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1、医学免疫学检验免疫荧光技术课件医学免疫学检验免疫荧光技术课件免疫荧光技术简介技术支持| 浏览次数： 416 | 时间： xx-2-22PriCells-免疫荧光技术( Immunofluorescence technique )1941 年，Coons等于首次米用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术fluorescent antibodytechnique )。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是： 非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。、荧光免疫技术的概念：免疫荧光技术( Immunof

2、luorescence technique )又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。 将抗原或抗体用荧光素进行标记， 标记的抗原或标记的抗体与相应的抗体或抗原反应后， 测定复合物中的荧光素， 这种免疫技术称为免疫荧光素技术。 免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。二、荧光免疫技术分类：1）荧光抗体显微镜技术：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。2）免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法三、荧光的产生：物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以 电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质

3、，称为荧 光素。由光激发所引起的荧光，为光致荧光；由化学反应所引起的荧 光，为化学荧光。四、荧光素的荧光特性：1）停止供能，荧光现象随即终止2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性入射光波长 发射光波长3)荧光效率：荧光效率 =发射荧光的光量子数 / 吸收光的光量子数4)荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱五、常见荧光素：1)异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC)FITC 纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种 异构体，其中异构体I型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更 优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490495n

4、m,最大 发射光波长为520530nm呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干 燥处可保存多年， 是目前应用最广泛的荧光素。 其主要优点是人眼对 黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。(2)四乙基罗丹明(rhodamine, RB200) : RB200为橘红色粉末,不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光 波长为570nm,最大发射光波长为595600nm,呈现橘红色荧光。3)四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamineisothiocynate, TRITC): TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末,较稳定。最大吸收光波长为550nm

5、,最大发射光波长为620nm,呈现 橙红色荧光，与 FITC 的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记 或对比染色。因其荧光淬灭慢,也可用于单独标记染色。(4)镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕(Eu3)、铽(Tb3)、铈(Ce3)等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范 围窄,荧光衰变时间长,最适合用于分辨荧光免疫测定。(5)藻红蛋白(P-Phycoerythrin ，P日：PE是在红藻中所发现 的一种可进行光合作用的自然荧光色素， 分子量为240kD的蛋白，最 大吸收峰为564 nm,当使用488 nm激光激发时其发射

6、荧光峰值约为576 nm对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用 585 21 nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用 575 13nm的带通滤光片。FL2探测器检测P吕6)多甲藻叶绿素蛋白 ( Peridinin chloroPhyll ProteinPerCP : PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD,最大激发波长的峰值在490nm附近, 当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为 677nm FL3探测器检测 PerCP。7)碘化丙啶( propidium iodide ，PI )：可选择性地嵌入核酸(DNA RNA的双螺旋碱基

7、对中。在对 DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA寸DNA荧光定量精度的影响。在488nm波 长激发下， PI 的发射光谱为 610-620nm。 FL2 探测器检测 PI。常见荧光素的特性：(1)FITC:黄色结晶粉末，吸收光：490-495nm发射光：520530nm明亮的黄绿色荧光。(2) RB200橘红色粉末，吸收光570nm发射光595600nm橘红色荧光。TRITC:紫红色粉末，吸收550nm发射光620nm橙红色荧光。镧系： Eu、TbPE:吸收光490560nm 发射光595nm,红色荧光。其它：酶作用后产生荧光物质。酶作用后产生荧光物质：酶 底物 产物 激发

8、光 发射光B-G MUG MU 360 450AP MUP MU 360 450HRP HPA 二聚体 317 414酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶 作用便形成具有强荧光的物质。例如，4-甲基伞酮-B -D半乳糖苷受B -半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm发射光波长为450nm其他如碱性磷酸酶的底物4-甲 基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。 镧系螯合物 某些 3 价稀土镧系元素如铕 (Eu3+) 、铽 (Tb3+) 等的螯合物可发射 特征性的荧光，而且激发光波长范围宽、发射光波长范围窄、荧光衰 变时间长，最适合于

