显微镜原理调试使用和保养Word文档下载推荐.docx

1、电源开关旋钮也可调节照明光源的亮度，使所观察的视域可随时获得适当的亮度，可调范围为3-12V。作显微照相时，可根据曝光以及彩色底片色温的要求来调节灯光的亮度。当准备关掉电源之前，应先将亮度调节旋钮调到最小。6. 粗、微调焦旋钮coaxial coarse/fine focusing controls调焦旋钮转动时带动燕尾导板上下移动，而导板上则装有物台托架和聚光镜托架，从而使物台趋向或远离物镜到达调焦的效果。7. 透射光用的滤光片选择按钮push buttons for filter magazine透射光显微镜检方法所需用的一组滤光片已安装在显微镜的底座内，通过底座外的按钮就可以根据不同的需

2、要来选择适用的一块或一组滤光片。通常的滤光片配套有：（1） 蓝色色温转换滤光片：用来把光源的色温由3200K转换成日光型彩色底片所需 的5500K色温；（2） 绿色滤光片：用来增强相差观察方法中成像的反差，或者以黑白底片作显微照相时，可以提高片成像的反差；（3） 浅灰色滤光片：是透光率为50%的中性减光滤光片，可把视野的亮度减弱一半；（4） 灰色滤光片：是透光率为25%的中性减光滤光片，可把视野的高度减弱75%；（5） 透光率仅为6%的中性减光滤光片，可把视野的亮度变得相当暗，95%以上的光都已被吸收掉。8. 光源的视场光阑luminuos field diaphragm视场光阑是显微镜照明光

3、路系统中的重要部件之一，它只能按照库勒照明系统的要求来进行调节，视场光阑不可以任意开大，但要根据使用的物镜倍数来调节适当的大小。视场光阑的主要功用有：（1） 控制杂散光在成像光路系统中的影响，特别是免除杂散光对照相系统的干扰，使显微照相的底片不至于蒙上一层灰雾；（2） 控制照明光束的大小，使所观察的视域能受到均匀的照明；（3） 在荧光显微镜检方法中，可以把激发光限制在所需激发样品的视域范围内，以防止视域外的样品过早受到激发。9. 聚光镜系统condenser system聚光镜系统是照明光路系统中的重要部件之一，它也只能按照库勒照明系统的调整要求来进行调节。聚光镜系统调整的好坏，可以直接影响显

4、微镜视域中照明的均匀性，也可影响显微镜的分辨力，还可以直接控制显微照相底片上的反差。聚光镜系统通常由以下几个部件组成：（1） 聚光镜本体condenser可以是简单的阿贝聚光镜，也可以是消球差-消色差的优质聚光镜，另外还有一种是消除了内应力的偏光聚光镜。聚光镜的重要参数之一是数值孔径NA，通常为0.32；这样的数值孔径太小，只能与以下的物镜配合使用，因此需配用前端透镜来提高数值孔径，以便与不同倍数的物镜灵活配合使用；（2） 前端透镜front lens前端透镜本身的数值孔径通常为0.63、0.90、1.30或1.40，它要附装在聚光镜本体上，可以方便地摆进或摆出光路。最常用的前端透镜数值孔径为

5、0.90，当它摆入光路时，可以和10及以上的物镜配用，摆出光路时可以和10以下的物镜如6.3、5及2.5等物镜配用；（3） 聚光镜的孔径光阑aperture diaphragm孔径光阑实际上是一个可变光圈，它是显微镜照明光路系统中的又一个重要部件，在透射光明视野法、微分干预相衬法以及偏光法所使用的聚光镜中，都装有孔径光阑。它可以影响显微镜在作观察时的分辨力；直接控制显微照相底片上的反差；可用来调节聚光镜的数值孔径，配合所用物镜的数值孔径，以取得最正确的分辨本领，或最大的分辨本领；还可以使光源的发光体成像于孔径光阑所在的平面上，从而满足库勒照明系统的前提条件。在实际操作中，调节聚光镜孔径光阑可以

6、改变显微镜中所观察到的视野亮度，这是由于历史上对聚光镜孔径光阑的误解所造成的错误用法。这里要特别强调：不应该用聚光镜的孔径光阑来调节视野中的亮度、更不应该用调节聚光镜位置高低的方法来调节视野中的亮度！以往的错误用法希望能在实际操作中纠正过来。（4） 转盘turret在多用途聚光镜系统中，为方便才把明视野的孔径光阑、暗视野的中央光挡、相差法所需用的各种不同直径的环状光圈、微分干预相衬法用的DIC棱镜及其孔经光阑等部件装在转盘上再嵌入到聚光镜本体的座子内，使用时转动转盘就可以选用不同显微镜检法所适用的聚光镜，方便而又快捷。聚光镜系统有两个调节装置：a. 聚光镜的调中螺丝centering scre

