药物代谢酶及药物作用靶点基因检测技术指南试行.docx

1、药物代谢酶及药物作用靶点基因检测技术指南试行药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)前言药物体内代谢、转运及药物作用靶点基因的遗传变异及其表达水平的变化可通过影响药物的体内浓度和敏感性，导致药物反应性个体差异。近年来随着人类基因组学的发展，药物基因组学领域得到了迅猛发展，越来越多的药物基因组生物标记物及其检测方法相继涌现。药物基因组学已成为指导临床个体化用药、评估严重药物不良反应发生风险、指导新药研发和评价新药的重要工具，部分上市的新药仅限于特定基因型的适应症患者。美国FDA已批准在140余种药物的药品标签中增加药物基因组信息，涉及的药物基因组生物标记物42个。此外，部分行业指南也将部

2、分非FDA批准的生物标记物及其特性（如MGMT基因甲基化）的检测列入疾病的治疗指南。药物反应相关基因及其表达产物的分子检测是实施个体化药物治疗的前提。药理学与遗传学结合的关键环节包括药物代谢动力学（pharmacokinetics，PK）和药物效应动力学（pharmacodynamics，PD）两方面。药物代谢动力学主要是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律，侧重于阐明药物的体内过程；药物效应动力学主要研究药物对机体的作用、作用规律及作用机制，其内容包括药物与作用靶位之间相互作用所引起的生化、生理学和形态学变化，侧重于解释药物如何与作用靶点发生作用。对药物代谢酶和药物靶点基因进行检

3、测可指导临床针对特定的患者选择合适的药物和给药剂量，实现个体化用药，从而提高药物治疗的有效性和安全性，防止严重药物不良反应的发生。目前美国FDA和我国食品药品监督管理局（CFDA）都已批准了一系列的个体化用药基因诊断试剂盒。这些试剂盒基本都是对人DNA样本进行基因检测。而在基因表达的检测方面，由于RNA的稳定性差，样本处置不当可导致目标RNA降解，使得检测结果不准确，影响临床判断。因此，RNA检测试剂的研发相对滞后。本指南旨在为个体化用药基因检测提供一致性的方法。本指南中所指的药物基因组生物标志物不包括影响抗感染药物反应性的微生物基因组变异。此外，肿瘤靶向治疗药物个体化医学检测指南见肿瘤个体化

4、治疗的检测技术指南。本指南起草单位：中南大学湘雅医院临床药理研究所、中南大学临床药理研究所、中南大学湘雅医学检验所，并经国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会、中国药理学会药物基因组学专业委员会、中国药理学会临床药理学专业委员会和中华医学会检验分会组织修订。本指南起草人：周宏灏、陈小平、张伟、刘昭前、尹继业、李智、李曦、唐洁、俞竞、彭静波、曹杉、成瑜。 1.本指南适用范围 12.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测概述 13.标准术语 14.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析前质量保证 64.1采样前准备 64.2标本采集 74.3标本的运输与保存 94.4标本的接收与保存 95.药物代谢酶

5、和药物作用靶点基因检测分析中质量保证 105.1实验室设计要求 105.2检测方法 115.3仪器设备的使用、维护与保养 175.4人员培训 175.5检测体系的性能验证 186.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析后质量保证 196.1.检测报告、解释及报告发放 196.2检测后样本的保存和处理 237.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的质量保证 237.1 检测确认和特征描述 247.2可操作性的SOP编写 247.3质控品与室内质控 247.4室内质控的评价 267.5室间质量评价 268.制度 27附录A. 基因及突变名称、核酸信息 28附录B. 缩略语 30附录C. 药物代谢酶和药物

