗1，黎勇h(1 内江师范学院四川省高校特色农业资源研究与利用重点实验室，四川内江6 4 1 1 1 2；2 四川省德阳市绵竹市玉泉学校，四川绵竹6 1 8 2 1 9)摘要 目的 从自然界中分离纯化纤维素酶高产菌株并测定各茵株的最适发酵时问。【方法 利用刚果红变色圈法从花台土、湿地、菜地土、草坪土中分离产纤维素酶活力较高的茵样，通

2、过茵落形态、茵体形态镜栓及革兰氏染色反应鉴定为3 个不同种类的4 株放线茵，分剐命名为A l、A 2、A 3。用D N S 分光光度法对其所产纤维素酶活力分剐进行神l 定，并与枯草芽孢杆茵(B a c i l l u ss u b t i l i s)、青霉(P e n i c i l l i-啪)所产的纤维素酶活力进行比较。结果 菜地土中和草坪土中产纤维素酶茵酶活力分别比枯草芽孢杆菌酶活力高出1 8 1 4、4 0 5 0，而比青霉酶活力高出3 9 9 6、6 6 4 5；花台土中和湿地中的纤维素酶产生茵酶活力则分别比枯草芽袍杆茵酶活力低1 2 9 7、1 3 1 8，而比青霉酶活力高出3

3、1 1、2 8 6。此外，各菌株所产纤维素酶活力均与发酵时间密切相关，表现出明显的阶段性：初始阶段纤维素酶活力呈上升的趋势，各菌株分别在不同发酵时间达到酶活力最大值之后开始逐渐下降，回归于初始水平 结论 在从自然界中分离纤维素酶高产菌株的时候一定要把握好取样地点；培养时间的不同对不同茵株产酶的影响很大；选育纤维素酶高产茵株可以提高纤维素酶的工业生产效率。关键词纤维素酶产生茵：分离；酶活力；分析中图分类号s 1 8 2文献标识码A文章编号0 5 1 7 6 6 1 1(2 0 0 9)3 5 1 7 3 2 3 0 3I s o l a t i o no fC e l l i l l a 辨p

4、r o d u c i n gB a c t e r i aa n dD e t e r m i n a t i o n 仰T h d rE n z y m eA c t i v i t i e sW UX i a o-q i ne ta l(N e i j i a n gN o r m a lU n i v e r s i t y，K e yL a I，【)r a t o r yf o rR e s e a r c ha n dU t i l i z a t i o no nR e g i o n a lS p e c i a lA 鲥c u l t 吼lR e s o u r c e so

5、 f C o l l e g e sa n dU n i v e r s i t i e si nS i e h u a nP r o v i n c e，N e i j i a n g，S i c h u a n“l1 1 2)A b s t r a c t0 b i e c t i v e1T h ea i mw a st oi s o l a t ea n dp u r i f ye f f i c i e n te e l l u l a s e p r o d u c i n gb a c t e r i af r o mn a t u r ea n dd e t e r m i n

6、 et h e i ro p t i m u mf e 卜m e n t a t i o nt i m e M e t h o d T h es t r a i n sp r o d u c i n gh i s h e ra d i v ec e l l u l a s ew e r ei l a t e df r o mf l o w e r s t a n ds o t l，m o i s ts o l I，v e g e t a b l ef i e l ds e t la n dl a w ns o t lb yC o n g od i o l o r a t l o nc i r

7、c l em e t h o da n dt h e yw e r ei d e n t i f i e da s4s t r a i n so fA c t i n o m v c e so f3d i f f e r e n ts p e c i e sb ym i c r o s c o p i c a le x a m i n a t i o no nt h e i rC O O H Vs h a p e sa n ds o m a t i cs h a p e sa n dG r a m Ss t a i n i n ga n dn a m e dA 1 A 2a n dA 3 1

8、1 1 e i rc e l l,l a s ea c t i v i t i e sw e r ed e t e r-m i n e db yD N SS l D e c t r o p h o t o m e t r ya n dc o m p a r e dw i t ht h a to fB a c i l l 船s u b t i l i sa n dP e n i c i l l i u m R e s u l t I tw a ss h o w ni nt h er e s u l t t h a tt h ee e l l u l a$ea c t i v i t i e so