7、ws调中螺丝通常为1对，位于聚光镜托架前方的左右测。和环形燕尾槽中的调中螺丝成三足鼎立之势，可以聚光镜前后、左右调整，使聚光镜的光轴与照明光路、成像光路合轴；b. 聚光镜托架的上下调节装置vertical adjustment of condenser carrier： 利用这个调节装置，可使聚光镜的位置作上下调动，使视场光阑经过聚光镜在样品视野中的成像调到最为清晰，光阑像的位置也可利用托架上的调中螺丝来进行调中，从而满足库勒照明系统调整的要求。10. 机械移动式载物台specimen stage载物台可以承载样品，装有可在水平方向上作前后、左右移动的调节装置，有的还可以在水平方向上作大约10

8、0度的旋转，以便使样品能更好地与显微照相的取景框相适配。11. 物镜转换器nosepiece物镜转换器安装在滑插式燕尾槽座上，已作了准确的对中。可迅速更换物镜。常用的有6个、5个及4个孔位的物镜转换器。12. 物镜objectives物镜是显微镜的核心光学部件，显微镜的放大倍数、分辨本领、色差与像差的校正状况、工作距离等，都有直接由物镜来决定。衡量物镜质量的基本参数主要有：a. 色差消正的程度或级别；b. 像场平坦的程度；c. 所使用的玻璃材料。数值孔径NA是物镜最重要的参数，数值孔径越大，分辨率越高。目前物镜的数值孔径最大只有1.30。按照物镜色差和像差校正的程度，物镜可以分为以下类别：（1

9、） 消色差物镜achomats通常对红光与蓝光两种色光作了色差校正，但视域中像场的平坦程度并未作过完善的校正，因此只能作一般的观察应用。在偏光显微镜中，由于需要消除物镜内各个镜片的内应力，反而需要利用这种镜片数目不多的物镜来做偏光物镜。（2） 有限平像场消色差物镜flat-field achromats这也是对两种色光作了校正的消色差物镜，但视域范围内像场的平坦程度只作了有限范围内的校正，通常在显微照相取景框范围内像场是平坦的，以确保显微照相对焦的清晰，取景框范围以外，往往不一定能保证同样的清晰度。适用于常规检验而又需要作显微照相的工作中。（3） 完善平像场消色差物镜plan-achromat

10、s这也是对两种色光作了校正的高级消色差物镜，主要特点是像场在整个视域中作了完善的校正，适合于作要求较高的显微镜检工作，特别是作显微照相效果更好。由于这种物镜仍采用常用的光学玻璃，不适宜作荧光等这一类弱光的观察和照相。（4） 萤石玻璃消色差物镜neofluar这也是对两种色光作了色差校正的消色差物镜，其中全部或部分镜片则采用了可透过近紫外光波长约为365nm的萤石玻璃即氟化钙晶体来制造。因此特别适合于作荧光与相差方法的观察与显微照相，也可用在偏光显微镜中。 （5） 完善平像场复消色差物镜plan-opo-chromats这是最高一级的消色差物镜，对红、绿、蓝3种颜色都作了很好的色差校正，而视域中

11、的像也作了完善的校正，数值孔径比萤石物镜大，可应用于要求极高的显微观察与显微照相中，但价格十分昂贵，由于所使用的镜片数目多达12片，光能损失较大，不宜用作荧光观察与照相。（6） 已消除内应力又可以调节中心的物镜pol Z objectives这是一种适用于作偏光观察的物镜，是从以上所介绍的几种物镜中挑选出来的，在装配时特别注意消除了其中的内应力，以免内应力所引起的干预条纹干扰了偏光样品中真正的干预条纹。之间的盖玻片都可以作相应的校正。1986年以来，德国蔡司公司推出的新一代光学显微镜，其中的物镜突破了传统光学显微镜的概念，采用了无限远色差校正的光学系统infinity color-correc

