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1、初步了解生物安全实验室在建筑上的结构特征，如实验室布局、送排风系统等。材料与物品：复旦大学三级生物安全防护实验室实习步骤：生物安全实验室为“盒中盒”结构，主要采用物理隔离分区与负压通风过滤技术。因此见习的重点为这两个方面。A 物理隔离分区物理隔离（墙体）和密封门把实验室与公共环境分开，这里重点介绍BSL-3实验室由外到内可以划分为清洁区（更衣、淋浴）、缓冲区I、半污染区（准备间）、缓冲区II、核心区（实验操作区）五个区域，其中缓冲区两扇门互锁，加上负压通风，保证实验室内气流为定向流，方向为：非污染区半污染区核心区。见习要点：控制室内PLC控制系统上实验室平面分区图告知分区设置、进出路线。B 负

2、压通风过滤技术负压通风过滤主要应用于BSL-3/4、ABSL-3/4。在BSL-3实验室通风设计中，要求各区室之间气压保持一定的压力梯度，且走向恒定（此处不是指实验室任何时刻气流都是在房间与房间之间窜动，而是指各区之间门打开时，不出现倒灌现象）。因此要求风机开启时先排后送，关闭时，先送后排。核心区与半污染区的空气一律要经HEPA过滤后排放。因此其安装位置应尽量减少污染范围，即HEPA尽可能靠近污染源。按照GB19489-2004要求，BSL-3实验室应顶部送风，下面排风，且送风口与排风口呈对角分布。另HEPA安装在排风口的最前端。BSL-3实验室空气排出方向：室内前端HEPA末端HEPA（BI

3、BO）环境安全柜内空气：安全柜内安全柜HEPA排放管道末端HEPA外环境机房内告知其新风采集、过滤；排风中BIBO布置，风管走向、排风口设置。注意事项： 1实习过程中禁止乱碰触摸实验室内设施设备 2. 实习过程中实验室内按钮、开关未经允许禁止随意按下附：见习过程中需介绍到的内容：1. 位置：建筑物中自成隔离区（带出入控制）或为独立建筑物2. 平面布局：分区组成、安全门设置位置、传递窗使用、安全柜位置原理入口等3. 维护结构：抗震防火 密封 避污染 门自动关闭、发光指示、防啮齿类节肢动物进入等4. 通风系统：A 独立的送排风系统确保气流走向与压力梯度B 送风与排风对角分布，上送下排，降低气流死角

4、与涡流形成C 送排风为直排式，不得采用回风结构D BSC内气体经HEPA直接排出，确保BSC与排风系统平衡E 送风经初、中、高三级过滤，保证污染区的静态洁净度为7-8级，10W-1w级F 排风口直排，远离送风口，设置在主导风下风向，高出建筑物2m，防雨鼠虫G HEPA安装在送风末端，排风前端H 安装牢固，部件气密，HEPA更换前消毒，更换后焚烧消毒，年检制度I 送排风安装气密阀，必要时进行房间化学熏蒸J 安装风机与安全柜启动连锁装置，确保实验室不出现正压与确保生物安全柜内气流不倒流，排风机一用一备，K 核心区与半污染区不应另外安装分体空调、暖风、电风扇等5. 环境参数：A 室内负压，核心区-5

5、0Pa左右，半污染与实验室之间相对-30Pa，半污染区的相对压力以（-20+-5）Pa为宜，B 实验室温度以人体舒适范围为宜，相对湿度不超过70%C 空气洁净度1-10w级D 照明均匀，不炫目，不反光，工作照度不大于500lxF 噪声不超过65dB6. 其它A 台面防水耐热耐腐蚀B 家具牢固易清洁，边角光滑无毛刺C 最好不要使用真空泵，如需要真空管线接入在线高效过滤器，且不影响室内的负压D 压缩钢瓶放于实验室外E 安全出口应有长效发光指示标识F 电源确保实验室工作期间有不间断的电力供应G 实验室入口处的显著位置安装声光报警压力显示装置H 通讯系统 如电话、传真、计算机等实验室生物安全基础见习实

6、习指导（二）个人防护部分1. 掌握各种个人防护用品的正确使用方法，穿脱步骤。 2. 理解不同危害等级使用不同的个人防护用品 3. 了解个中个人防用品的工作原理准备物品：口罩（N95，普通），手套，防护服（联体，反穿），鞋套，靴套，袖套，帽子，面罩N95口罩个人密合适合性检测系统；正压呼吸系统步骤：1 以进入的实验生物安全等级为基础，考虑个人防护级别及防护要求的重点。2 清查所需个人防护用品是否齐全。3 任何个人防护用品使用前务必检查其质量，确保安全。4 穿戴过程：5 脱防护用品过程：1 同一层次防护，手套腕部需盖过防护服腕部；2 须选择自己适合的尺寸；3 N95口罩需要先进行个人密合适合性试验

