考点加强课6 微生物的筛选鉴定分离与计数.docx

1、考点加强课6 微生物的筛选鉴定分离与计数1.分离微生物的原理与措施(1)原理:自然环境中的微生物是混杂在一起的,因此分离获得纯培养物应首先采用的方法是将单个的细胞与其他细胞分离,再给细胞提供合适的营养和条件,使其生长成为可见的群体。(2)常用措施接种过程中尽量使细胞分散开来,如平板划线法、稀释涂布平板法。运用选择培养基的作用特点,在培养基中添加某种特定的物质,抑制不需要的微生物的生长,促进所需微生物的生长。2.选择培养基四种常见制备方法或实例【例证1】 (2017全国卷,37)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3,供植物吸收和利用。回答下列问题:(1)有些细菌能分解尿素,有些细菌则不能,原

2、因是前者能产生。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源,原因是_,但可用葡萄糖作为碳源,进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_(答出两点即可)。(2)为了筛选可分解尿素的细菌,在配制培养基时,应选择(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素NH4NO3”)作为氮源,不选择其他两组的原因是_。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4,其作用有_(答出两点即可)。解析(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,以尿素作为氮源。能分解尿素的细菌是一种分解者,属于异养型生物,不能以尿素的分解产物CO2作为碳源。能分解尿素的细菌可以以葡萄糖作为碳源,进入细菌体内的葡萄糖的主要作

3、用是:一方面可氧化分解为细胞生命活动提供能量,另一方面其代谢中间产物可为多种有机物的合成提供原料。(2)为了筛选可分解尿素的细菌,在配制培养基时,应选择以尿素作为唯一氮源的选择培养基,而其他两组都含有含氮物质NH4NO3,能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3不能起到筛选作用。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4,其作用:KH2PO4和Na2HPO4构成缓冲液,可维持培养基的pH相对稳定；KH2PO4和Na2HPO4能为微生物生长提供无机盐。答案(1)脲酶分解尿素的细菌是异养生物,不能利用CO2来合成有机物为细胞生命活动提供能量,为其他有机物的合

4、成提供原料(2) 尿素其他两组都含有NH4NO3,能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3,不能起到筛选作用(3)为细菌生长提供无机盐离子,作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定【例证2】 (2014全国卷)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题。(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶,该酶是由3种组分组成的复合酶,其中的葡萄糖苷酶可将分解成。(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时,CR可与纤维素形成色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时,培养基上会出现以该菌的菌落为中心的。(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落,某同学设计

5、了甲、乙两种培养基(成分见下表):酵母膏无机盐淀粉纤维素粉琼脂CR溶液水培养基甲培养基乙注:“”表示有,“”表示无。据表判断,培养基甲(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌,原因是；培养基乙(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌,原因是_。解析(1)纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物,是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用,如下图:(2)刚果红可与纤维素形成红色复合物,当纤维素被纤维素酶分解后,红色复合物无法形成,出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,我们可以通过观察是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培

6、养基,且需以纤维素为唯一碳源。答案(1)纤维二糖葡萄糖(2)红透明圈(3)不能液体培养基不能用于分离单菌落不能培养基中没有纤维素,不会形成CR纤维素红色复合物,即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌1.(2019湖南、江西十四校联考)马、牛羊的食物主要是草茎类,其中还有大量的纤维素。它们胃内的微生物,在帮助消化和利用植物纤维素方面起了决定性的作用,土壤中也存在着分解纤维素的微生物。请根据所学的知识,回答下列问题:(1)纤维素酶是一种复合酶,主要包括、。(2)在培养基中进入刚果红染液可以鉴别纤维素分解菌,其原因是_。(3)分离土壤中纤维素分解菌用到的方法是。稀释倒平板法涂布平板法单细胞挑取法选

7、择培养分离A. B.C. D.(4)在微生物的分离与培养的过程中,为了防止杂菌的污染,需要进行严格的无菌操作,如接种环和接种针需要,培养基需要等。(5)下表为鉴别纤维素分解菌的培养基配方,请判断该培养基为培养基,酵母膏和土豆汁在实验中的作用是_。鉴别纤维素分解菌的培养基配方CMCNa510 gKH2PO40.25 g酵母膏1 g琼脂15 g土豆汁100 mL将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1 000 mL。解析(1)纤维素酶包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。 (2)刚果红染液可以与纤维素结合形成红色的复合物,纤维素分解菌产生的纤维素酶能够将纤维素分解为葡萄糖而使其菌落周围出现透明圈,所以在培养基