12、ted system，简称ICS物镜，其特点是：由物镜射出的成像光束是一束平行光，可在成像光路中按需要插入任意多的光学部件而不影响成像质量。在显微镜镜体内有一特制的镜筒透镜tube lens与物镜相配，两者结合起来把物镜的色差与像差都作了十分完善的校正，而且物镜的视域相当宽阔，比传统物镜的视域扩大约40% 。13. 荧光滤光片组插板的插口slot for the fluorescence slider这是为作荧光观察时插入荧光滤光片组插板预留的插口。14. 勃氏镜插板的插口slot for Bertcand-lens slider这是为作偏光观察时插入勃氏镜插板预留的插口，勃氏镜是偏光显微镜中

13、用作锥光干预图试验的重要部件。15. 补色器插板的插口slot for auxiliary objects这是当作微分干预相衬观察和偏光需加入的各种补色器预留的插口。16. 双目镜筒或带照相镜筒的双目镜筒binocular tubes or binocular phototubes用来安放目镜及照相装置。为便于观察，镜筒制成具有一定倾斜角度30或45，设有瞳距调节装置，可在55至75范围内调节，以适合不同使用者两眼瞳孔距离。双目镜筒内装有一些折光和分光棱镜，能把从物镜出来的一束成像光束等分成两部分，分别由两个目镜作观察。带照相镜筒的双目筒一般在右测装有光束分配棱镜的拉杆，把它全部推入时只作观察

14、，拉出来则一边观察一边照相，或全部作显微照相。17. 目镜eyepieces目镜是显微镜中把物镜所成的像作再一次放大的光学部件，显微镜的总放大倍数通常就是物镜与目镜放大倍数的乘积。为方便不同视力者进行显微拍照时调焦同样清晰，一些目镜设计成可调焦式。为了使显微镜获得最大有效放大倍数和最高分辨本领，必须合理选配目镜。到目前为止，由于受光学定律的制约，光学显微镜最大的有效放大倍数为1250-1300倍。10目镜是最常用而必须配备的目镜，观察荧光时最好选用10以下的目镜。显微镜的正确调试和使用 在了解了显微镜各主要部件的名称、构造和功能之后，为了更好地发挥显微镜的各种功能，提高工作效率，保证在显微观察

15、及显微照相过程中取得最正确效果，使用人员必须了解和掌握显微镜正确的调试方法和使用方法。尤其在新一代显微镜中，具备了多种功能，能进行多种显微镜检方法观察，正确的试调方法和使用方法就显得尤为重要。下面以Axioplan万能研究显微镜为例，简述调试及使用方法。1. 显微镜照明光路系统的调整为了使显微镜的视野能受到均匀而又充分的照明，在显微镜初次安装和调试时，就必须把照明光路系统调整好，这是正确使用显微镜，并获得正确、可靠结果的重要手段和最基本的要求。此外，正确掌握照明光路系统的调整，是使用显微镜过程中更换光源灯泡后所必经的步骤，也是在日常使用过程中不时地检验显微镜性能的必要手段。显微镜照明光路系统的

16、调整主要有以下4项内容：（1） 照明光源灯室在显微外的初步调整 首先将灯室的外壳打开，压弹簧夹子将卤素灯泡装入插座中，安装时防止手指直接接触灯泡可用柔软的布或纸隔住，以免灯泡上留有指纹等脏物，影响灯泡的使用寿命。 把灯室摆在桌面上，接通电源后，用专用的螺丝刀调节灯的调焦旋钮孔标有“”，使灯丝投影在1-2m外的墙上，将灯丝成像调至清晰；然后调节灯的高低位置调节丝孔标有“”，使灯丝位置高低适当；再调节灯的左右位置调节螺丝孔标有“”，使灯丝左右位置合适。（2） 光源发光体灯丝在显微镜内位置的检验和校正目的是为了把发光体的像端端正正地调入物镜的视域范围内，从光源的角度去确保显微镜的视域受到充分而均匀的

17、照明，这是调整库勒照明系统的前提条件。需要的基本工具：对中望远镜购置显微镜时已配备。 拔掉灯库内的毛玻璃套筒，把灯室装回显微镜上； 选用10物镜，开亮光源程序找样品并调焦清晰，再换用40物镜把样品调焦清 晰40物镜可以看清灯丝的全貌； 把聚光镜的孔径光阑和视场光阑均开到最大； 拔掉其中一个目镜，换上对中望远镜，抓住白色部分，另一手伸缩黑色接目镜，就可在视野中看到灯丝像； 如灯丝位置不合适，调“”孔，把灯丝像沿水平方向调好，调“”孔，把丝像沿垂直方向调好，直至将灯丝像调至刚好充满物镜孔径的光圆像； 调整完毕后，将毛玻璃套筒插回原位，拔掉对中望远镜，换回目镜作下一步调整。以上所述照明光源灯室在显微

