细胞生物学实验报告Word格式文档下载.docx

1、细胞种类一/um二/um三/um平均/um人肝细胞104019.4421.3618.0018.9616.3219.6817.9220.00血红细胞107.207.687.52血白细胞109.129.609.849.52血小板10101.44栅栏组织109.1279.2010.0881.1210.5680.649.9280.32五、作业与思考：1、血细胞按含量上下，主要含有：红细胞，白细胞，血小板。白细胞最大，红细胞次之，血小板最小。红细胞：主要的功能是运送氧。 白细胞：主要扮演了免疫的角色，当病菌侵入人体时，白细胞能穿过毛细血管壁，集中到病菌入侵部位，将病菌包围，吞噬。血小板：止血过程中起着重

2、要作用。细胞形态见下列图。2、植物细胞一般比动物细胞大一些。形态图见下。3、在不同放大倍数下，测定的细胞大小根本一致，但有一些偏差。放大倍数越大，在视野中同等实际距离下的两点视野距离更大，而更容易测量准确。实验二：PASPeriodic Acid Schiff反响显示糖原和其它多糖物质一、实验目的1、熟悉PAS法原理及操作步骤；2、观察PAS反响的染色结果，并观察多糖在组织细胞中的分布。二、实验原理多糖是由多个单糖分子缩合脱水而生成的化合物。一些不溶性的多糖构成植物和动物的骨架，如植物的纤维素和动物的甲壳素，一般称为构造多糖。另一些多糖在生物体作为能量贮存，如淀粉植物和糖元动物，在需要时可以通

3、过生物体酶系统的作用分解，释放出单糖。三、实验用品：过碘酸酒精溶液、Schiff试剂、亚硫酸水溶液、木精溶液、二甲苯、100%乙醇+二甲苯1：1。梯度乙醇溶液：100，95，90，80，70，50各两份，一份用于脱腊复水，一份用于脱水。载玻片 、盖玻片、染色缸、显微镜 、小烧杯、胶头滴管、镊子、刀片、土豆；小鼠肝细胞石蜡切片。四、实验步骤:一土豆切片的观察制作土豆徒手切片过碘酸处理1530min70%乙醇1min schiff 试剂15min 亚硫酸水漂洗23次 蒸馏水漂洗 镜检二小鼠肝细胞切片的观察取鼠肝石蜡切片 二甲苯脱蜡约 10min 二甲苯+100%乙醇3 min梯度乙醇脱二甲苯，在各

4、浓度乙醇100，95，90，80，70，50中约 23 min 过碘酸 氧化 1530 min 蒸馏水漂洗 Schiff 试剂 1530 min 亚硫酸水漂洗 23 次 蒸馏水漂洗 木精染色 10 min 流水冲洗梯度乙醇脱水50，70，80，90，95，100，在各乙醇浓度中约 23 min 100%乙醇+二甲苯 23 min二甲苯适度透明 指甲油封片 镜检五、实验结果：六、作业与思考:1、描述土豆切片和鼠肝切片中糖原分布特点。土豆切片中，多糖多在细胞质液泡中。鼠肝切片中，多糖多在靠近核的区域。2、影响 PAS 反响染色效果的关键步骤是什么？Camey固定液固定；Schiff 染色液染色；对

5、分色的控制。3、如何制作徒手切片？应注意什么才能得到薄而均匀的切片？应注意需要连续快速地切下多片薄片，并从中选出较好的切片。实验三：叶绿体的别离与荧光观察1、通过植物细胞叶绿体的别离,了解细胞器别离的一般原理和方法。2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法。二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进展差速离心，是别离细胞器的常用方法。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有局部细胞核）。某些物质在一定短波长的光如紫外光的照射下吸收光能进入激发态，