9、 fe e l l u l a s e p r o d u c i n gb a c t e r i af r o mv e g e t a b l ef i e l ds o t la n dl a w ns o t lw e r ee n h a n c e db y1 8 1 4 a n d4 0 5 0 r e s p i nc o r n-p a r i s o nw i t ht h a to fB s u b t i l i sa n de n h a n c e db y3 9 9 6 a n d6 6 4 5 r e s p i nc o m p a r i s o nw i

10、 t ht h a to fP e n i c i l l i u m：t h ec e l l u l a s ea c t i v i t i e so fc e l l u l a s e p r o d u c i n gb a c t e r i af r o mf l o w e r s t a n d i】a n dm o i s ts o t lw e r ed e c r e a s e db ya b o u t1 2，9 7 a n d1 3 1 8 r e s p i nc o m p a r i s o nw i t ht h a to fB s u b t i l

11、i sa n di n c r e a s e db y3 1 1 a n d2 8 6 r e s p i nc o m p a r i s o nw i t ht h a to fP e n i c 豇l i u m B e s i d e s t h ea c t i v i t i e so fc e U u l a s e sp r o d u c e db yv a r i o u ss t r a i n sh a dc l o s er e l a t i o n s h i pw i t hf e r m e n t a t i o nt i m e s h o w i n

12、go b v i o u ss t a g e：t h ec e l l u l a s ea c t i v i t ys h o w e di n c r e a s i n gt r e n di np r e l i m i n a r ys t a g e t h ec e l l u l a s ea c t i v i t i e so fv a r i o u ss t r a i n sr e a c h e dt h e i rm a x i m u m si nd i f i e r e n tf e r m e n t a t i o nl i m e，a n dt h

13、 e nt h e i rc e l l u l m s ea c t i v i-t i e sb e g a nt od e c r e a s eg r a d u a l l ya n dr e t u r nt ot h e i ri n i t i a ll e v e l C o n c l u s i o n S a m p l i n gs p o tw 鹤t h ek e yt oi s o l a t et h ec e l l u l a s e p r o d u c i n gb a c t e r i af r o mt h en a t u r e T h ed

14、 i j r e n c eo fc u l t u r et i m eh a dg r e a ti n f l u e n c eo nt h ec e l h d a s c-p r o d u c t i o n so fd i f f e r e n ts t r a i n s T h ei n d u s t r i a lp 胁d u c t i o ne f f i c i e n c yo fc e l l u l a s ec o u l db ee n h a n c e dhb r e e d i n ge 侬c i e n tc e l l u l a s e p

15、 r o d u c i n gb a c t e r i a K e yw o r d sC e l l u l n s e p r o d u c i n gB a c t e r i a；I s o l a t i o n；E n z y m ea c t i v i t y；A n a l y s i s纤维素是植物材料的主要成分，也是地球上最丰富的可再生资源。植物通过光合作用使光能以生物能的形式固定下来，其生成量每年高达20 1 3 0 亿t，这些能量相当于全球人类每年能源消耗量的2 0 倍，食物中所含能量的2 0 0 倍，是永远不会枯竭的可再生资源。纤维素在一定条件下可以被水解成单

16、糖，单糖可再通过微生物发酵生产各种有用的产品，如饲料、燃料、化工原料、食品、药品等，并且可取代目前淀粉原料发酵生产的各种产品以及由化工燃料合成生产的部分有机产品。纤维素被彻底分解而又无污染的一条有效途径，便是利用纤维素酶的水解作用一。因此纤维素的酶促水解具有很高的应用价值，但是纤维索酶解在经济上的可行性主要受到纤维素酶成本的限制“。目前有许多学者都在致力于选育纤维素酶高产菌株，以期能够高效地提炼出纤维素酶，并进一步应用于食品工业、饲料工业、水产业、洗涤工业等，以实现纤维素酶的经济价值。纤维素酶是水解纤维素生成纤维二糖及葡萄糖的一类酶的总称。微生物对纤维素的降解、转化是自然界中碳素转化的主要环节

17、【43。纤维索酶的来源有：真菌。所有能分解作者简介巫小琴(1 9 8 5 一)，士，四川成都人初级教师从事微生物研究。通讯作者。收稿日期2 0 0 9-0 8-2 6晶体纤维素的真菌，均能或多或少地分泌纤维素酶，所以纤维素酶的真菌源非常广泛。目前研究和生产中采用的菌种大多是木霉、曲霉和青霉等。制成酶制剂的有绿色木霉、黑曲霉、镰刀霉、拟青霉和斜卧青霉等的纤维素酶。细菌。在目前为人们研究较多的微生物中，细菌类有红黄纤维弧菌、普通纤维弧菌、纤维单胞菌属瘤胃球菌、镰状纤维菌和嗜纤维菌、多囊粘细菌、假单胞菌、荧光极毛杆菌。此外，放线菌中的黑红旋丝放线菌、玫瑰色放线菌和纤维放线菌，一些昆虫、软体动物、原生

