端粒的研究发展定稿Word格式文档下载.docx

1、端粒是位于染色体3末端的一段富含G的DNA重复序列，端粒和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物，广泛存在于真核生物细胞中，对染色体的稳定起重要作用.端粒长度缩短或丢失可导致细胞的死亡或恶变.端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白逆转录酶,它的活性可以自身RNA为模板合成端粒DNA,加到染色体的末端,以维持端粒的长度,使细胞绕过衰老途径成为永生化细胞，使细胞永生导致人类肿瘤的发生。.端粒和端粒酶对于细胞的生存和肿瘤的发生具有非常重要的意义,它们之间的关系已成为近年来研究的热点以端粒酶为靶点，可以有多种治疗肿瘤的途径。关键词 端粒；端粒酶；细胞衰老；肿瘤；治疗 Telomeres Research Developm

2、entLiu A-juan（Huaibei normal university college of life science）（Guiding teacher:Xu Ping-li）Abstract In the 20 century 30 40 s, McClintock and Muller corn and fruit flies in the genome of the study, found that eukaryotic cells at the end of the chromosome to maintain stability and integrity of the c

3、hromosome is very important, thus puts forward the concept of telomere; In 1978, for the first time in four Blackbum membrane insect DNA molecule at the end of the study, illustrates the telomeres; In 1985, four membrane in Greider worm nuclei were first discovered telomerase; In 1989, the people of

4、 Hela Morin cells detect the telomerase activity; In the later study, people found that telomere, telomerase structure, function and regulation of cancerous cells have important relationship. Telomere is located in chromosome 3 at the end of a period of rich in G DNA repeat sequence, telomere and te

5、lomere binding protein ribonucleoprotein complex of complex, exist widely in eukaryotic cells, to the stability of the chromosome plays an important role. Telomere length or loss can cause cell death or evil change. Telomerase is a special kind of reverse transcriptase ribonucleoprotein complex DNA,

6、 it the activity could be their own RNA for template synthesis telomere DNA, added to the end of the chromosome, in order to maintain telomere length, make cells around the aging one way to be ever biochemical cells, making the cell eternal life causes the human tumors. . Telomere length and telomer

7、ase for the survival of cancer cells and has a very important significance, and the relations between them has become a hot spot of research in recent years in telomerase for targets, can have a variety of cancer therapy approach.Key words telomere; Telomerase; Cell aging; tumor；treatment 目录引言 1l端粒和

8、端粒酶 11.1端粒的基本概况 11.2端粒酶的基本概况 22 端粒和细胞衰老 22.1 细胞衰老的端粒假说 22.2端粒长度与细胞衰老 22.3端粒长度随细胞分裂缩短的原因 32.4 端粒酶和细胞衰老 32.5细胞的永生化 32.6 端粒酶活性与细胞衰老、永生化的关系 43 端粒、端粒酶与肿瘤的发生和发展 43.1 端粒酶的激活与癌基因及相关因素 53 .2 端粒酶与肿瘤临床应用的研究 64端粒酶抑制剂的现状及进展研究 7 4.1端粒及其在DNA复制过程中的作用 7 4.2端粒酶及其与肿瘤发生的关系 8 4.3端粒DNA长度的测量方法 8 4.4端粒酶的检测方法 95端粒酶抑制剂 9 5.1

9、核苷酸类逆转录酶抑制剂 9 5.2非核苷类小分子抑制剂 10 5.3寡核苷酸类端粒酶抑制剂 11 5.4 G-四联体抑制剂 116 G-四方体及G-四联体 12问题与展望 13参考文献 14致谢词 15引言 提到端粒（即染色体末端），相信只要有一点生物常识的人一定都不会感到太陌生，大家甚至可以用自己的话把端粒的定义描述出来，然而，到目前为止我们人类对端粒的研究到底有多少呢，对端粒的研究到底对我们有什么切实的意义或者用处呢，说到这可能大家就没办法说确切的阐述出来了，而端粒的发现已有很长的历史，对其结构、功能、合成及其重要意义的认识，近年来有了很大进展，本文就端粒、端粒酶的研究进展以及他们与肿瘤的

10、关系综述如下。l端粒和端粒酶1.1端粒的基本概况端粒是真核生物染色体末端的特殊结构，由一段串联重复的非编码序列及相关的特异结合蛋白组成。20世纪30年代，遗传学家McClintock和Muller首先提出了端粒的概念。1978年，Blackburn在四膜虫中发现了一种短而简单的核苷酸重复序列，从而揭示了端粒的初步结构。Blackburn等在1983年报道，四膜虫端粒是由5，-GGGGTT一3的连续重复序列构成，并且每条染色体的端粒重复单位的重复次数不同。人类细胞端粒DNA由5，TTAGGG一3重复序列反复串联而成（Moyzis等，1988），总长度约为515 kb，其长度主要受端粒酶、端粒结合

