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1、蛋白质与酶工程复习资料 第一章1、蛋白质工程的产生： 1，最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982-1985年间对酪氨酰-t-RNA合成酶的分子改造工作。2，佩里（Perry）1984年通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成 Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。 3，1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而导致了活性中心His（64）质子pKa从7下降到6，使酶在pH6时的活力提高10倍 。二，蛋白质工程的内容 1、定义：广义上来说，蛋白质工程是通过物理、

2、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。2、内容：确定蛋白质的化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质三，蛋白质工程的程序 蛋白质分子设计 基因改造方案 基因成或突变 分离纯化 蛋白质结构 蛋白质分子 基因克隆与表达目的基因 和功能测定 改造的蛋白质分子四，酶工程的应用范围 （1）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产； （2）自然酶的分离纯化及鉴定技术； （3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）； （4）酶反应器的研制和应用； （5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。 其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技

3、术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。五，医用药物酶应用的问题： 1）异体蛋白引起免疫反应； 2）酶不纯，引起各种副作3）酶在体内降解，时间短； 4）药物无法定向分布。 解决办法： 1) 制成微胶囊； 2) 制成衍生物；3) 制成脂质体包埋与免疫系统隔开(酶蛋白)；4) 酶上引入一定基团，起导向作用。五，分子酶学与酶工程1、酶由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质（或其它类型的生物大分子），是生物体进行代谢、维持生命活动的必需物质，没有酶就没有生命，因此研究酶的结构与功能、性质与作用机理，对于阐明生命现象的本质具有重要意义。2、分子酶学在分子水平上探讨酶与生命活动的关系，研究酶与代谢调节、酶

4、与疾病、酶与生长发育等酶学问题。 第二章一，构型与构象是描述分子的两种不同空间异构现象 1，构型是一个分子中原子的特定空间排布，当一种构型改变为另一种构型时必须有共价键的断裂和重新形成。L型和D型。 2，构象 组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布。构象转变不要求有共价键的断裂和重新形成。二，多肽链层的特点和分类 分类：1链；2平行层和反平行层；3混合型层和扭转层。 层结构特点是：是肽链相当伸展的结构，肽链平面之间折叠成锯齿状，相邻肽键平面间呈110角。氨基酸残基的R侧链伸出在锯齿的上方或下方。依靠两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的CO与H原子形成氢键，使构象稳定。两段肽链可以是平

5、行的，也可以是反平行的。即前者两条链从“N端”到“C端”是同方向的，后者是反方向的。片层结构的形式十分多样，正、反平行能相互交替。平行的片层结构中，两个残基的间距为0.65nm；反平行的片层结构，则间距为0.7nm。三，蛋白质的二级结构 概念：在一段连续的肽单位中具有同一相对取向，可以用相同的构象角(，)来表征，构成一种特征的多肽链线性组合，称为蛋白质的二级结构。二级结构是多肽主链局部区域的规则结构，它不涉及侧链的构象和与多肽链其他部分的关系。二级结构主要包括：螺旋、平行层、反平行层，转折、310螺旋。 二级结构的规则构象主要被其内部形成的主链氢键所稳定，因此氢键的排布方式也是二级结构的重要特

6、征。四，结构模体 概念： 在蛋白质中常常发现，一级顺序上相邻的二级结构在三维折叠中也靠近，彼此按特定的几何排布形成简单地组合，可以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合单位称为结构模体。 特征：结构模体是一类超二级结构(supersecondary structure)它们是三级结构的建筑模块。有的模体与特定的功能相关，如与DNA结合；许多模体并没有专一的生物功能，只是大结构和组装体的一个组成部分。五，结构域 概念： 二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中 形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域(domain)。 特征：结构域是蛋白质三级结构的基本单位

7、，它可由一条多肽链(在单域蛋白质中)或多肽链的一部分(在多域蛋白质中)独立折叠形成稳定的三级结构。一个分子中的结构域区之间以共价键相连接，这是与蛋白质亚基结构(非共价缔合)的基本区别。一般说来，较大的蛋白质都有多个域区存在，它们可以非常不同的方式组合，从而以有限类型的域区结构组合成极为复杂多样的蛋白质整体结构。正是在结构域的基础上，才有可能对蛋白质进行结构分类。同时，结构域也是功能单位，不同的结构域常常与蛋白质的不同功能相关联。六，蛋白质按结构域分类 (1) 型结构(structure) (2) 型结构( structure) (3) /型结构 (4) +型结构 (5) 无规型富含二硫键和金属