18、镜外的调整和光源发光体在显微镜内位置的校验，只需在显微镜初次安装调试及更换灯泡时进行，平时使用显微镜时不能随意乱调乱动。万一调乱时，可按上述步骤调回原状。（3） 库勒照明Kohler系统的正确调整显微镜的正确调试，主要工作之一是照明光路系统的调整，而其中的关键是库勒照明系统的调整。对于每一位使用显微镜的人员，特别是作显微照相的人员来说，应该对库勒照明系统的原理及其调整步骤有一定的了解和掌握，才能充分发挥显微镜应有的功能，拍出来的照片才能在效果上比较一致而又完善。库勒照明系统的原理简单来说就是：光源发光体上任意一点发出的光，可以照明显微镜的视域范围，而光源发光体上每一点所发出的光聚集起来，在显微

19、镜的视域中就实现了非常充分而又均匀的照明。调整库勒照明系统的目的，是为了使所观察的视域能获得均匀而又充分的照明，防止杂散光对照相系统造成影响或干扰，以免照相时在底片形成灰雾。高调整库勒照明系统的必要部件：视场光阑、可进行合轴调整的聚光镜系统。 选用10物镜和10目镜； 把聚光镜前端透镜摆进光路中，孔径光阑调至适中的位置上不大不小，再把聚光镜升到最顶的位置上，聚光镜转盘调至明视野“J”位置； 把视场光阑调至最小0.1； 载物台上放上已封片的生物样品，开亮光源，调焦清晰； 视域中会出现一个局部照明的区域或亮斑，这是视场光阑的模糊像，在其中可以清晰地看到样品的细节；在它之外是较暗的视域，不一定能把样

20、品的细节看得清楚； 把聚光镜微微地向下调，使视野中的亮斑逐渐收小，慢慢变成一个清晰的多边形象，这便是视场光阑的清晰像； 一般情况下，多边形象并不在视域中央，需要调整聚光镜的一对调中螺丝，把视场光阑多边形的像调至中央位置； 逐渐开大视场光阑，使多边形象成为视域的内接多边形，进一步核对调中的状况，如对中不够理想，继续微微调对中螺丝； 将视场光阑稍为再微微开大一些，使它的多边形象恰好消失在视域的边缘上，至此，库勒照明系统调整完毕。库勒照明系统调整好以后，整个视域照明均匀，拍摄的显微照片明亮清晰，反差正常。在日后使用过程中应特别注意：a. 视场光阑不可任意开大，但可随物镜倍数的增大而将视场光阑收小，随

21、物镜倍数的减小而开大；b. 聚光镜的高低位置不准乱调，否则会破坏已调整好的库勒照明系统；c. 使用10以下物镜时要将聚光镜前端透镜摆出光路外，使用10或10以上物镜时要将前端透镜摆入光路中；d. 关于物镜倍数与视场光阑大小配合问题，在实际使用过程中，作为一般观察不一定要收小或开大视场光阑，但作显微照相时，为了防止杂散光线对照相系统的干扰，以便能拍摄到较完善的照片，则应在使用每一个倍数的物镜时，把视场光阑调节到正好消失于所观察的视域边上，这是比较繁复的工作，但又非做不可。较为简便的方法是把与各个倍数物镜相对应的视场光阑事先调整好，并作好记号，以后使用时根据记号直接调至相应的位置。（4） 孔径光阑

22、的正确使用由于聚光镜的孔径光阑可以影响显微镜的分辨率，使用时应掌握正确的使用方法。过去由于对孔径光阑的认识不足，往往把它当作是调节视野亮度的工具。虽然调节孔径光阑在一定程度上可以改变视野的亮度，但会直接影响成像的反差、比照度及分辨率，在使用过程中应尽可能防止。为了发挥聚光镜孔径光阑的作用，以便在观察时，尤其在作显微照相时获得最正确分辨率，在每换用一个倍数的物镜时，在样品调焦清晰后，需要调节孔径光阑，使它的大小正好等于所用物镜数值孔径物镜孔径像的2/3 。调整方法是用对中望远镜对焦于视野中黑色相差环上，调节孔径光阑，可以看到一个多边形的孔径光阑像，然后调到等于物镜孔径像的2/3，即介于黑色相差环