11、蛋白和核糖基转移酶一核糖多聚酶等共同调控（Callen等，2004）。端粒DNA不具有编码蛋白质的功能，重复序列的数目也不确定，在遗传上高度保守。端粒结合蛋白（TBPs）是与端粒DNA上的特异序列相结合的蛋白质，它是端粒结构形成和功能维持的重要基础。人类细胞主要端粒结合蛋白有TRFl、TRF2、Tankyrase和TIN2 4种。其中，TRFl和TRF2都专一性的与端粒DNA重复序列相结合，TRFl对端粒长度起着负调控作用，可以在一定程度上抑制端粒酶的活性（McEchem等，1995）。TRF2则可以防止染色体末端相互融合（Steense等，1998），对维持端粒的正常结构必不可少。Tanky

12、rase和TIN2是TRFl的2种调节蛋白，Tankyrase能够脱去DNA上的TRFl，使端粒酶作用于端粒DNA，从而延伸端粒长度（Smith等，1998）。TIN2是一种与TRFl结合的核蛋白，两者共存于细胞中期的染色体上，对端粒长度具有负调控作用（Kim等，1999）。至于两者对端粒的具体作用过程，目前尚不清楚。端粒的主要功能是维护染色体的稳定，防止染色体之间粘着、融合及重组，保护染色体末端不被降解；同时也参与染色体的定位和复制，保证细胞的正常分化与繁殖。在大部分人的体细胞中，端粒DNA会随着细胞有丝分裂的进行而缩短，当缩短到一定程度后，编码区基因被破坏就丧失了对染色体末端的保护能力。在

13、永生化细胞及癌细胞中，端粒长度是相对稳定的。1.2端粒酶的基本概况Greider等（1985）在四膜虫提取物中发现了端粒酶（telomerase），这是一种自身携带模板，由RNA和蛋白质两部分组成的反转录酶。目前认为端粒酶是由端粒酶RNA（TR）、端粒酶相关蛋白（TPl）和端粒酶催化亚基（TERT）三部分组成的蛋白质复合物（Lingner等，1997）。端粒酶是一种特殊的核糖核酸蛋白质聚合物，是依赖于RNA的DNA聚合酶，端粒酶的主要功能是维持和平衡端粒序列长度，它能够利用3端的单链做引物，以自身的RNA为模板，将催化亚单位和辅助蛋白合成端粒重复序列添加到染色体末端，从而延长端粒的长度（Tsu

14、jimoto，1999）。另外，端粒酶也是细胞周期重要的调控因素之一。影响着细胞周期进程它能够识别断裂的染色体末端，重新将端粒的重复序列加到染色体的断裂末端或非端粒DNA上，修复受损的DNA末端，从而避免外切酶对染色体DNA的过度切割，维护基因组遗传的稳定性。2 端粒和细胞衰老2.1 细胞衰老的端粒假说 早在20世纪70年代，O|ovnikov等（1973）就将“末端复制问题”与细胞分裂终止联系到一起，认为端粒的丢失可能因为某种与端粒相关的基因发生致死性缺失，从而将端粒丢失与生命衰老联系起来。Cooke等（1986）发现了人类染色体长臂末端端粒，并根据体细胞的长度明显短于干细胞这一现象，认为端

15、粒长度的缩短会影响和限制细胞的分裂增殖能力，首先提出了衰老的端粒假说。Harley等（1990）再次提出并完善了细胞衰老的端粒假说，从而引起了科学界的重视。他认为，人正常体细胞在经过有限次有丝分裂后，其端粒会缩短到一定程度，当缩短到其不能继续维持细胞分裂时，便会启动终止细胞分裂的信号，使细胞进行的有丝分裂被不可逆的阻止在细胞周期GI期和GM期之间的MI死亡期，并在p53或p53和RB活性蛋白介导下退出细胞周期而老化死亡。如果细胞被病毒转染或某些抑癌基因发生突变，细胞可越过MI期继续分裂，端粒进一步缩短，很快进入M死亡期，在此期间绝大多数细胞死亡，极少数细胞可能由于抑制端粒酶的某个基因发生突变，