6、作用靶点基因检测项目列举 33附录D. 药物代谢酶和药物作用靶点基因相关的药物 50参考文献 521. 本指南适用范围本指南由国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定，旨在为临床检验实验室进行药物代谢酶和药物靶点基因的检测提供指导。本指南的主要适用对象为开展个体化医学分子检测的医疗机构临床实验室。2. 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测概述药物代谢酶和药物作用靶点基因特性的变化可通过影响药物的体内浓度和靶组织对药物的敏感性，导致药物反应性（包括药物的疗效和不良反应发生）个体差异。药物基因组生物标志物的检测是临床实施个体化药物治疗的前提。从药物代谢酶和药物作用靶点基因出发，对个体化用药基因检

7、测的适应人群、标本采集、运输、接收、处理、样本检测、结果报告与解释、室内室间质控需遵循的基本原则，以及可能出现的问题与应对措施等方面的内容进行介绍，可为基于药物代谢酶和药物作用靶点的基因检测提供标准化指导。3. 标准术语3.1 Ct值（threshold cycle）荧光定量PCR反应的荧光强度超过设定的阈值所需的循环数。Ct值位于PCR反应的指数期初期，与标本中待测核酸分子的原始拷贝数呈反比，即样本中原始拷贝数越多，荧光强度升高的就越快，相应的Ct值就越小。3.2 RNA（ribonucleic acid）核糖核酸，与DNA类似的单链核酸，由核糖核苷酸按照一定的顺序排列而成，含尿嘧啶而不含胸

8、腺嘧啶，存在于细胞质和细胞核中，在细胞蛋白质的合成及其他化学活动中起重要的作用。RNA分子包含信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）和其他小RNA等多种类型，分别行使不同的功能。各种RNA的混合物称为总RNA。3.3 rs和ss体系SNP由美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）建立、dbSNP数据库制定的SNP命名体系，rs体系的SNP代表已获得官方认可和推荐的参考SNP（reference SNP），ss体系的SNP代表用户新递交但尚未得到认可的SNP（submitte

9、d SNP）。 3.4 TE缓冲液TE缓冲液由Tris和EDTA配置而成，主要用于溶解DNA，能稳定储存DNA。 3.5错配修复（mismatch repair，MMR）在含有错配碱基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢复的核甘酸修复方式，这种类型的修复可纠正DNA双螺旋上错配的碱基对，还可修复因复制打滑而产生的核苷酸插入或缺失。MMR的过程需要区分母链和子链，做到只切除子链上错误的核苷酸，而不会切除母链上的正常核苷酸。修复的过程是：识别出正确的链，切除掉不正确的部分，然后通过DNA聚合酶III和DNA连接酶的作用，合成正确配对的双链DNA。3.6单核苷酸多态性（SNP）是指由单个核苷酸A、T、

10、C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。3.7等位基因一般是指位于一对同源染色体相同位置上控制某一性状的不同形态的一对基因。若成对的等位基因中两个成员完全相同，则该个体对此性状来说是纯合子。若两个等位基因各不相同，则该个体对该性状来说是杂合子。3.8 5-氟尿嘧啶一种嘧啶类似物，作为胸苷酸合成酶抑制剂，阻断DNA复制的必需原料胸腺嘧啶的合成。主要用于肿瘤的治疗。3.9光密度表示紫外光照射下被检测物吸收的光密度，260nm波长下的吸光值（DNA吸收峰值）可用来表示DNA的相对浓度，具体换算公式为：DNA浓度（ng/ l）=OD260 X 50 X 稀

11、释倍数。3.10基因芯片将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）的核酸探针分子固定于支持物上并与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。3.11基因是遗传物质的最小功能单位，是指具有一定生物学意义的一段DNA。3.12基因型又称遗传型，是某一生物个体全部基因组合的总称，它反映生物体的遗传构成，即从双亲获得的全部基因的总和。据估计，人类的结构基因有3万个。因此，整个生物的基因型是无法表示的，遗传学中具体使用的基因型，往往是指某一性状的基因型。3.13基因组生物标志物是一种可用于指示正常生物学过程、病理过程和/或对治疗及其他干预措施反应性的可测