23、外与圆形视域内之间。为方便起见，可把与各倍数物镜相对应的孔径光阑预先调整好，并作好标记，以免每次使用都要重新调整。2. 显微镜成像光路系统的调整及显微镜检术概要显微镜成像光路系统的调整，是根据不同显微镜检术的需要而进行的。所谓显微镜检术microscopy，概括而言就是以显微镜观察样品时所使用的照明方法，以及如何使样品所成的像能获得更良好反差的技术与方法。以下简述显微镜检术中已成熟的几种方法及对应的显微镜成像光路系统的调整方法。（1） 透射光明视野brightfield这是自显微镜发明以来最传统、最普遍的应用方法。基本部件：a. 物镜：任何物镜都可作明视野观察；b. 聚光镜：各种聚光镜均可，最

24、好配有孔径光阑。调整方法：在上述显微镜的库勒照明系统调整好后，即可应用明视野法。适用范围：所有已染色的组织切片、血液涂片等。注意事项：a. 使用明视野方法观察时，一定要将库勒照明系统调整好；b. 视场光阑不可任意开大，使用10、10以下和10以上物镜时，要将聚光镜前端透镜分别摆事实出和摆进光路中；c. 不可用聚光镜的孔径光阑来调节视野的亮度，更不要乱调聚光镜的高低位置，否则，会降低显微镜的分辨率和破坏已调整好的库勒照明系统；d. 作显微照相时，每换用一个倍数的物镜，就要调节聚光镜的孔径光阑，使它的大小正好等于所用物镜数值孔径的2/3 。（2） 透射光相差法phase-contrast这是现代显

25、微镜检术中的一种反差增强法。相差物镜、明视野与相差兼用的多用途聚光镜、对中望远镜、绿色滤光片。a. 在库勒照明系统调整好的基础上，用明视野方法把样品调焦清晰；b. 把聚光镜转到Ph1对准转盘刻度线位置，选用10相差物镜，换上待观察的透明样品； c. 拔掉其中一个目镜，换上对中望远镜，并调焦于视野中的两个相差环上物镜的黑色相差环和聚光镜的透光相差环；d. 视野中的两个相差环不一定重合，调节聚光镜上的两个调节装置调整相差环左右位置的调节杆和调整前后位置的摩擦式转钮，使透光环作前后左右移动而与黑环重合；e. 调整好后，换回观察用目镜，将绿色滤光片按入光路中，即可观察到样品的相差像；f. 有20和40

26、物镜观察时，聚光镜应设在Ph2位置上，用100物镜时，聚光镜应设在Ph3位置上。适用于观察透明、未染色或不能染色的样品，如各种细胞、活组织、未染色或不染色的组织切片、水生生物等。（3） 微分干预相衬法differential interference-contrast，DIC为了克服相差法观察时样品细节像周围伴随有光晕，会掩没掉本来应该看见的细节，以及样品或组织切片厚度要求相当薄，原则上下能厚于10?m等局限性，利用双光束干预的原理设计子微分干预相衬法。调整方法 a. 必须在库勒明系统已调好的基础上才能调好DIC方法；b. 先用10物镜，以明视野先确定好能把样品看清晰的物镜调焦位置；c. 把起

27、偏器polarizer摆入照明光路中，注意其取向应为东西方向；d. 把聚光镜转盘转到与10物镜对应使用的位置上，即DIC 0.30.4；e. 在物镜后方或物镜转换器上插入10物镜使用的DIC插片DIC slider；f. 把检偏器analyser插入成像光路中，注意其取向应为南北方；g. 换上待观察的透明样品，开亮光源把样品调焦清晰；h. 调节DIC插片，使微分干预相衬的像到达最正确效果，也就是浮雕效果最为明显；i. 同时可调节聚光镜的孔径光阑，使反差的效果也到达最正确；j. 然后再细微调样品的细节，可见样品中不同层面上的结构；k. 如果把补色器first order red retardation plate插入，并同时调节DIC插片，可在视野中看到不断变化的绚丽色彩，红、橙、黄、绿、蓝、紫、粉红、粉紫及金黄色都具有。透明或不能染色的组织切片，厚度可达100?m左右，培养中的活组织和活细胞、小生生物等。（4） 落射光激发的荧光法incident-loght fluorescence Epi-FL简称为落射荧光法，是近代显微镜检术中新发展出来的一种强有力的反差增强法。它将激发荧光用的光源改在物镜的上方，光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品，从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