6、从激发态回到基态时，就能在极短的时间放射出比照射光波长更长的光，这种光就称为荧光。假设停顿供能，荧光现象立即停顿。有些生物体的物质受激发光照射后，可直接发出荧光称为自发荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光称为间接荧光。三、实验材料和仪器：普通离心机,粗天平,荧光显微镜，剪刀，研钵，移液管，漏斗，滴管, 10ml刻度离心管,纱布假设干, 无荧光载玻片和盖玻片，新鲜菠菜，0.35mol/L氯化钠溶液,0.01%吖啶橙（acridine orange）、四、实验步骤：1、叶绿体的别离1选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称取2g左右，置于预冷的研钵；2

7、加10ml的0.35molL-1 NaCl溶液研磨匀浆；3用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中；4取滤液4ml于1000rpm离心2min，弃去沉淀；5将上清液3000rpm离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体混有局部细胞核；6沉淀用0.35molL-1NaCl溶液悬浮。2、叶绿体的观察1滴叶绿体悬浮液一滴于载片上，加盖片；在普通光镜下观察，注意观察所别离的叶绿体的形态以及其是否完整。2滴叶绿体悬浮液一滴于无荧光载片上，加无荧光盖片；在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光，其颜色如何。3滴叶绿体悬浮液一滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察其次生荧

8、光。3、完整细胞中的叶绿体观察1用镊子撕取一片菠菜叶子表皮，平铺于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。2用镊子撕去菠菜叶子的表皮，用刀片刮下一些叶肉细胞，放于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。3将以上两种制片进展一下三种方式的观察：a、通光镜下观察。b、光显微镜下观察。c、加一滴0.01吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后，在荧光显微镜下观察。五、实验结果:表皮细胞普镜木质素木质素荧光六、作业与思考：1、描述你所观察到的实验现象，自发荧光和次生荧光的区别？自发荧光：有些生物体的物质受激发光照射后，直接发出的荧光称为自发荧光，如叶绿素的火红色荧光。间接荧光：有的生物材料本

9、身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，那么称为间接荧光，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。2、叶绿体别离的原理是什么？操作过程中应注意什么？通过研磨绿色植物叶片使叶肉细胞破损，叶绿体被释放到提取液中，再通过等渗介质中差速离心去除杂质， 再次离心，那么可别离出叶绿体沉淀。应注意须在低温下迅速提取，且须注意等渗液溶度，离心速度和时间的把握，防止叶绿体破裂。实验四：吖啶橙（acridine orange）染色观察口腔上皮荧光1、熟悉荧光显微镜的原理及使用方法。2、观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。吖啶橙荧光染料可与细胞DNA和RNA结合。其吸收光谱405nm，发射的荧光光谱是53064

10、0nm，因此，吖啶橙和不同的细胞成分结合后，可发射红橙黄绿蓝各色荧光。三、实验用品荧光显徽镜、载玻片、盖玻片、染色缸、牙签；口腔黏膜上皮细胞临时制片；0.1mol/L pH7、0 PBS液。0.1吖啶橙原液、95乙醇四、实验步骤1、用牙签刮取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上；2、95乙醇溶液固定5min；3、滴加0.01吖啶橙染液染色5min；4、用PBS缓冲液缓慢冲洗；5、加盖玻片镜检。五、实验结果口腔上皮细胞荧光实验五：植物细胞骨架的光学显微镜观察掌握植物细胞骨架的制备方法，并用光镜观察洋葱皮细胞的骨架网络构造。细胞骨架（cytoskeleton），是细胞以蛋白质纤维为主要成分的网络构造，根据

11、蛋白质纤维的直径、组成成分和组装构造的不同可分为微丝、微管和中等纤维。本实验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜构造和大局部蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状构造。1、器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、擦镜纸、50ml烧杯；2、实验材料：洋葱鳞茎；3、试剂： pH6.8的磷酸缓冲液、M-缓冲液、1%TritonX-100、3%戊二醛、0.2%考马斯亮蓝R250 染液、50，70，95乙醇、叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性树胶。1、取材：撕取洋葱鳞茎表皮0.51cm2，浸入装有磷酸缓冲液PH