12、量的DNA或RNA特性。其中DNA的特性可包括但不仅限于单核苷酸多态性、短序列重复次数多态性、单倍型、DNA修饰如甲基化、核苷酸的插入/缺失、拷贝数变异及细胞遗传学重排如转位、重复、缺失或反转。RNA特性包括但不仅限于RNA序列、RNA表达水平、RNA处理过程（如剪接和编辑）、微小RNA。3.14检出限（limit of detection，LOD）标本中一种分析物可被检出的最低的含量，这一分析物含量可能不是量化的具体数值。3.15健康保险隐私及责任法案（health insurance portability and accountability act，HIPAA）美国政府1996年颁布的

13、、医疗服务行业必须遵守的法案。该法案制定了一系列安全标准，就保健计划、供应商及结算中心如何以电子文件的形式传送、访问和存储受保护的健康信息做出了详细的规定。3.16聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术，应用该技术可以在短时间内将一个或几个DNA拷贝扩增到百万数量级。3.17临床检验实验室是指对取自人体的各种标本进行生物学、微生物学、免疫学、化学、血液免疫学、血液学、生物物理学、细胞学等检验，并为临床提供医学检验服务的实验室。3.18灵敏度（sensitivity）测量系统的示值变化除以相应的被测量值变化所得

14、的商。3.19室内质量控制实验室内进行的用于满足质量要求的操作技术和活动。3.20室间质量评价室间质量评价是多家实验室分析同一标本，并由外部独立机构收集和反馈实验室上报结果、评价实验室操作的过程，也称能力验证。3.21脱氧核糖核酸（DNA）核酸的一种，是由特殊序列的脱氧核糖核苷酸单元（dNTP）构成的多聚核苷酸，起携带遗传信息的功能。DNA为一种双链分子，通过核苷酸碱基对间的氢键维系。DNA包含的4种核苷酸包括：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（G）。人类存在两种类型的DNA：来自染色体的基因组DNA（gDNA）和线粒体DNA。3.22能力验证（proficiency tes

15、ting，PT）多个标本周期性地发送到实验室进行分析和（或）鉴定，将每一实验室的结果与同组的其他实验室的结果或指定值进行比较，并将比较结果报告给参与的实验室，同室间质量评价。3.23生物标记物（biomarker）患者标本中所含有的一种特殊的分析物质（如DNA、RNA、蛋白质等），可用于疾病诊断、判断疾病分期或评价新药或新疗法在目标人群中的安全性和有效性。3.24微卫星指基因上含有重复的DNA短小序列或单核苷酸的区域，每个单元长度在1-6 bp之间。根据重复单元的构成与分布，微卫星DNA序列可分为3种类型：单一型、复合型和间断型。3.25微卫星不稳定性（microsatellite insta

16、bility，MSI）是指肿瘤基因组特定的微卫星位点与其对应的非肿瘤基因组相比，因重复单位的缺失或插入而造成的结构性等位基因的大小发生改变，出现新的微卫星等位基因现象。3.26线性在已知的范围内，某检测提供的结果能够直接与标本的浓度（或量值）成比例关系的能力。3.27相对定量通过标准曲线法和CT值比较法测定目的基因的相对表达量，以比较两个或多个样本中目的基因的表达差异。该方法通常用来检测基因表达量是上调还是下降。3.28遗传药理学研究机体的基因多态性对药物反应个体差异的影响，是药物基因组学的重要内容。3.29药物不良反应（adverse drug reaction, ADR）是指上市的合格药品

17、在常规用法、用量情况下出现的，与用药目的无关，并给患者带来痛苦或危害的反应。3.30药物的反应性包括药物吸收和分布（即药代动力学）、药物效应（如药物效应动力学）、药物的疗效及药物不良反应。3.31药物基因组学研究人类基因组信息与药物反应之间的关系，同时也可以发现药物新靶点和提高临床试验的成功率。3.32荧光定量PCR通过应用荧光染料或荧光标记的特异性探针，对聚合酶链反应产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，结合相应的软件可以对荧光信号进行分析，实现基因检测的定性和（或）定量分析。3.33荧光原位杂交（FISH）一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核酸探针只与具有高度相似性