7、。4 应急情况下，视具体情况使用正压呼吸系统。1）使用前准备：设备应完好、无损、安装正确，使用前应更换任何损坏或有缺陷部件；根据使用的使用说明对面罩做使用前检查；使用前，检查i.s.电机罩，将腰带安装在电动送风装置上。2）电池提前充电，3）校准，4）检查滤罐，5）检测流量，6）连接装置，7）调整面罩，8）注意事项：注意防止呼吸管卷绕在突出的物体上；使用中若进入面罩的气流停止，或流量降低且有警报，或感觉到有异味，应立即撤出污染区，检查故障原因。9）摘卸：应先撤出污染区域，再将面罩从头上取下后，关闭电源，解开腰带。穿戴防护用品过程 脱去防护用品过程实验室生物安全基础见习实习指导（三）生物安全柜1.

8、 掌握生物安全柜内感染性物质操作的一般准则和技术要点； 2. 熟悉生物安全柜运行的一般规则； 3. 了解生物安全柜故障时的一般处理原则。1. 培养液、TRIZOL2. 细胞培养瓶、病毒收集瓶、15ml离心管3. 废物缸、废液缸、废物盒实验步骤：1. 个人防护装备：口罩，手术帽，手套（内白外兰），防水衣，鞋套2. BSC的准备: 启动程序，清洁，UV消毒3. 物品清单，物品运入及摆放（见附图）4. 实验重点一：样品离心，3000rpm 5。防气溶胶操作方法5. 实验重点二：感染上清收集，防意外接种及气溶胶操作方法。6. 物品退出BSC: 实验样品，干净物品，废物7. BSC清洁: 酒精擦拭8.

9、废弃物处理: 高压灭菌程序9. 结束实验: 防护服脱卸，洗手BSC内物品摆放示意图（for the right-hand）实验步骤及记录时间： 实验人员 ： 实验室：物品准备：1. 将带入的H9细胞，废物缸、废液瓶、废物盒、离心管、Trizol试剂等实验必需品按相对污染与清洁区依次放置。2. 分别将已接种HIV的H9细胞从培养箱内取出，编号 ，置显微镜下观察，记录见下。3. 在安全柜正中靠操作者处铺上吸水垫，喷上75%酒精。4. 吸出已接种HIV的H9细胞悬液，编号 ，移入15ml离心管。5. 将离心管在安全柜内放入离心杯中，喷消毒液，更换手套，带出离心。6. 转/分钟，离心 分钟。7. 将离

10、心杯带入安全柜内，取出离心管。离心杯喷洒消毒剂后取出。8. 分别将上清以每个ependorf管0.5ml分装，标记保种，共 管，标记 。放入密封盒，记录见附表。9. 分别吸取 ml病毒上清至带入的未接种H9细胞培养瓶内，轻摇培养瓶混合，使病毒上清充分接触细胞。细胞培养瓶外表面喷洒消毒剂后，拿出安全柜后放入培养箱。标记 。10. 将剩余上清 ，注意不要将沉淀细胞悬起。11. 吸取 微升Trizol加入细胞沉淀，混匀后吸出，移入1.5ml离心管，标记 ，放入密封盒，外表面喷洒消毒剂后，拿出安全柜。12. 将吸水垫收起放入废物盒，双手喷上消毒剂，脱去外层手套，重戴干净手套。13. 将安全柜内物品喷洒

11、消毒剂后取出，取出顺序为干净的物品先取出，废弃物收集盒最后取出。最后将安全柜台面喷洒消毒剂后，从干净区域到污染区域的顺序擦拭清洁。脱去外层手套带出。14. 换上干净外层手套，关上安全柜窗口，打开紫外，定时15分钟。实验结果：实验意外情况及处理：实验室生物安全基础见习实习指导（四）清场、消毒与废弃物处理1.掌握实验后清场的基本操作程序；2.了解消毒的原理及原则；3.了解污染废弃物处理的基本程序。4. 培养液、TRIZOL5. 细胞培养瓶、病毒收集瓶、15ml离心管6. 废物缸、废液缸、废物盒7. 灭菌整理箱，生物安全废物袋、灭菌指示带、消毒剂（乙醇、新洁尔灭、氯）。1. 良好的实验行为规范是生物

12、安全防护的重要保证，正确的清场程序是良好的实验行为规范的一部分。2. 清场可分为日常实验后清场和实验对象变更后清场。3. 消毒剂的分类、消毒原理，配置方法以及消毒剂的选择。4. 清场消毒的操作规程：（1） 日常实验过程按照不同的实验安全操作规程进行。（2） 实验结束后，由实验人员进行清场，首先更换新的外层手套。（3） 处理实验样品如：取出实验样品放回冰箱，取出细胞培养瓶放回37培养箱中培养。（4） 取出所有未使用的物品如：未拆包装的移液管等。（5） 在使用过的移液器表面上喷洒75%乙醇，然后取出移液器放入抽屉中。（6） 将实验区域的吸水纸巾折叠好放入废物盒中。（7） 将废物盒中废物整理好，拉起