9、时间分辨荧光免疫测定。六、合适荧光素的选择：1)具有与蛋白质形成共价键的化学基团。荧光效率高，标记后下降不明显。荧光色泽与背景色泽对比鲜明。标记后能保持生物学活性和免疫活性标记方法简单、快速。安全无毒CDC 实验一. 实验原理细胞表面抗原与相应的抗体（lgG13或IgM）特异性结合形成的 免疫复合物，可通过经典途径激活补体形成攻膜复合体而导致细胞膜二. 实穿孔。因此，水溶性染料如台盼蓝可进入受损细胞，染成蓝色，为阳 性反应；不带抗原的细胞，未损伤，不染色，为阴性反应。验步骤1.胸腺细胞悬液制备 颈椎脱臼法处死小鼠J暴露胸腔，分离出胸腺J镊子夹住胸腺反复轻轻研磨J单个细胞PBS 洗2次，lOOO

10、rpm, 10minJ加入5%J、牛血清PBS制备细胞悬液 调节细胞浓度至3-4 X 107/ml3.结果判断细胞膜穿孔的细胞呈蓝色， 细胞膜完整的活细胞不着色。 细 胞毒性作用的判断标准如下： 阴性反应 ( ) 死细胞占 0-10% 可 疑阳性反应 ( ) 死细胞占 11-20% 弱阳性反应 ( + ) 死细胞占21-50% 阳性反应 ( + ) 死细胞占 51-80% 强阳性反应 (+ ) 死 细胞占 81-100%4.结果记录1. 表格记录2. 照片展示5.讨论.第组成阳性的原因：实验中加入抗原、抗体、补体、 LG抗原抗体能形成抗原抗体免疫复合物， 通过经典途径激活补体， 形成攻 膜复合

11、物，从而导致细胞膜穿孔，细胞受损，台盼蓝进入细胞，染成 蓝色，呈阳性反应。说明CDC实验必须要有抗原、抗体、补体共同参 与。.第组成阴性的原因：实验中加入抗体、LG因为无抗原和补 体，不能形成抗原抗体免疫复合物，也无补体，因此不能形成攻膜复 合物，不能使细胞膜穿孔，细胞无损伤，台盼蓝无法进入细胞，不能 被染成蓝色，呈阴性反应。说明 CDC实验必须要有补体的参与。.第组呈阴性的原因：试验中加入 LC和补体，因为无抗原抗体，所以没有抗原抗体免疫复合物的形成，补体不能被激活，不能形 成攻膜复合物，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色，呈阴性反 应。说明CDC实验必须要有抗原、抗体的参与。.第组呈阴性

12、的原因：实验中只加入 LC,既无抗原抗体免疫复合物的形成，也无补体，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色， 呈阴性反应。说明CDC实验必须要有抗原、抗体、补体的共同参与。免疫学诊断技术军事医学科学院附属医院 陈建魁主要内容：第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 抗原抗体反应 免疫学检测常用标记技术 免疫细胞的检测 免疫分子的检测 免疫相 关基因的检测 免疫学检测方法的应用第一节 抗原抗体反应抗原抗体反应 : 抗原与相应抗体在体内或体外发生的 特异性结 合反应。 应用已知抗体或抗原检测抗原或抗体，可以对感 染性、非 感染性致病因子或疾病相关因子进行诊断或辅助 诊断。1 、特异性 2 、

13、适合比例性 3 、可逆性抗原抗体反应的特异性：一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合， 这种 抗原抗体 结合反应的专一性即特异性。 抗原抗体结合力的大小，常用亲和力(affinity) 或亲合 力 (avidity) 来表示。 亲和力是指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原 决定基之间的结合强度。 亲合力是指 整个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。适合比例性:抗体含量抗原含量前带等价带后带在抗原抗体特异性反应时，当抗原与抗体达到最适比例时，沉淀物形成 最多。如果抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成，这种现象 称为带现象。 出现在抗体过量时，称为前带。在抗原过量时，称为 后带。抗体过剩抗原抗体

14、比例合适抗原过剩网格学说( lattice theory )可逆性：Ag+AbK （亲和常数）Ag Ab抗原抗体反应的影响因素1、电解质浓度2、酸碱度（pH: 68） 3、温度（3742C）抗原抗体反应类型：根据抗原性质、出现结果的现象、参与反应 成分的不同，可将抗 原抗体反应分为： 凝集反应 沉淀反应 补体参加的反应 采用标记物 的抗原抗体反应等颗粒性抗原 （ 细菌、红细胞等 ） 与相应 抗体结合后形成凝集团块， 这一类反应称 为凝集反应 （agglutination） 。该类反应 可检测到ug/ml 水平的抗体。1. 直接凝集反应细菌或红细胞 等颗粒性抗原抗体2. 正向间接凝集反应载体颗粒