18、的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位和定量。3.34杂交两个以上的分子具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体，杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链被称为核酸杂交。3.35知情同意（informed consent）患者有权利知晓自己的病情，并可以对医务人员所采取的治疗措施和临床检测项目有决定取舍的权利。3.36控制品仅用于质量控制目的而不是用于校准分析的标本或溶液。3.37准确度（accuracy） 是测量结果中系统误差与随机误差的综合，表示测量结果与真值的一致程度。3.38 正确度（trueness）无穷多次重复测量

19、所得量值的平均值与一个参考量值间的一致程度。3.39 精密度（precision）是指在一定条件下进行多次测定时，所得测定结果之间的符合程度，表示测量结果中的随机误差大小的程度。3.40 特异性（specificity） 在出现干扰现象（影响量）时，试验或检测程序能够正确地识别或定量确定某一实体物质的能力。4. 药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析前质量保证根据临床检验实验室的条件确定合适的分子诊断项目和恰当的样本处理是确保核酸定性定量检测准确性的关键。标本在检测前必须确保标本的采集、运输和储存符合要求。标本处置不当可能引起核酸降解，导致定量检测结果不准确。4.1 采样前准备1）分子诊断项目的

20、申请与完善药物代谢酶和药物作用靶点基因检测采样前需填写规范的申请单，申请单应包含足够的信息，以识别患者和有资格开具申请单的临床医生。临床医生应根据临床需求合理选择分子诊断项目。个体化用药领域发展迅速，临检实验室应加强与临床医师的沟通，及时指导临床医师选择有价值的诊断项目，帮助医师合理解释检验结果；不断接受正确合理的临床医师的反馈意见，及时了解临床对个体化用药分子检测的需求，优化项目目录。实验室应根据其具体的工作流程，确定质量监测指标，如患者诊断信息完整率、适当临床判断率等，并定期对数据进行回顾性分析，定期对检验申请进行评审。2）患者的正确识别及知情同意患者的正确识别是确保获得正确的临床标本的前

21、提。收集标本的容器上应注明患者的信息，通常应包括姓名、送检医院及科室、住院号等。医护人员在采样前需首先核对确定患者的身份，核实能标示患者的信息。标本收集前应向患者介绍个体化用药基因检测的意义，以得到患者的认同，即知情同意。采样前需告知患者所检测项目的目的、意义、基本过程、项目可能存在的不足如检测结果可能出现与临床用药实际不相符的情况、剩余核酸的去向（包括可能匿名用于科研项目）及保存时间，保护受检者的个人隐私（包括医疗记录和医疗数据）。对实施有创检查的分子诊断项目如穿刺取活检组织，应清楚地告知患者及家属检查可能遇到的风险和紧急情况下的紧急预案。知情同意书是医方履行如实告知义务的证据，也是患者行使

22、选择权的书面依据。3）送检单的填写与项目的复核标本采集前需填写送检申请单，提供受检者必需的信息。申请单需填写的信息包括：申请的检测项目、标本编号、受检者姓名、性别、出生日期、民族、采样日期及时间、标本来源（组织类型）、相关临床资料（如身高、体重、疾病诊断、疾病分型分期、合并疾病、用药情况）、采样单位及科室名称、送检医师姓名等信息。临检实验室应有专业人员根据信息采集表对检测项目的合理性进行审核，必要时可与送检医师讨论。4.2 标本采集临床分子诊断实验室应对各种个体化用药分子诊断临床标本的采集按检测要求建立SOP。标本采集人员应经过系统的培训。采样前应对标本采集容器进行评价，确保容器本身不会干扰测