8、离子型(1)型结构 这类蛋白质主要由螺旋组成，其螺旋含量一般在60以上，有的高达80。螺旋在这类蛋白质中大多以反平行方式排布和堆积，所以又称反平行结构。 按照螺旋排布的不同拓扑学特征，又可分为一些亚组。肌红蛋白、血红蛋白、烟草花叶外壳蛋白、细胞色素b，等均属此类结构。 分 类：线绕式螺旋；四螺旋束；珠状折叠；复杂螺旋组合。(2)型结构 此类结构主要由反平行层构成。型结构在大小和组织上都有很大的变异范围，但在大多数情况下反平行层都缠绕成一柱状或圆桶状，其缠绕方式可以是链间的顺序连接，也可以是链间的跨接。 丝氨酸属水解酶、免疫球蛋白A、一些球状RNA病毒的外壳蛋白等均属此类。 分 类：根据其形貌和

9、组织特征可概分为：上一下桶式和开放式折叠 ；希腊钥匙(回纹)式折叠；螺旋折叠。(3) /型结构 这是已知数量最多的一类结构，它由平行的或混合型的层被螺旋包绕构成，主要是-模体的组合。在这类结构中层和螺旋内部各股链主要以平行方式排布，所以也称为平行/型。当然，其中螺旋与相邻链彼此是反平行的。多数情况下，一个59条链组成的平行层在中央，两侧是螺旋，形成三层式结构。 依据链组织方式的不同，它们呈现出许多不同类型。丙糖磷酸异构酶、醛缩酶、乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、磷酸甘油酸激酶等均属此类结构。 3种基本类型：TIM桶式折叠；扭转开放式折叠；马蹄式折叠。(4)+型结构 这类结构中既含螺旋又含层结构，但螺旋与

10、层在空间上彼此不混杂，分别处于分子的不同部位，有时螺旋和层分别形成两个结构域。 已知这类结构的数量不多，因此有时将它们按螺旋或层部分的组织特征分别划入以上三种类型中。溶菌酶、嗜热菌蛋白酶、核酸酶等属此类结构。(5)无规型富含二硫键和金属离子型 这是一类小蛋白质分子，它们没有典型的二级结构，或者所含二级结构的组成和组织没有明显的规律可循。 这类蛋白质分子虽然不大(一般小于100个氨基酸残基)，但含有较多的二硫键或金属离子以稳定其三维结构，所以在有的分类中称它们为富含二硫键和金属离子型蛋白 第三章一，蛋白质设计的目的 1，为蛋白质工程提供指导性信息。2，探索蛋白质的折叠机制。二，蛋白质分子设计是一

11、门新兴的研究领域，其本身在不断地发展，其内容也在不断地更新。蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案。三，蛋白质设计原理 内核假设。所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。在大多数情况，内核由氢键连接的二级结构单元组成。 所有蛋白质内部都是密堆积(很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体)，并且没有重叠。（2个因素） 所有内部的氢键都是最大满足的(主链及侧链)。四，蛋白质的定位突变种类 1，插入一个或多个氨基酸残基； 2，删除一个或多个氨基酸残基； 3，替换或取代一个或多个氨基酸残基。 4，最大量的定位突变是在体外利用重组DNA技术或PCR方法。五，蛋白质设计的目标及解决办

12、法六，蛋白质分子设计又可按照改造部位的多寡分为三类： 第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现； 第二类为“中改”，对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装； 第三类为“大改”，即完全从头设计全新的蛋白质（de novo protein design）。 第四章一，大肠杆菌中表达体系的优点 大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。利用大肠杆菌作为表达体系的优点：1）遗传学和生理学背景清楚；2）容易培养，特别是高密度发酵；3）外源基因经常可以达到高效表达。大肠杆菌表达体系的缺点（大肠杆菌系统最大的不足之处是）（1）不能进行典型真核细胞所

13、具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；（2）广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制。（3）外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；（4）而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N末端。 最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，（5）有时不能得到足够的产物。二，哺乳动物细胞表达体系的优点 1，哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。 2，哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的

14、翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。 实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。三，泌型哺乳动物细胞表达系统 1，哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。 2，这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用使起始新生肽链插入到内织网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。 3，从内织网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过