16、激活了端粒酶的活性，从而端粒长度得以稳定，细胞越过M期获得永生化（甄蕾 刘宏伟 2007）。2.2端粒长度与细胞衰老端粒长度和细胞衰老关系最有力的试验证据来自人类成纤维细胞。Allsopp等（1992）分析不同年龄（从胎儿到93岁）受试者成纤维细胞的原代培养细胞，发现在培养过程中细胞所能分裂的次数与细胞的供体年龄无关，而与开始培养时细胞染色体末端端粒的长度显著相关。研究结果表明，年轻人成纤维细胞的端粒平均长度为18-一25kb，而老年人的平均长度则为810kb，越来越多的证据证明端粒的缩短与细胞分裂、年龄增长密切相关，端粒长度的缩短成为细胞衰老和年龄增长的“分子钟”。另外，女性与男性相比拥有更

17、长的端粒，也许这便是解释为什么女性的平均寿命长于男性的一个重要证据（Boan等，2001）。2.3端粒长度随细胞分裂缩短的原因 在真核生物DNA复制过程中，DNA的合成是沿着5-3方向进行的。因为5-3DNA多聚酶只能从已有的DNA或RNA片段上延长，这就需要一个RNA小片段为DNA多聚酶行使引物功能，这一引物在新的DNA链形成后被删除。在正常细胞分裂过程中，位于染色体5端的RNA引物所占据的序列不能被DNA多聚酶替换，因此，DNA每经过一次复制，新链就要缩短数百个碱基。位于线性染色体末端的特异化端粒DNA序列，能防止染色体末端功能基因的丢失，维护染色体的稳定。但在此过程中，端粒自身的长度会发

18、生一定的丢失而造成缩短（Tian等，2000）。2.4 端粒酶和细胞衰老在正常的体细胞中，端粒酶处于失活状态，因此，导致端粒重复序列随着细胞分裂次数的增加而逐渐缩短，端粒有了“细胞分裂时钟”之称（Harley等，1994）。端粒酶的表达主要受控于其催化亚基TERT。Bodnar等（1998）在正常人的视网膜色素上皮细胞和包皮成纤维细胞中导入端粒酶的催化亚基hTERT载体后，发现其端粒酶活性呈阳性，同时所能发生的有丝分裂次数大大增加，寿命也随之延长。大量试验结果表明，正是由于端粒酶的作用，才出现一部分肿瘤细胞、胚胎细胞和生殖细胞等永生化细胞的端粒长度不随自身分裂次数的增加而缩短。相反，如果在永生

19、化的细胞中抑制其端粒酶活性，则会导致端粒的持续缩短直至细胞死亡（Herbert等，1999）。2.5细胞的永生化永生化（immortalization）指体外培养细胞自发或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离。从而具有无限增殖能力的过程。自发永生化的几率非常小，而人类细胞则更为罕见。目前研究发现细胞永生化与端粒和端粒酶有密切联系。端粒除保持染色体完整性外。还作为细胞生存期限的关键性调控因子存在，端粒功能障碍会导致细胞增殖衰竭或凋亡。端粒酶可维持端粒的结构和长度稳定，还可提高细胞对应激原和毒性因子的耐受力，在细胞永生化过程中发挥重要作用。近来对端粒和端粒酶的调控网络，尤其是干细胞中端粒酶作用的研

20、究，使我们对二者与细胞永生化的关系有了进一步的认识。2.6端粒酶活性与细胞衰老、永生化的关系体外培养条件下。绝大多数人类细胞只能有限增殖。由于端粒维持机制的缺乏，随细胞不断分裂，端粒逐渐缩短；当端粒缩短至一定程度时，细胞进入增殖衰竭期。体细胞的增殖衰竭通常是不可逆的。其次增殖衰竭细胞具有特异的形态和分子生物学表现，如细胞平展、贴附能力增强、对血清刺激的cfos诱导丢失、纤溶酶原激活物抑制因子和B半乳糖苷酶（一种衰老标志物）的表达增高等。目前端粒诱导细胞增殖衰竭主要用DNA损伤监控点反应来解释。功能障碍的端粒不能有效保护染色体末端。引发类似DNA双链断裂的反应其中包括DNA损伤监控点激酶CHKl

21、和CHK2的激活及一系列相关蛋白的表达：而DNA损伤监控点激酶的灭活可使增殖衰竭细胞重新进入S期嘲。近来研究认为，正常人类体在S期有短暂的人端粒酶逆转录酶低表达，这对维持端粒结构和细胞增殖有重要意义。阻断其表达会导致端粒37悬突迅速缩短、DNA损伤修复能力下降、细胞增殖减慢和提前进入增殖衰竭期，但并不影响端粒缩短的总速率，这也提示端粒结构的破坏同样能引发增殖衰竭。增殖衰竭过程中需要p53和Rb肿瘤抑制通路的参与。而病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等则可以使细胞绕过增殖衰竭期继续生长。细胞经过2030群体倍增次数（population doublings，PDs）后，进入危机期（crisis），细