8、中加入刚果红染液可以鉴别纤维素分解菌。(3)分离土壤中纤维素分解菌,先进行选择培养,增大纤维素分解菌的浓度,梯度稀释,涂布平板、培养,单细胞挑取以获得纯培养,正确；稀释倒平板法是先进行梯度稀释,然后分别取不同稀释液少许,与已熔化并冷却至50 左右的琼脂培养基混合、摇匀后,倾入灭菌的培养皿中,制成可能含菌的琼脂平板,保温一定时间即可出现菌落,错误。(4)在微生物的分离与培养的过程中,接种环和接种针需要灼烧灭菌,培养基需要高压蒸汽灭菌。(5)根据表格分析,该培养基中有琼脂,因此为固体培养基；酵母膏和土豆汁在实验中的作用是为纤维素分解菌提供生长因子。答案(1)C1酶CX酶葡萄糖苷酶(2)刚果红染液可

9、以与纤维素结合形成红色的复合物,纤维素分解菌产生的纤维素酶能够将纤维素分解为葡萄糖而使其菌落周围出现透明圈(3)B(4)灼烧灭菌高压蒸汽灭菌(5)固体提供生长因子2.(2019四川资阳一诊)亚硝胺广泛存在于化工类废水中,对环境有严重危害。某研究小组欲从处理废水的活性污泥中分离纯化亚硝胺降解高效菌株。请回答下列问题:(1)泡菜腌制过程中产生的在特定的条件下也会转变成亚硝胺,对人体健康产生危害,所以在泡菜腌制过程中,要注意控制腌制的和食盐的用量。(2)选择培养时的培养基只能以作为唯一氮源,经灭菌后用于富集亚硝胺降解菌。(3)分离纯化出3种亚硝胺降解高效菌株,为了比较3种菌株的降解效率,将等量的3种

10、菌株接种于富含亚硝胺的培养基,一组不接种作为空白对照,一段时间后测定4组培养基中亚硝胺的。设置空白对照的目的是_。(4)在上述实验的基础上研究亚硝胺降解高效菌株混合使用的降解效率,理论上还需要设计组实验。解析(1)泡菜腌制过程中产生的亚硝酸盐在特定的条件下也会转变成亚硝胺,所以在泡菜腌制过程中,要注意控制腌制的时间、温度和食盐的用量。 (2)培养基只能以亚硝胺作为唯一氮源,经高压蒸汽灭菌后用于富集亚硝胺降解菌。(3)亚硝胺菌株的降解效率,可根据反应物的剩余量(即亚硝胺的剩余量)来判断,设置空白对照的目的是排除亚硝胺自然降解对实验结果的影响,以保证本实验的结果是由菌株引起的。(4)3种亚硝胺降解

11、高效菌株,如研究亚硝胺降解高效菌株混合使用的降解效率,可从3种亚硝胺中任取两种,有3种组合,3种亚硝胺混合1种组合,因此理论上还需要设计4组实验。答案(1)亚硝酸盐时间、温度(2)亚硝胺高压蒸汽(3)剩余量(含量)排除亚硝胺自然降解对实验结果的影响,以保证本实验的结果是由菌株引起的(4)4微生物计数的方法专项归纳1.间接计数法(也叫活菌计数法)常用的是稀释涂布平板法。(1)原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少个活菌。(2)操作:设置重复组,增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释

12、,选择三个稀释度的菌液,分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上,然后用无菌涂布器将菌液涂布于整个平板表面,放在适宜的温度下培养,计算菌落数。为使结果接近真实值,可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上,经涂布、培养,计算出菌落平均数。为了保证结果准确,一般选择菌落数为30300个的平板进行计数,若设置的重复组中结果相差太远,意味着操作有误,需重新实验。计算公式:每克样品中的细菌数(C/V)M,其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。提醒此种方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时,平板上