15、程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。 4，分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。 第五章一，微生物的生长的规律 将少量的某细菌接种的恒定容积的液体培养基中，并置于适宜的环境中，定期取样，测定微生物群体生长的规律。 微生物的生长曲线分为迟缓期、对数期、稳定期和死亡期四个主 1.迟缓期：（1）主要特征：代谢活跃，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP等；体积增大；分裂迟缓。（2）原因：在新的环境，缺乏分解或催化相关底物的酶。 （3）缩短和消除迟缓期的方法有：增加接种量、采用最适种龄、选用繁殖速度快的菌种以及尽量保持接种前后所处的培养基介质和条件一致。 2.对数期：（1）特点：分裂速度最快、代

16、时最短、代谢活动旺盛、对环境变化敏感。 （2）作用：作为代谢、生理等研究的好材料和发酵生产中用作种子的最佳龄。3.稳定期：（1）特点：新生的细胞和死亡的细胞数目相等、总菌数达到最大值、代谢活力钝化。 （2）原因：营养物质的逐渐消耗以及代谢废物的积累抑制了生长。 （3）功能：产生次生代谢产物（抗生素、生物碱、色素等）、芽孢；对稳定期的研究发展了连续培养技术。 4.死亡期 特点：活的细胞数目以对数速率急剧下降、细胞裂解或自溶。 第六章一，固定化酶是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。 优点：1，多次使用,2，可以装塔连续反应,3，纯化简单；4，提高产物质

17、量 5，应用范围广。 缺点：1，首次投入成本高；2，大分子底物较困难。二，评价固定化酶的指标 1 酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。计量单位 2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位。品质的体现三， 固定化酶的活力测定方法介绍 1. 振荡测定法：称取一定量的固定化酶 加入一定量的底物溶液， 边振荡或搅拌，一边进行催化反应 取出一定量的反应液进行酶活力测定。 2. 酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中 让底物溶液以一定的流速流过酶柱 收集流出的反应液 测定其中产物的生成量或底物的消

18、耗量。 3. 连续测定法： 利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。四，固定化酶制备的一般方法及特点关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。 四大类方法：1， 吸附法（包括电吸附法）；2， 结合法（无机多孔材料）；3，交联法（双功能试剂）； 4，包埋法（微胶囊法） 各类固定化方法的特点比较: 结合法分类:1 离子键结合法；2 共价键结合法 第七章一，酶分子化学修饰的基本原理： 1 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性。修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 2 如何保护酶活性部位与抗抑

19、制剂。 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。 3 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶。（1）大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解 酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。（2）酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性 4 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境。（1） 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合 （2）大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳

20、定。 酶化学修饰的定义：凡通过化学基团的引入或除去，而使酶蛋白共价结构发生改变，称为酶的化学修饰。二，酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种： 1 ，引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 2， 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。 3 ，有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。 后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。三，小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰） 定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。 侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 侧链基团修饰剂：采

21、用的各种小分子化合物。 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。 第八章一，抗体（antibody）：机体接受抗原刺激后，B细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞产生的一类能与相应抗体发生特异性结合的球蛋白。 抗原（antigen）：指那些能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质 半抗原（hapten）：某些不具有免疫原性的小分子物质可以与抗体结合，如果将其结合到具有免疫原性的大分子蛋白上就可诱导针对小分子物质的抗体应答。二，抗体酶制备的基本原理 按照现代酶学理论，酶首先要和底物结合，使底物向过渡态转化，然后

22、再在催化基团的作用下促进底物进行反应。免疫反应和酶反应十分相似，抗体也能专一地、高亲和力地与抗原物质结合，然后再促使抗原发生各种变化。如果能适当地改变抗体中与抗原结合部位的微环境，并在适当部位引入相应的催化基团，那就有可能使抗体转变为具有催化性能的抗体酶。三，抗体酶的制备方法1，诱导法；2，基因工程法；3，拷贝法；4，导入法；5修饰法。1，诱导法（采用过渡态的底物类似物诱导）：作为酶的抑制剂的过渡态类似物是稳定的，因此利用抗体能与抗原特异结合的原理，可用过渡态的类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便能特异的识别反应过程中真正的过渡态分子。 此法的关键是要设计和获得适当的过渡态底物类似物作