12、6.8的小烧杯中，处理510分钟。2、去垢处理：弃去PBS缓冲液，用吸水纸吸净剩余的PBS，加适量1%Triton X-100，使液体充分浸泡材料，并立即放入37恒温箱或水浴锅中处理30分钟。3、冲洗：吸去1%Triton X-100，立即参加M缓冲液轻轻冲洗3次，每次35分钟。4、固定：用吸管将M缓冲液吸尽，参加3%戊二醛，固定1020分钟。5、冲洗：吸去3%戊二醛固定液，用磷酸缓冲液pH6.8冲洗3次，每次35分钟。6、染色：吸去PBS缓冲液，参加适量0.2%考马斯亮蓝R250染料，染色1020分钟。7、制片：吸去染料，用水冲洗注意不要将材料丧失。将洋葱表皮伸展铺平于载玻片上，加盖盖玻片。

13、8、镜检六、作业与思考1、绘出洋葱细胞的骨架网络分布。2、根据 M-缓冲液的成分，分析其作用。咪唑：稳定 PH 值，缓冲作用；KCL：提供离子，对骨架起聚合作用；MgCl2：EGTA：螯合Ca离子，Ca离子对聚合不利；EDTA：巯基乙醇：起复原作用，稳定骨架构造。3、通过实验过程，推测你所观察到的细胞骨架属于胞质骨架中的哪种类型，为什么？推测为所观察到的蓝色纤维属于细胞骨架中的微丝构造。因为微管的构造较不稳定，局部纤维太细，光镜下难以分辨；而中间丝不是植物细胞的必须构造，在植物细胞中并不普遍存在，且中间丝更为纤细，光镜下更难以观察。因此，推测为微丝。实验六：PEG法诱导细胞融合1、了解细胞融合

14、的原理和过程；2、初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术。细胞融合，即在自然条件下或利用人工法，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。化学融合方法一般使用聚乙二醇（PEG）诱导细胞在体外进展融合。普遍认为PEG分子能改变各类细胞的膜构造，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的外表力作用，从而使细胞发生融合。促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度（有效工作浓度50%）的PEG溶液，但在高浓度PEG溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择适宜的PEG分子量，浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。细胞融合率是指

15、在显微镜的一个视野，已发生融合的细胞核总数与该视野所有细胞（包括已融合的细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示。1、器材: 离心机、显微镜、天平、水浴锅、滴管、离心管、烧杯、盖玻片、载玻片。2、材料：鸡血悬液；0.85%的生理盐水、GKN液、1%詹那斯绿B、Hanks溶液。1、鸡血红细胞悬液的制备：将抗凝剂与鸡血按1:31:4的比例稀释，制成鸡血红细胞细胞悬液；2、取鸡血1ml，参加4ml0.85%的生理盐水，1000rpm离心3min, 弃上清液，重复上述操作一次；3、沉淀用适量Hanks溶液重悬浮，1000rpm离心3min, 弃上清液；4、迅速加0.5ml 50% PEG溶液，滴管轻柔

16、吹打悬浮细胞，37水浴中进展细胞融合30min左右；5、缓慢参加Hanks溶液，轻轻混匀，终止PEG的作用，使细胞三三两两地分散开来镜检，室温静置约20min；6、取1小滴悬液于载玻片上，加少量的詹那斯绿B染液，染色5min左右；7、镜检，观察细胞融合现象。鸡血细胞融合1、请分析 Hanks 溶液的作用是什么可以从其成分的角度来答复？1.作为平衡盐溶液无机盐和葡萄糖浓度接近大局部动植物细胞的水平；2.终止细胞融合；3.制备细胞悬液，使细胞分散。2、PEG 诱导细胞融合率受哪些因素影响？受PEG的相对分子质量、PEG 的体积分数、融合时的时间长短及温度上下等因素影响。3、你认为在进展细胞融合时，

17、需要注意哪些问题？ 在参加PEG溶液后，应立即用滴管轻轻吹打悬浮细胞，可能出现多数细胞聚集的现象，在融合过程过后无法对细胞进展融合观察。实验七：动物骨髓细胞染色体标本的制备与观察1、掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术2、观察染色体的数目以及形态特征骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度的分裂能力，可以直接观察到分裂细胞。经过秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本。骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在一般的实验室都可进展。1、仪器：天平、低速离心机、恒温水浴锅、显微镜、1ml注射器、解剖盘、