18、动物也能产生纤维素酶。但是丝状真菌(T r c h o d e r m a)是公认产纤维素酶最高的菌种之一怕。目前，农村中大量的纤维素利用率很低，如畜禽饲料中含有大量的纤维素，除某些反刍动物具有分解纤维素能力外，大部分畜禽不具备此能力。在青贮饲料中加纤维素酶可使纤维素分解促进乳酸发酵，另外加纤维素酶后，由于纤维索被消化，乳酸发酵提高，贮存性能也提高。在饲料中添加纤维素酶后，喂幼鸡、仔猪及一般虚弱动物时，喂养效果明显喂蛋鸡可提高产卵量喂乳牛不仅可以使体重增加而且提高产乳量。2。因此，在当地自然条件下筛选出纤维素酶高产菌株可以用于农村小规模形式的青贮饲料、畜粪处理，这样既可以提高纤维素的利用率以促

19、进家畜养殖，也可以减轻农村中废弃植物体焚烧导致的大气污染。从自然界中分 万方数据1 7 3 2 4安徽农业科学2 0 0 9 盎离纯化纤维素酶高产菌株并测定各菌株的最适发酵时间可以提高纤维索酶的酶活力，进而提高纤维素的利用率，促进农村家畜养殖业的发展。l材料与方法1 1 材料1 1 1试剂。D N S 显色剂；2m o l L 氢氧化钠溶液；8 0 0gN a O H；lL 蒸馏水；羧甲基纤维素钠。1 1 2培养基。富集培养基：C M C，N a2 0 0g，胰蛋白胨2 0g，(N H 4)2 S 0 42 0g，M g s 0 4 7 H 2 00 3g，K H 2 P O。4 0g，蒸馏水

20、l0 0 0“，自然p H 值。平板筛选培养基：C M C 2 N a2 0 0g，(N H。)2 S 0 42 0g，K H 2 P 0 41 0g，N a C l0 5g，M g s 0 4 7 H 2 0 0 5g，刚果红O 2g，蒸馏水J0 0 0n d，琼脂2 0 0g，自然p H 值。摇瓶种子培养基：与富集培养基组分相同。摇瓶发酵产酶培养基：麸皮2 0 0g，胰蛋白胨2 0g，(N H 4)2 s o。2 0g，M 鲫。7 H 2 00 3g，K H 2 P O。4 0g，蒸馏水l0 0 0m l，自然p H 值。1 1 3主要仪器设备。D N P 睨7 2-1 A 电热恒温培养箱

21、，B L 5 0 立式压力蒸汽灭菌器筒，S W c J 一1 C U 双人单面净化工作台，微波炉，D H Z D A 大容量冷冻恒温振荡器，U V-2 1 0 0 紫外可见分光光度计，G L-2 0 G-I I 高速冷冻离心机，Y X S-8 型数显恒温水浴锅，O l y m p u s 生物显微镜。1 1 4试验取样。供试菌株取自内江师范学院校园内的草坪土、花卉研究所栽培大棚的花台土、水沟边的湿土以及山顶球场图书馆后的菜地土。1 2 方法1 2 1纤维素酶产生菌的分离。从花台土、草坪土、湿土、菜地土中取样，接入富集液体培养基，在3 0、5 0r r a i n 振荡培养3d。在平板筛选培养基

22、上进行培养，选变色圈较大的菌株，经反复培养和划线分离，获得降解纤维素的纯菌落。1 2 2纤维素酶产生菌的鉴定。对分离纯化出的4 个纤维素酶产生菌株进行革兰氏染色，并在显微镜下观察其菌株形态，初步鉴别其种类。1 2 3摇瓶产酶试验。取菌种l 环接种于装有2 0“液体种子培养基的2 5 0m l 三角瓶中，3 0、2 0 0r r a i n 振荡培养4 8h，按2 的接种量转移到3 0m K 2 5 0m l 的三角瓶)液体产酶培养基中，3 0、2 0 0r m i n 振荡培养，定时取样测定发酵液中的酶活力。1 2 4酶活力测定。葡萄糖标准曲线。按参考文献 7 测定并绘制标准曲线。粗酶液的制备