23、定过程，并保存评估记录。用于药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的标本在采集时间上无特殊要求。静脉血液采集之前应按要求对预采血的部位彻底消毒。肿瘤组织中DNA的分析利用常规诊断所用的标本即可，但用于RNA分析的标本需专门采集，并准备好液氮等速冻所需的材料及设备。标本采集需要在密闭、一次性采样系统中完成，所用的材料如注射器、棉签、拭子等应为一次性使用，以防止污染。无论采集哪种类型的标本，采样时都必须戴手套，以避免标本中病原微生物感染和皮肤脱落细胞对标本的污染。用于药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的标本类型有多种，包括全血标本、组织标本（新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织、穿刺标本）、口腔拭子、骨髓、胸

24、腹水等。样本采样原则见个体化医学检测质量保证指南。1）全血和骨髓标本全血标本采集到含有适当抗凝剂或添加物的采样管中，添加物根据被测量（DNA、细胞内RNA）、检测项目和采样体积而定。因肝素可抑制PCR，全血或骨髓标本一般用EDTA或枸橼酸盐抗凝。采样前需在采样管或注射器上标注标本信息。全血标本采集外周静脉血23 mL并置于采血管中，将采血管轻轻颠倒混匀数次以确保充分抗凝，避免溶血。如检测目的是细胞内RNA，建议用含RNA稳定剂的采样管，或采样后尽快将全血或骨髓加入到RNA稳定溶液中。采集干血斑标本时，可向无菌滤纸上滴加约50 L全血，根据需要可连续在数个印圈上滴加标本，于室温自然干燥至少4小时

25、。干血斑标本采集时不要堆叠血斑，不与其他界面接触，待血斑充分干燥后应放入无菌袋中，避免血斑之间的相互污染，同时加入干燥剂和湿度指示卡，密封包装后运送。2）组织标本当待检测的组织与血液或口腔脱落细胞基因型不一致时，或当组织是待测核酸必须的来源时（如检测肿瘤组织中mRNA表达、融合基因、基因扩增或缺失、甲基化水平、微卫星不稳定等），需采集组织标本进行检测。可用的组织标本包括新鲜组织、活检组织、石蜡包埋组织和石蜡切片。a)新鲜组织和活检组织：采样大小取决于组织类型。一般而言，无论是哪种组织类型，在没有大量脂肪细胞侵润的情况下，10 mg组织标本可提取DNA或RNA 10 g。无菌条件下取米粒大小手术

26、或活检组织（约25 mg）；肿瘤组织要求未坏死肿瘤组织比例70。穿刺取实体肿瘤组织时，取得的细胞数与穿刺针的粗细有关，21G细针每次获得 100个细胞，19G细针每次获得 150个细胞，支气管活检每次获得 300个细胞，CT介导的细针穿刺每次可获得 500个细胞。通常检测时标本中肿瘤细胞的数量需达到200400个。在某些情况下，要求同时采集无病变的组织或外周血作为对照（如微卫星不稳定性检测）。组织块取样后的处理与保存见个体化医学检测质量保证指南。b)石蜡包埋组织：推荐用10中性缓冲甲醛溶液固定组织标本，避免使用含重金属离子的固定液如Bouin液等。甲醛介导的DNA损伤在固定3小时后明显发生，且

27、时间越长，DNA损伤越严重。因此推荐较小的组织（如活检组织标本）固定612小时，较大的组织（如手术切除标本）固定648小时。甲醛固定的石蜡包埋组织不适于用作RNA检测，但在没有其他标本可供选择时，可考虑选择没有污染部分提取的RNA用于检测，待测RNA序列的长度最好50）、坏死组织比例10，并在对应的白片上画出癌巢，对肿瘤细胞密集区域进行标注。DNA测序法要求肿瘤细胞至少占组织细胞的50。应采取措施避免核酸交叉污染，制备不同患者病理切片标本时，需更换新刀片。3）口腔脱落细胞口腔脱落细胞可同时用于DNA和RNA分析。常用的是口腔拭子，患者清水漱口后，将消毒医用棉签伸进口腔，在口腔内侧脸颊粘膜处左右