23、为半抗原。 2 ，基因工程法： 对于已经获得的单抗，分析其氨基酸序列和相应基因的碱基序列，将抗原结合部位的基因换上编码有催化作用的氨基酸的基因，这就是基因工程法制备抗体酶的主要内容。 基因工程的技术使得建立抗体基本的组合文库，并根据需要构建适当序列的基因片断已成为可能。利用抗体库技术，在将来也许有可能绕开免疫，产生完全由基因工程构建的全新抗体酶。3.拷贝法： 用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。 4.导入法 ：在现有的抗体基础上，借助化学修饰或蛋白质工程的办法将催化基团引入到已有底物结合能力的抗

24、体的抗原结合部位上。 可以采用选择性化学修饰的方法将人工合成的或天然存在的催化基团引入到抗原结合部位；也可采用寡核苷酸定点诱变技术将特定的氨基酸残基引入抗原结合部位，使其获得催化功能。四，研究极端环境中微生物的意义 1，研究其强而稳定的特殊结构、机能和遗传基因以及应答因子，对阐明物种起源、生物进化具有重要意义。 2，研究其生理生化特性，可用于量度地球上生命生存的理化极限，对探索宇宙星球上的生物有参考价值； 3，可探索出新的生理途径，生产新酶和新的生物制剂，使用于特殊环境条件，如煤脱硫、冶炼金属、处理有毒废水、高压深油井探矿、纤维素高温发酵酒精等。 第九章一，生物反应器，bioreactor是b

25、io与reactor的组合词，是指有效利用生物反应机能的系统（或场所）。二，什么是酶反应器 一定的反应容器是酶和固定化酶在体外进行催化反应 时必需的，以便控制酶催化反应条件和催化反应速度。用于酶催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化 反应提供合适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催 化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。不表现自我催化作用、评价-产率和专一性三，理想的酶反应器的要求 (1) 所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度 （或细胞浓度），才能得到较大的产品转化率。 (2) 能用电

26、脑自动检测和调控，从而获得最佳的反应条件。 (3) 应具有良好的传质和混合性能。传质是指底物和产物在反应介质中的传递。传质阻力是反应器速度限制的主要因素。 (4) 应具有最佳的无菌条件，否则，杂菌污染使反应器的生产能力下降。四，常见的酶反应器类型 1， 按结构区分搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor, STR）鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR )填充床式反应器(packed column reactor, PCR )流化床式反应器( Fluidized Bed Reactor, FBR)膜反应器(Membrane Reactor, MR)

27、喷射式反应器(Jet Reactor,JR) 2，按操作方式区分 根据所使用的酶区分 间歇式反应(batch ) 溶液酶反应器 连续式反应(continuous ) 固定化酶反应器流加分批式反应(feeding batch ) 3，混合形式连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor, BSTR）填充床反应器 又称固定床反应器。 将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后，一定的流速通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液（含产物）。

28、 优点：1，单位体积的催化剂负荷量高、高效率、易操作、结构简 单、容易放大、剪切力小等。,2，PBR是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。 3，它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。 缺点：,1，传质系数和传热系数相对较低，当底物溶液含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR；2，温度和pH值难控制；更换部分催化剂麻烦； 3，柱内压降大，底物必须加压后才能进入； 4，底物和产物的轴向分布会导致酶的失活程度也呈轴向分布。流化床反应器 特点：底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。FBR可用

29、于处理黏度较大和含有固体颗粒的底溶液，同时亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。但因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。固定化酶结构易破坏。动力成本高。 优点：传热和传质性能良好，可用于处理粘度较大和含有固体颗粒的底物,同时适合于需要供给气体或排放气体的反应（即固液气三相反应）缺点： 很难进行大规模的操作，仅适合小规模高价值产品的生产膜反应器 膜反应器（membrane reactor, MR）是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。 用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。五，各种酶反应器的特点 一，蛋白质工程研究什么1. 蛋白质结构分析基础2. 结构、功能的设计和预测基础的应用与验证3. 创造和/或改造蛋白质新蛋白质终目标二，分子酶学是做什么 酶学是研究酶的性质、酶的作用规律、酶的结构和作用原理、酶的生物学功能及酶的应用的科学。三，酶工程的第三次飞跃是什么 20世纪90年代，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，因此“基因工程+发酵工程+先进的发酵设备”可以算是酶工业的第三次飞跃。