23、：取发酵液于4、50 0 0r r a i n 离心1 0r a i n，得上清液。D N S 法测酶活力：取4支带有2 0f n J 刻度的试管，1 支做空白对照，3 支做平行样品管，每支试管中加l“酶溶液，样品管置于5 0 水浴锅中预热2m i n，对照管置于沸水浴1 0r n j n，然后在4 支试管中加入4r r I l 已预热至5 0 的1 羧甲基纤维素钠为底物一。溶液，样品管置于5 0 水浴准确计时5l l l i n 取出。每管立即加入1m l2m o l L 氢氧化钠溶液和2m lD N S 显色液，摇匀后样品管与对照管都置于沸水浴准确计时3m i n 取出，流水迅速冷却，并用

24、蒸馏水定容2 0T I l l，摇匀后用分光光度计于4 8 5n l n处测定吸光度值。在上述条件下定义为1m i n 产生l 蝣葡萄糖为1 个酶活单位。2结果与分析2 1菌株的分离及其培养特征采集样品进行处理，采用平板筛选培养基进行培养。对菌株的鉴定应利用生理生化、生态、菌落形态等特征综合鉴定，但由于试验条件有限，因此仅利用菌落形态和革兰氏染色镜检对其进行初步的鉴定。试验筛选出的纤维素酶产生菌的透明罔比较大，菌落白色，表面较干燥，边缘粗糙，与培养基结合紧密，菌落形态如图l。经革兰氏染色鉴定出3 种菌株，并且均为G+反应，将花台土、湿地中纤维素酶产生菌命名为A l(图2)，菜地土中纤维素酶产生

25、菌命名为A 2(图3)，草坪土中纤维素酶产生菌命名为A 3(图4)。放线菌为呈丝状生长和以孢子繁殖的革兰氏阳性细菌一。因此，根据图J 中菌落的形态特征和革兰氏反应，可初步确定从土壤中分离出来的4 株纤维素酶产生菌均为放线菌。图1纤维素酶产生菌的C M C 平板照片F i g 1C I V I Cp l a t ep h o t o so fc e l l u l a s e-p r o d u c i n gb a c t e r i a图2 纤维素酶产生西A l 的显微照片飚2T h em i c r o g r a p ho fc d l u l a s e-p r o d u d n g

26、b a c t e r i aA 12 2D N s 法测酶活力结果2 2 16 株纤维素酶产生菌的酶活力。枯草芽孢杆菌和霉菌都是纤维素酶高产菌株，因此以纤维素酶高产菌株枯草芽孢杆菌(B a c i l l u ss u b t i l i s)、青霉(P e n i c i U i u m)为参照，对比所分离纯化的4 个菌株的纤维素酶活力。由表1 可以看出草坪土和菜地土中的纤维素酶产生菌的纤维素酶活力比参照菌株至少高出1 8 1 4 以上，是纤维素酶高产菌株；而花台土、湿地中的纤维素酶产生菌的纤维素酶活力比枯草芽孢杆菌低1 3 1 8，而比霉菌的纤维素酶活力高2 8 6。2 2 2不同发酵时

27、间对6 种纤维素酶产生菌的酶活力比较。由图5 可看出，发酵时间对纤维素酶活力的影响非常大。随着发酵时间的延长，纤维素酶产生菌所产的纤维素酶 万方数据3 7 卷3 5 期巫小琴等纤维素酶产生茵的分离及其酶活力测定1 7 3 2 5图3 纤维素酶产生菌A 2 的显微照片F i g 3T h eI I i c 啊鲫p bo fc e l l u l a s e-p r o d e c i n gb a c t e r i aA 2图4 纤维素酶产生菌A 3 的显微照片F i g 4T h em i c r o g r a p ho f l l u l a s e p r o d u c i n gb

28、 a c t e r i aA 3活力均在不断上升，但是发酵培养至一定时间后纤维素酶活力又开始逐渐下降，呈抛物线变化的趋势，在3 6 4 8h 呈快速增长趋势。草坪土中的纤维素酶产生菌在发酵至4 8h 所产纤维素酶活力达到最大，为1 1 8 9 4 6U m l；菜地土、湿地中的纤维索酶产生茵和枯草芽孢杆菌、青霉4 个菌株在发酵至4 2h 所产纤维素酶活力达到最大，分别为1 1 2 0 6 5、6 6 2 5 8、6 9 1 6 1、6 4 9 6 8U m l；而花台土中的纤维素酶产生菌在发酵至3 6h 所产纤维素酶活力达到最大，为6 6 9 0 3U m l。祝小等测定几株不同芽孢杆菌菌种