15、可溶性抗原 例如，用丫球蛋白包被的胶乳颗粒，检测病人血清中 的 抗人丫球蛋白的抗体（类风湿因子）。3. 反向间接凝集反应载体颗粒抗体可溶性抗原可溶性抗原 ( 如：血清蛋白质、 细胞裂解 液等)与相应抗体结合后 出现沉淀物，此类反 应称为沉淀反应 (precipitation)液相沉淀反应絮状沉淀反应 环状沉淀反应抗血清 抗原 + 抗原 抗体 +免疫比浊法：在定量抗体中分别加入不同浓度的抗原， 经一定 时间后可形成免 疫复合物。 用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越 多，浊度 越高，可根据标准曲线计算出样品中的 抗原含量。 该法快速简便， 可取代免疫扩散法测定 Ig 含量。凝胶内沉淀反应免疫

16、扩散技术 免疫电泳技术火箭电泳 单向扩散试验 对流电泳 双向扩散试验 免疫电泳Ag Ab Ag第二节 免疫学检测常用的标记技术免疫标记技术 (immunolabelling technique) 是指用荧光素、 放 射性核素、酶、发光剂或电子致密物质 ( 胶体金、铁蛋白 ) 作为示踪 剂标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 此类方法具有灵敏、 特异、 快速，能够定性、定量甚至 定位测定，结果易于观察、适合自动化 检测等很多优点。广 泛用于各种生物活性物质的分析鉴定与定量检 测。根据标记物与检测方法不同，标记 技术可分为 :免疫荧光技术 放射免疫测定 免疫酶标技术 发光免疫分析 免疫 金标记技术主

17、要的免疫标记物类别 荧光素 标记物 FITC、 藻红蛋白（ PE） 用途 免疫组化 免 疫分析测定 放射性核素 酶 3H、51Cr、32P、 125I 、131I免疫分析测定 免疫组化 免疫分析测定HRP 、AP化学发光物 Luminol 金属颗粒 胶体金免疫分析测定 免疫组化 免疫分析测定用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检 标本中的抗原反应， 抗原抗体复合物散发荧光， 借此对标本中的抗原作鉴定和定位。（ 一） 免疫荧光显微技术1 直接荧光法：将荧光素直接标记抗体，作标本染色。优点 : 简 便易行。缺点 : 每检查一种抗原必须制备相应的荧光抗体。 2 间接 荧光法：首先用一抗与标本中的抗原

18、结合，再用荧光素 标记的二抗 染色。优点 : 敏感性高，制备一种荧光素标记的 二抗可用于多种抗 原的检查。缺点：非特异性荧光容易增多。 3 补体结合免疫荧光法 行 示踪。 在抗原-抗体反应时加入补体， 使之 与抗原-抗体复合物结合； 再用荧光素标记的抗补体抗体进直接法间接法补体法双标记法( 二)流式细胞术 (flow cytometry ，FCM)免疫荧光技术应用于流式细胞仪 , 可对细胞的表面标 志（ 抗原或 受体） 进行快速、精确的分析和自动检测 , 并可将不同类型的细胞分 选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA RNA蛋白 质和细胞体积等 ) 进行多信息分析，是生命科学研究 领

19、域广泛应用的一项 新技术。( 三) 荧光免疫测定 (fluoroimmunoassay ，FIA)1.荧光偏振免疫测定： (fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 荧光物质经偏振光蓝光照射而跃入激发态，在 恢复至基态 后可释放出光子，经偏振仪形成偏振光，测定其强度可 得到样 品中待测物质的浓度。 主要用于小分子物质 ( 特别是药物浓 度)的测定。2. 时间分辨荧光免疫测定 (time-resolved fluoro -immunoassay，TR-FIA) 镧系稀土元素具有较长的荧光寿命， 用其标 记抗原或抗体， 并利用时间分辨荧光分析仪延缓 测

20、量时间，可以消除非特异性本底 荧光的干扰， 所得信号完全是特异荧光， 此法灵敏度高、特异 性好。3. 酶联荧光免疫测定 (enzyme linked fluoro -immunoassayELFIA) 应用具有潜在荧光的物质作为酶的底物， 经过酶解反应产生 高强度荧光，可用荧光仪进 行定量测定。放射免疫测定法 (radioimmunoassay,RIA) 是 用放射性核素标记 抗原或抗体进行免疫学检测的 技术。将放射性核素的高灵敏性和抗原抗体反应 的特异性相结合 ,使检测的敏感度达 pg/ml 水平。 常用 的放射性核素有 125I 和 131I 。常用于微量物质 测定，如胰岛素、 生长激素、