22、胞出现退化，如双着丝粒形成、染色体变短而失稳分裂细胞逐渐减少，绝大多数细胞发生凋亡。只有罕见的细胞在一些因素影响下，端粒酶被激活。以它自身RNA为模板不断合成端粒DNA来补充和延长端粒有限长度，恢复染色体的稳定性从而使细胞得以逾越危机期，获得无限分裂和增殖的能力，即永生化。细胞永生化过程包含端粒维持机制的激活和某些生长调控通路的改变因此永生化细胞系不仅有无限的生长增殖潜力还表现出生长增殖速度和抵抗外界有害刺激能力的提高。目前，端粒酶介导永生化的细胞基因组稳定。而且监控点完整保留，是建立细胞系的一种常用手段。可以设想，当端粒酶逆转录酶基因转入细胞内既能延长细胞寿命又不影响细胞的其他正常功能时。延

23、长寿命的细胞就能有效抑制衰老。如皮肤的老化、肌肉的退缩和动脉硬化等。同样，深入探索干细胞增殖、分化、凋亡过程中端粒和端粒酶的变化及其作用将有助于衰老、癌变发生机制的揭示和干预措施的研究。3 端粒、端粒酶与肿瘤的发生和发展“端粒|端粒酶假说”认为端粒酶的再激活与细胞的永生化和恶性肿瘤的发生和发展密切相关。染色体末端的端粒DNA进行性的缩短是限制人细胞寿命的先决条件。相对的，端粒酶的激活，合成端粒的DNA被认为是细胞永生化和癌症发展必需的一步。目前的资料证实，端粒酶对长期成活的组织和长期进行有丝分裂的细胞是必需的。Bonder等首次发现，hTERT异位表达的人体细胞在培养基中能赋予细胞无限制的生长

24、能力，正常情况下人包皮成纤维细胞和视网膜色素上皮细胞（RPEs）在倍增4080代后停止分裂，而包含端粒酶阳性的细胞倍增超过200次仍维持继续生长。端粒酶过表达能使某些波濒死的人体细胞永生化，这种永生化对于肿瘤基因表型的获得是极有利的一步。在此之前，用癌基因转染产生带肿瘤基因的人体细胞是不可能的，但最近用SV|40大抗原、突变的H|ras基因和hTERT基因共转染已能使人成纤维细胞和上皮细胞这两者转变成癌细胞，尽管应用hTERT转染的方式对所有类型的细胞和癌基因并不成功，但这个结果确切地表明:hTERT的表达也许是端粒酶激活的结果，有助于肿瘤的发生。端粒酶hTERT基因不能认为仅有癌基因功能，它

25、也有限制端粒的机制，用于调节人体细胞的寿命，快速修复人的组织和更新干细胞的数目。一个有趣的试验表明，敲出端粒酶的小鼠与自发性肿瘤发生率的增加有关，当敲出端粒酶的小鼠生长到第5代和第6代时，自发性癌症的发生率比野生型的小鼠显著性的增加，高出4到6倍。端粒酶缺乏的小鼠肿瘤发生率增加最可能的机制是染色体的不稳定性增加并导致基因的突变。因此，目前的研究显示：端粒酶既不是肿瘤生长的抑制因子，也不是癌基因，仅仅在肿瘤发生发展中起作用（朱庸 2007）。3.1 端粒酶的激活与癌基因及相关因素已发现的人端粒酶组分包括RNA模板、催化亚单位（TERT）和端粒酶相关蛋白。分析胚胎、成年和各种肿瘤组织中的端粒酶活性

26、及其与各种组分表达之间的关系后发现，端粒酶活性TERT的表达密切相关，hTERT基因的表达似乎是端粒酶活性的限制成分。研究发现myc 激活端粒酶是通过上调端粒酶的催化亚单位TERT的mRNA表达水平来实现的。hTERT驱动细胞的增殖是由于C|myc 癌基因的直接激活。Wu等用凝胶阻滞法发现，在人的TERT基因的启动子区存在两个典型的myc结合位点和一个非典型的myc结合位点，由此启动TERT的表达。（张火俊 2005）人乳头状病毒（HPV）的感染和人子宫颈癌的发生密切相关，已知，HPV的病毒癌基因E6在肿瘤发生中起重要作用，E6也是第一个被发现可以激活端粒酶的癌基因。已发现在人包皮角质化细胞和