29、的纤维素酶活力在4 8h 酶活最高0 j；陈兵等试验表明，l 株芽孢杆菌碱性纤维素酶活力表16 种纤维素酶产生菌的酶活力T a b l e1T h ee n z y n l ea c t i v i t yo fs i xk i n d so fc e l l u l a s e p r o d u c i n gb a c t e-r i a名称吸光度D D。酶活力U m N a m eA b s o r b e n c yE n z y m ea c t i v i t y花台土菌株0 0 4 105 0 1 3湿地菌株0 0 4 245 0 O l菜地土菌菌株0 0 9 656 8 0

30、5草坪土菌株0 1 3 658 0 9 3枯草芽孢杆菌0 0 6 425 7 6 0青霉003794 8 6 2在6 0h 达产酶高峰，并且在6 0 9 0h 范围内酶活性保持稳定3；孙君社等测定l 株康氏木霉纤维素酶活力在较低的温度(2 6)下，菌体生长较慢，酶活高峰期出现晚，在1 0 8h 左右才出现且产酶值偏低；当温度较高(3 4)，在7 2h 左右即可出达产酶高峰期1 23。田新玉等试验表明，l 株芽孢杆菌产酶的时间范同在2 0 4 8h 13 1。菌种产酶的高峰时间与菌种的生长期有密切关系，一般在菌体生长的对数期，菌体代谢活动旺盛，分泌胞外酶的活性也最强。由于草坪土和菜地土中所含的枯

31、枝落叶比较多，且环境相对较适宜纤维素酶产生菌的生长，所以草坪土和菜地土中的纤维素酶产生菌的纤维素酶活力比较高；而花台士和湿地土壤中所含的枯枝落叶较少，因此其中的纤维索酶产生菌的纤维素酶活力较低。图5 不同发酵时间对酶活力的影响5T h ei n f l u e n c e so fd i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nt i m eo ne n z y m ea c t i v i t y3结论(1)从4 种不同性质土壤中分离纯化出来的4 个菌株均为放线菌，并且从该试验选出A l、A 2、A 33 种菌株中A 2、A 32 个菌株的产酶能力比较高。在富

32、含枯枝落叶的菜地土、草坪土中的纤维素酶产生菌的产酶能力较高并且所产纤维素酶活力很高。因此，在从自然界中分离纤维素酶高产菌株的时候一定要把握好取样地点。(2)从摇瓶产酶试验以及对酶活力的测定试验发现，培养时间的不同对不同菌株产酶的影响很大，草坪土、湿土、菜地土中的纤维素酶产生菌以及枯草芽孢杆菌、青霉在4 2 一镐h 产酶最为适宜，而花台土中的纤维索酶产生菌在3 6h 产酶最为适宜。因此，在实际生产过程中要针对菌株确定最佳的产酶时间，以此保证生产纤维素酶的效率。(3)选育纤维素酶高产菌株可以提高纤维素酶的工业生产效率。从自然界中筛选出纤维素酶高产菌株是一种比较简洁的方法。此外，选育纤维素酶高产菌株

33、也可以通过物理、化学诱变剂单独或复合处理微生物孢子或细胞的方法悼J。在纤维素酶高产菌株投人下业生产纤维素酶之前，必须对纤维素酶高产菌株的发酵产酶最适条件进行测定分析，如p H 值、温度、发酵时间以及不同碳源、氮源对纤维素酶活力的影响等。该试验由于时间和条件的限制，只探讨了发酵时间对不同纤维素酶产生菌的纤维素酶活力的影响。此外，可以尝试对选育出的菌株采用混合发酵培养以期获得酶活力高的混合纤维素酶。参考文献 1 熊立根，柴士名李旺纤维素酶及其应用研究进展 J 江西饲料2 0 0 8(4)：2 3 2 7 2 刘颖，林亲录纤维素酶制取与应用研究进展 J 中国食物与营养，2 0 0 6(4)：3 3 3 5(下转第1 7 3 5 7 页)万方数据”卷3 5 期梁小敏等白术茎是的离体快繁研究1 7 3 5 76 一B A(浓度在0 5m g L 以下)与低浓度的N A A(浓度在0 2m g L 以