18、解剖剪、刀片、试管架、10ml离心管、吸管烧杯、量筒。酒精灯、冰冻载玻片、玻璃板、吸水纸、擦镜纸小白鼠Carnoy固定液、0.1秋水仙素、0.85%生理盐水、柠檬酸钠溶液、0.4%KCl溶液、40.0667mol/L磷酸缓冲液pH7.4、1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液。1、骨髓细胞制备如下表：步骤小鼠两栖动物1秋水仙素注射按4ug/g体重注射34h后处死按30ug/g注射78h后处死2取后肢胫骨和股骨，切去两端。3取骨髓细胞2%柠檬酸钠溶液1ml 1%柠檬酸钠溶液1ml 用1ml注射器吸取柠檬酸钠溶液，通过针头将溶液注入骨髓腔，冲出骨髓细胞置10ml离心管中细胞冲净后骨髓腔由粉红变为白色；

19、摘掉针头，用注射器筒轻轻反复吸打，使分散成单个细胞。4低渗处理预热及低渗水浴温度：37低渗时间：30min 26视细胞多少参加79ml 预热的0、4%KCl溶液，在水浴中低渗处理。2、 1000rpm离心8min。3、弃上清，沿离心管壁缓慢参加新配制的甲醇：冰醋酸3:1固定液5ml，注意不要冲动细胞团块。加完后立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定20min。如此反复固定23次，每次20min。4 固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡参加少量新配制的固定液，细胞团块轻轻吸打成悬液注意：吹打不要过于用力。5、在干净并预冷的载玻片上滴23滴细胞悬液，枯燥。注意：滴片时滴管离载玻片有

20、一定高度有助于染色体分散6、将玻片细胞面朝上水平放置，滴加1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液34ml，染色10min。7、冲洗掉染液，枯燥后镜检。老鼠大腿骨髓细胞染色体1、在制备小鼠骨髓细胞染色体时为什么要进展预固定？由于别离得到的染色体处于不同的分裂期，进展预固定是为了将这些细胞及其染色体固定在当前所处的时期，便于观察。实质就是将细胞杀死，使其无法继续进展有丝分裂。实验八：酵母活性的检测及线粒体活性观察掌握检测细胞活性的原理和方法，线粒体原位染色原理及线粒体观察。美兰次甲基蓝染色法对啤酒酵母活性检测简单易行，该染色法主要是利用细胞膜的完整性与新代的能力说明细胞活性。活酵母细胞具有复原次甲基蓝

21、呈无色的一种复原酶，当酵母细胞浸于美兰溶液时，色素渗入细胞，活细胞的复原酶能使其脱色，但死细胞的复原酶由于失活，不发生脱色作用，故被染成蓝色。台盼兰是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性。正常的活细胞，胞膜构造完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。TTC即2,3,5-氯化三苯基四氮唑，可以用来测定脱氢酶的活性。在细胞的线粒体中四氮唑从电子传递链上承受电子形成三苯基甲腙，其为脂溶性物质，形成后随即插入线粒体等膜中或脂

22、滴中，变成红色。细胞活力强，有氧呼吸旺盛，这种转化能力就强，红色深；而死细胞新代停顿不能使四氮唑转变成三苯基甲腙衍生物，细胞不着色。此法常用于悬浮培养细胞等材料整体活力检测分光光度法，在单个细胞活力检测中较少用。詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进展超活染色，这是由于线粒体的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被复原为无色的色基（即无色状态）。1、材料：液体振荡培养的酵母。2、仪器：倒置显微镜生物显微镜，低速离心机，血球计数板，15mL离心管，试管，移液管，盖玻片，滴管，香柏油等。2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液