21、甲状腺素、孕酮等 激素，吗啡、地高辛等药物以及 IgE等。三、免疫酶标技术以酶标记抗体 （ 或抗原）用于免疫学检测，通 过酶催化底物显色， 对细胞或组织标本中的抗 原- 抗体复合物进行定位、 定性分析； 亦可 根据 酶催化底物显色的深浅程度， 定量测定体液中抗 原或抗体的含 量。( 一)酶免疫组织化学技术 (enzyme immunohistochemistry,EIH)通过酶解底物、显色来示踪抗原抗体结合物的存在部位。 酶免组化 染色标本可在普通光学显微镜下观察， 并能长期 保存。 辣根过氧化 物酶的底物二氨基联苯胺（DAB）的分解产物适 于电镜观察。 常用的 方法：亲和素-生物素-过氧化物

22、酶复合物法（avidin - biotin - peroxidase plex ，ABC），过氧化物酶-抗过 氧化物酶法（PAP）和碱 性磷酸酶 -抗碱性磷酸酶法 （APAAP）。（二）酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA） 1.非均相酶免疫测定(heteroge neous en zyme immuno assay) 根据是否使用固相支持物作为吸附抗体(或抗原)的载 体，可分为固相EIA和液相EIA两类方 法。其检测的敏感度 达ngpg/ml水平。常用的固相EIA法是酶联 免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)，此

23、法以聚苯乙烯制品或NC膜等作为固相载体。(1) 双抗体夹心法：用于检查特异抗原。首先将已知抗体 包被在 酶联板上，加入待检标本，标本中若含有相应 抗原即与固相上的抗 体结合，洗涤去除未结合成分， 加入抗原特异的酶标记抗体，洗去 未结合的酶标记抗 体，加底物后显色。一般而言，包被抗体和酶标 记抗 体是识别同一抗原上的不同抗原决定基的 2 种抗体。(2) 间接法：用于检查特异抗体。用已知抗原包被 固相，加入待 检血清标本，再加酶标 记的二抗，加底物观察显色反应。免疫印迹法 (Immunoblotting) ： 它将凝胶电泳与固相免疫结合， 是把电泳分区 的蛋白质转移至固相载体， 再用酶免疫、 放射

24、 免疫等 技术测定。 此法能分离不同分子大小的蛋白质并确定其分 子量，常 用于检测病毒的抗体或抗原。免疫 PCR(immuno-PC，RIM-PCR) 是将免疫反应的特异性与 聚合 酶链反应(PCR)的敏感性相结合的免疫学检测技术。首先用连接分子（如biotin） 将DNA分子连接到抗体上；然后与吸附在固相载体上的待测抗原结合，形成抗原 -抗体-DNA复合物；然后用特异性引物对 DNA&行PCRT增，检测其 扩增产物，可 定量测定与DNA标记抗体相对应的抗原。该法与ELISA基本相似, 不同的是用DNA标记代替了酶标记，通过观察PCR扩增产物来判定结果。2.均相酶免疫测定 (homogeneo

25、us enzymeimmunoassay， HEI) 将 待测样品、酶标试剂和底物溶液混合， 待 抗原-抗体反应完成即可直 接测定结果，整个检 测过程都在均匀的液相中进行。四、发光免疫技术发光免疫测定 （luminescence immunoassay ， LIA） 是将发光系统 与免疫反应相结合，用于检测抗 原或抗体。1. 化学发光免疫测定 (chemiluminescenee immunoassay ， CLIA)以化学发光剂 （ 如鲁米诺、吖啶酯等 ） 标记抗体或 抗原，免疫反应完成后，直接引发化学发光反应进行 检测。 2. 生物发光免疫测定(bioluminescence immuno

26、assay ，BLIA) 利用生物发光物质 ( 如萤火 虫荧光素)或参与生物 发光反应的辅助因子(如ATR NAD等)标记抗原或抗 体，利用生物发光反应进行检测。3. 化学发光酶免疫测定 (chemiluminescence enzymeimmunoassav，剂，通过化学发光反应进 行检测。 4. 电化学发光免疫测定 (ECLIA) ， 该法是在电极表面由 电化学引发的特异性化学发光反应。化学电化学发光(electrochemiluminescenee ，ECL)是在电极表面引 发的特异性化学发光反应，包括电化学和化学发光两个过程。发光剂三联吡啶钉Ru(bpy)32+和三丙胺(TPA)在阳电