13、废物袋，用胶带将袋口扎好但不可过紧，贴好灭菌指示胶带或放入灭菌指示剂，并在指示胶带上写明消毒日期。将废液瓶放入废物盒中。盖上废物盒的盖子，然后在盒子表面喷洒75%乙醇。（8） 更换一副新的外层手套。（9） 取出废物盒放入灭菌整理箱中。（10） 用75%乙醇清洁安全柜内清洁区域、污染区域及实验区域所有表面，并用纸巾擦干。（11） 更换一副新的外层手套。（12） 关闭生物安全柜，设置UV照射。（13） 退出实验室，带出实验后的废弃物，进行高压灭菌。（14） 60min后关闭通风系统。（15） 每周对地面和墙面消毒清洁一次。5. 所有灭菌消毒处理后的废物作为危险废弃物收集于洗涤室的医疗废弃物回收桶内

14、，废弃物应放置整齐，然后盖好回收桶的桶盖。6. 所有灭菌消毒处理后的废弃物送往指定的单位进行焚烧处理，定点单位定期到实验室收取需要做焚烧处理的废弃物。实验室废弃物处理人员和焚烧单位工作人员共同完成废弃物回收记录。实验室生物安全基础见习实习指导（五）高压蒸汽灭菌器的使用1.掌握灭菌的原理和条件；2.了解高压蒸汽灭菌器的使用。高压蒸汽灭菌器，灭菌整理箱，生物安全废物袋、灭菌指示带/剂、化学指示卡。1. 灭菌的方法和原理。2. 灭菌器的种类、构造和工作原理。3. 双扉高压灭菌器的操作规程：3.1准备工作：（1） 开启中控室总电源。（2） 确认水箱水位及水质。（3） 确认内室及夹套压力。（4） 确认真

15、空泵，压缩泵。（5） 确认清洁侧门。3.2使用程序：（1） 将灭菌室墙上所有电源开关置于向上接通电源，压缩泵启动，。（2） 打开控制系统电源，启动灭菌器。（3） 按住污染侧门（后门）开门按钮，将灭菌物品均匀地放入到灭菌器内室中，同时放入生物灭菌指示剂。按住后门关闭按钮，关闭电动门直到门垫圈充气封紧为止。（4） 点击控制面板触摸屏上的run模块，进入灭菌器控制系统。（5） 面板左上方显示当前所处的行程，右上方显示当前使用的程序，下方显示“程序”“检测”“启动”和“校温”四个可点击的模块。面板中间显示灭菌器当前的条件状态包括：空气源，蒸汽源，水源以及前后门的状态和夹套温度和压力。（6） 点击面板画

16、面中“程序”模块，画面即进入程序选择界面，显示以下六种程序：辅料类，器械类，净化，液体类，下排汽和动物类。点击需要选择的程序模块。设定完毕后点击确定模块即完成程序的设定。（7） 选择程序完毕后，灭菌器进入准备行程，蒸汽发生器产生蒸汽，夹套压力不断上升。可点击“检测”模块，显示输入输出通断状态，点击“返回”模块，则返回目前行程。当面板显示“空气源开关闭合 蒸汽源开关闭合 水源开关闭合 前门关闭 后门关闭”，压力表显示超过0.2MPa，以上条件均满足的时候，可点击触摸屏上“启动”模块，启动灭菌程序。（8） 当灭菌程序所有行程进行完毕以后，面板显示“行程完毕，可开门”，压力表显示压力为0MPa，开门

17、灯亮起，此时可按住前门开门按钮，打开前门，取出灭菌物品，观察生物指示剂变色情况以检测灭菌效果。如果灭菌效果不佳，则需重新进行灭菌程序以达到有效的灭菌目标，方可对废弃物进行下一步处理。（9） 将灭菌内室清理干净，然后按住前门关闭按钮，将前门关闭直至门框封条封紧。点击触摸屏上“复位”模块使灭菌器回复准备行程。（10） 如还需进行灭菌，则按以上相同的步骤从后门送入灭菌物品进行灭菌。如不需使用，关闭控制系统，关闭电源。最后在控制室电源箱中，关闭灭菌器总电源。（11） 完整登记灭菌器使用记录。3.3灭菌效果的监测：（1） 物理监测：温度、压力、时间（2） 化学监测：灭菌指示带、化学指示卡（3） 生物监测：生物指示剂（嗜热芽孢杆菌）（4） B-D 试验（5） 其他