27、乳腺上皮细胞中单独表达E6即可激活端粒酶。E6对端粒酶的激活至少部分是通过myc来实现的，E6可以在转录后水平调节myc的表达。但这条途径似乎是细胞类型特异性的，在上皮细胞中E6的表达可以激活myc,随后由myc激活端粒酶。已知雌、孕激素对女性肿瘤有较大的影响，研究发现雌激素受体阳性的MCF|7人乳腺癌细胞用雌二醇处理后端粒酶活性增高，同时，TERT基因的表达水平亦升高。研究还发现当myc结合位点发生突变后，雌二醇对TERT基因的激活作用消失，这一结果提示雌激素不但可直接激活TERT的表达，而且还可通过激活myc的表达间接促进TERT基因的表达，从而激活端粒酶。雌激素对端粒酶的激活解释了月经周

28、期中子宫内膜细胞的端粒酶活性的变化，同时，这一途径很可能是雌激素诱导产生子宫内膜癌变的分子机制。Wang等发现hTERT基因也是孕激素的一个靶，孕激素诱导hTERT的表达，提示在某些靶组织内性甾体激素参与端粒酶分子机制的调节。此外，腺瘤样结肠癌内癌蛋白（APC）通过|链接素/TGF|4直接调节myc基因的转录，p53可以通过其羧基端区域与TEP|1靠近羧基端区域的相互作用抑制端粒酶活性，调节蛋白质磷酸化和磷酸化过程的酶类等也可能参与了端粒酶活性的激活。3 .2 端粒酶与肿瘤临床应用的研究 端粒酶的激活是细胞癌变的早期事件，在肿瘤的发生发展中起重要作用，因此用于早期诊断是可能的。但将端粒酶作为癌

29、症诊断工具的愿望被多种类型的正常细胞和组织中出现的端粒酶所限制。最初认为端粒酶几乎能在所有的肿瘤标本中检出，正常组织除生殖细胞（卵巢和睾丸）外均不能检出。但最近已发现许多具有再生功能的正常组织和细胞均表达端粒酶活性，如正常的淋巴细胞、小肠上皮细胞、食道上皮细胞、子宫内膜上皮、基底角质细胞、宫颈上皮细胞和造血干细胞等。在有些情况下，端粒酶阴性的组织受生长刺激时也可变成端粒酶阳性，如淋巴细胞和尿道上皮细胞。因此端粒酶作为肿瘤诊断的标志物仍处于实验和研究阶段，还不能应用于临床，但作为病理和细胞的辅助手段还是很有帮助的。另一个缺陷是，虽然近几年端粒酶检测方法进一步改进，但需要尽可能新鲜的标本是其一个依

30、然无法解决的缺陷；标本获得的侵入性和标本取材条件及技术要求较高，带有假阳性的发生，且易受炎细胞的影响等均限制了临床的应用。 端粒酶活性与肿瘤的预后关系，端粒酶活性与肿瘤的临床分期、临床治疗疗效及预后的相关性，各报告分歧较大，可能与检测方法及标本取材的异质性有关，但近期多数报道认为无明显的相关性。有关非小细胞肺癌的报告认为，端粒长度（TRF）的改变与生存期缩短有关，端粒酶活性与生存期无关；乳腺癌端粒酶活性与腋淋巴结转移及雌激素、孕激素状态之间没有明显的关系（姚成才 2004）。端粒酶抑制的研究应是一个长期的过程，通常许多成功的药物如阿司匹林到泰素，从发现到认识它的作用和价值，以及应用到临床都经过

31、了漫长的过程。几个端粒酶抑制剂的研究已取得可喜的成绩，包括Phosphorothioate Oligonucletide、2|甲基RNAs、肽核苷，后两者的作用机制是在各型细胞中直接作用于端粒的区域，抑制它的功能，造成端粒进行性的缩短。寡核苷酸类似物（phosphorothioate）主要表现为导致细胞的死亡，此类端粒酶抑制剂的发现，进一步加强了小分子抑制剂的构想。端粒酶研究另一个充满希望的方面是端粒酶疫苗的发现，它的原理是：“刺激机体的免疫系统识别端粒酶阳性细胞并杀死它们”。正常细胞、甚至高分化的细胞，似乎不表达足够的端粒酶或通常的表达方式不表达。相反，肿瘤细胞通常表达端粒酶，或者它的一部分与MHC分子形成的联合体表达端粒酶，可作为攻击的靶。因为重组纯的端粒酶成分可能得到，因此不久的将来端粒酶疫苗有可能进入临床试用。癌症细胞永生化的“端粒假说”|端粒进行的缩短限制端粒酶阴性的正常细胞的寿命，相反，癌症细胞中端粒酶激活有助于