27、极表面同时 各失去一个电子发生氧化反应。 二价的 Ru(bpy)32+ 被 氧化成三价， 后者是一种强氧化剂。可将TPA氧化成阳离子自由基TPA+*，后者很 不稳定，自发地失去一个质子(H刃，形成自由基TPA*,这是一种 非常强的还原剂。可将三价的 Ru(bpy)33+ 还原成 激发态的二价Ru(bpy)32+* 。接着激发态的 Ru(bpy)32+* 衰减成 基态的Ru(bpy)32+，同时发射一个波长620nm的光子。TPA*自身被氧化成二丙胺和丙醛。 这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多 光子，使光 信号得以增强。五、免疫金标记技术免疫金标记技术 (immunogold label

28、ling technique) 是以胶体金 作为示踪标志物用于抗原抗体反应检测。 胶体金标记的抗体可直接 用于检测细胞表面和组织切 片中的抗原或受体，并可在普通光学显 微镜下观察， 称为免疫金染色法 (immunogold staining ， IGS)。 在IGS 的基础上，可用银离子增强免疫金标记技术的敏 感性，称为免疫金银染色法 (immunogold silver staining ， IGSS)。第三节免疫细胞的检测一、免疫细胞的分离与纯化(一)白细胞的分离 血液中红细胞与白细胞的比例约为 600 1000:1 ，两类细胞 比重( 密度)不同，沉降速度各异，可采用下述方 法分离。 1

29、. 自然沉降法 : 采用肝素抗凝静脉血，由于红细胞的沉降 率 较快，可使白细胞与之分离。 2. 高分子聚合物加速沉降法 某些 高分子聚合物 ( 如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等 ) 可使红细胞呈 钱串 状凝聚，加速其沉降，从而更易与白细胞分离。( 二) 外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞 (peripheralblood mononuclear cell,PBMC) 指淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.0751.090 ;红细胞和多核白 细 胞的密度为1.092左右；血小板为1.0301.035。因此，利用等渗 溶液进行密度梯度离心， 可分离不同类别的细胞。 1. 聚蔗糖-泛影

30、葡 胺(ficoll-hypaque ，F-H)法：将聚蔗糖和 泛影葡胺配制成密度为1.077 的分层液，将肝素抗凝血加在 分层液上，离心后形成不同层 次的液体和细胞区带，从而分离出PBMC分离动物MNC勺分层液 密度:大鼠 1.0841.087 ，小鼠 1.0802.Percoll 分层液法: Percoll 是经聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 处理的 硅胶微粒混悬液，对细胞无毒、无刺激性。 (1) 连续密度梯度离心 法： Percoll 混悬液的硅胶颗粒大 小不一，经过高速离心后，使分 层液形成一个从管底到液 面密度逐渐递减的连续密度梯度，可将密 度不等的细胞分 离纯化。 (2) 不连续密度梯

31、度离心法：将 Percoll液和 Hanks 液配制 成不同浓度的分离液，将分离液按浓度大小依次 叠加至离 心管中，形成不连续密度梯度分离液，用于分离PBMC悬液 的各细胞组分。( 三) 淋巴细胞的纯化与亚群分离PBMC 悬液主要含淋巴细胞， 但还混杂有数量不等的单核细胞、 粒 细胞、红细胞和血小板。为获得高纯度的淋巴细胞或其 亚群，可采 用如下分离方法。 1. 去除红细胞 : 用无菌蒸馏水低渗裂解或 0.83%氯化铵处理。2.去除血小板：离心洗涤，可去除PBMC中绝大部分混 杂的血小板。 采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除血小板。FCS可让PBMCi过，而阻止血小板通过。3.去除单核细胞和粒细胞 (1) 黏附法：单核细胞和多核白细胞具 有黏附能力，可与玻璃、塑料或Sephadex作用，采集的非黏附细 胞 即为淋巴细胞。 (2) 羰基铁粉吞噬法： 单核细胞吞噬羰基铁粉后细胞 密度增大， 经聚蔗糖 -泛影葡胺密度梯度离心； 或待 单核细胞充分吞 噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞吸至 管底，上层液中即含较纯的淋巴 细胞。