23、含有0.01%的次甲基蓝、0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）、0.2%的TTC溶液、0.1%台盼兰溶液、詹纳斯绿B溶液、Ringer溶液。1、美兰染色法步骤1配制不同生长状态的酵母样品，用蒸馏水调整细胞总数在（30-60）106个/ml。2染色液与酵母样品液等量混合，染色5min。3用血球计数板做水封片，显微镜下计数染色细胞与总细胞数。重复3次。4细胞活性=活细胞数/总细胞数100%2、台盼兰染色步骤：晃动悬浮培养物，稍静置，吸取上层悬浮液，在倒置显微镜下观察细胞，用缓冲液调到适宜观察的细胞密度，参加几滴0.1台盼兰溶液，用滴管混合均匀，5分钟后显微镜下观察，计数100个细胞的染况，重复

24、3次，计算存活率。3、TTC染色步骤：1吸取振荡或静置培养的培养物8mL，以1000转/别离心10分钟。2小心吸去上清液，参加0.4%的TTC溶液5mL混匀，30下染色1小时。3在显微镜下观察细胞染况，比拟两种培养物染色差异。4、詹纳斯绿B染色步骤：2小心吸去上清液，参加少量詹纳斯绿B 溶液混匀，30下染色30分钟。3在显微镜下观察细胞染况，油镜下观察线粒体。比拟两种培养物染色差异。1、美兰和台盼兰染色方法细胞存活观察次数处理方法123平均美兰染色活细胞27292627.33死细胞71088.33存活率%79.4174.3676.4776.64台盼兰染色31283531.33656.3383.

25、7884.4881.4083.182、振荡培养酵母TTC和詹纳斯绿B的细胞染色观察1、美兰和台盼兰染色方法所得存活率差异原因探讨。对于美兰染色，死细胞的复原酶由于失活，不发生脱色作用，故被染成蓝色；对于台盼兰染色，死细胞的细胞膜丧失活性或构造被破坏，胞膜的通透性增加，可被台盼兰染成蓝色。然而，在美兰染色中，可能存在局部活细胞由于复原酶活性相对较低，而不能完全脱色，因此会造成判定细胞死亡的假象，故美兰染色的细胞存活率较台盼兰染色的偏低。2、酵母TTC和詹纳斯绿B染色差异的原因是什么？ 对于TTC染色，在细胞的线粒体中四氮唑从电子传递链上承受电子形成三苯基甲腙，其为脂溶性物质，形成后随即插入线粒体

26、等膜中或脂滴中，变成红色。对于詹纳斯绿B染色，由于线粒体的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色。综合性实验：细胞分裂中期纺锤体和染色体构造荧光观察1、学习和掌握细胞免疫荧光染色/细胞转染技术和荧光显微镜使用。2、观察有丝分裂过程中染色体和细胞骨架的形态特征和动态变化。有丝分裂是高等生物细胞增殖的主要方式。在有丝分裂过程中，细胞核的染色体通过复制，形成姐妹染色体，在微管形成的纺锤体的牵引下，每一对染色单体分开，并向相反地方向运动，随后胞质分裂，最后形成两个完整的子细胞。通过有丝分裂，细胞形成两个与母细胞完全一样的子细胞，核染色体经过准确地复制，并有规律地均匀分配到两个子细胞中去，使子细胞遗传组成与母细胞保持一致。在细胞有丝分裂过程中，伴随着一系列事件的发生，比方基因组DNA的复制，染色体的形成，中心体移动到细胞两极，微管组装，纺锤体形成，核仁消失，核膜破裂等等。通过一定的细胞处理，可以将细胞阻滞在某个分裂阶段，再通过染色或标记，就能够观察和研究该阶段的细胞部构造状态。细胞培养间，超净工作台，细胞培养箱，倒置荧光显微镜，低速细胞离心机，水浴锅，冰箱，移液枪。高糖DMEM液体培养基，胎牛血清FBS，0.25%胰酶消化液，PBS，200U/l青链霉素储藏液P/S，0.2% 秋水仙碱，牛血清白蛋白BSA，4% 多聚甲醛，75%酒精