28、反复擦拭20次左右，取出棉签，将棉签置于干净滤纸上阴干，每位受检者至少采集棉签3根。棉签立即放入干净封口塑料袋内封闭并放入纸质信封，信封上应做好详细标记。滤纸应经过灭菌处理，以防细菌生长抑制核酸酶的活性。漱口标本也可作为口腔脱落细胞的来源。用于RNA分析的口腔脱落细胞必须保存在RNA稳定剂中。4.3标本的运输与保存分子检测人员应熟知标本运送与保存的条件要求。标本一经采集，应尽快送到临检实验室。临检实验室应制定样本运输与保存的SOP。在运送工具的选择、标本的运送和保存环境等方面应严格按规定执行。运送过程中应防止盛放标本的容器破碎和标本丢失，注意标本的隔离、封装、容器的密闭。标本应标明采集的日期和

29、时间、运送时间、实验室接收时间、实验室接收时标本的温度。运送条件根据标本类型和待测靶核酸的性质而定。DNA分析应在采集后8小时内送达实验室，否则需低温运送。当待测核酸为RNA时，能在10分钟内送达实验室的标本可室温运送；如果运送时间较长，则应将标本置于干冰中，4小时内送达实验室；如果标本中添加了RNA稳定剂，则可室温运送或邮寄。标本的长距离运送应符合生物安全要求。标本运输人员应接受适用于标本类型和远程运输的安全和包装程序的培训。1）样本运输中需注意的常规事项a)放置血液标本的采血管应用石蜡膜或透明胶带封住管盖，以防标本运送过程中采血管管盖脱离；标本运输过程中选用轻质且不易破碎的包装物，并在包装

30、间隙用细碎轻质材料填充。b)标本运输和储存过程中要避免将标本暴露于可能导致核酸降解的环境中。c)选择可靠的快递公司，样本寄出后应尽快告知检测实验室快递单号及相关信息，以便对样本运输情况进行查询和跟踪。样本要求在尽量短的时间内送达临检实验室。d)组织或血液标本的采集过程中可能引起部分基因的表达上调，定量分析基因表达时需考虑到。2）常见标本运输和保存注意事项见个体化医学检测质量保证指南。4.4 标本的接收与保存1）标本的验收、接受与拒收：临床分子诊断实验室应建立严格的标本验收制度和不合格标本拒收制度，并安排专人接收标本。标本验收的内容包括：检查申请单的项目填写是否符合要求、标识是否清楚；申请单有无

31、医师签字；申请单所填项目是否与标本所示一致；申请单姓名、科别、门诊或住院号与标本的标签是否一致；是否签署了知情同意书；核实标本采集及送检之间的时间间隔（要求采样1周以内）；检查标本的量和外观质量，血液标本的外观质量包括采血管是否密闭、有无溶血、管壁有无破损、标本是否有明显的污染迹象（如开盖），样本接收时的大致温度，样本量是否符合要求。手术切除组织标本需做切片和HE染色，由有经验的病理医师评价肿瘤细胞的数量是否满足检测需要。若送检的为DNA样本时，要求体积大于20 L，OD 260/280为1.61.8之间，浓度大于50 ng/L，琼脂糖电泳后电泳条带大于50 kb。拒收无标签、标签不清晰、采血管破裂、已开盖、运送时间超过1周的样本。拒收标本时应及时与送检单位联系，要求重新采样或重新送样。每个接受的合格标本均应分配一个唯一的标识码。样本签收时实行送样人和收样人双签名制度。标本接收后，如不能立即检测，必须按要求进行适当的保存。2）样本的登记与录入：样本签收后立即登记样本基本信息，收样日期和时间，并尽快将标本信息录入实验室（或医院）信息系统，后续的操作过程及样本保存