13、观察到的只是一个菌落。2.显微镜直接计数法(1)原理:利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。(2)方法:用计数板计数。(3)缺点:不能区分死菌与活菌。(4)操作:将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片,再将稀释的样品滴在计数板上,稍等片刻,待细菌全部沉降到计数室底部再在显微镜下统计45个中格中的细菌数,并求出每个小格所含细菌的平均数,再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。点悟:(1)计数板是一块特制的载玻片,上面有一个特定面积(1 mm2)和高(0.1 mm)的计数室,在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格,每个中格进一步划分成16个(或25个)

14、小格,但计数室都是由400个小格组成的。(2)计算公式:每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000稀释倍数。 3.滤膜法以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例,将已知体积的水过滤后,将滤膜放于伊红美蓝培养基上培养,在该培养基上,大肠杆菌的菌落呈现黑色,可根据培养基上黑色菌落的数目,计算出水样中大肠杆菌的数量。【例证】 (2014全国卷,39)为了调查某河流的水质状况,某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量,并进行了细菌分离等工作。回答下列问题:(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前,随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间,这样做的目的是_；然后,将1 mL水

15、样稀释100倍,在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后,3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌,操作时,接种环通过灭菌。在第二次及以后的划线时,总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是_。(3)示意图A和B中,表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀,一部分进行静置培养,另一部分进行振荡培养。结果发现:振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是:振荡培养能提高培养液中的含量,同时可使菌体与培养液充分接触,提高的利用率。解析(

16、1)在涂布接种前,随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间,检测培养基平板灭菌是否合格；每升水样中的活菌数为:(393837)/338,再除以0.1乘以100,得到1毫升中的菌数,再乘以1000就是1升中的菌数,故为3.8107。(2)用平板划线法应先将接种环灼烧灭菌再划线。第二次及以后的划线时,总是从上一次划线的末端开始划线,达到稀释的目的,使得最后能够得到单个菌落。(3)根据图示可知,B为稀释涂布平板法接种后培养得到的菌落。(4)振荡的作用相当于搅拌,可以提高培养液中溶解氧的含量,还可以使菌体与培养液充分接触,提高了营养物质的利用率,因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。答案(1

17、)检测培养基平板灭菌是否合格3.8107(2)灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落(3)B(4)溶解氧营养物质1.(2019河北衡水中学模拟)“贵州茅台”被誉为我国的国酒,虽然工艺并不复杂,但是大家公认其独特品质的关键是当地的独特气候、水质、以及当地空气或环境中存在独特的微生物。为了提取当地环境中的独特菌种,某研究小组以优质高粱、上等小麦为原料,制作培养基,搜集、分离空气中的微生物。回答下列问题:(1)该培养基按成分分类,属于(“天然”或“合成”)培养基,培养基在接种微生物前,必须先进行灭菌。(2)将上述培养基暴露在空气中培养一段时间后,取10 g该培养基用无菌水制成100 mL样品溶液,

18、再将样品溶液稀释104倍后,各取样品溶液0.1 mL在5个细菌培养基平板上接种,培养一段时间后,平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是,每克培养基样品中的细菌数量为个；与血细胞计数板相比,此计数方法测得的细菌数目较实际值,原因是_。(3)生产酒的主要微生物是酵母菌,其代谢类型是,其产物乙醇与试剂反应呈现灰绿色,这一反应可用于乙醇的检验。解析(1)题述培养基是由优质高粱、上等小麦等化学成分不明确的天然物质配制而成的,属于天然培养基。培养基在接种微生物前,必须先进行高压蒸汽灭菌。(2)根据题意可知,题中所述的过程采取的接种方法是稀释涂布平板法；为了

19、计数结果准确,统计的菌落数应介于30300之间,故应选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数。稀释涂布平板法计数微生物的计算公式:单位样品中的菌落数(CV)M,其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数为(156178191)3175,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积为0.1 mL,M代表稀释倍数104,所以每克该培养基样品中的菌落数为1750.1104100101.75108；在用稀释涂布平板法计数时,由于死菌不能形成菌落,且两个或多个菌体连在一起时形成一个菌落,所以与血细胞计数板相比,此计数方法测得的细菌数目较实际值低。(3)酵母菌的代谢类型是异养兼性厌氧型；乙醇可与(酸性)重

20、铬酸钾试剂反应呈现灰绿色,这一反应可用于乙醇的检验。答案(1)天然高压蒸汽(2)稀释涂布平板法1.75108低死菌不能形成菌落；两个或多个菌体连在一起时形成一个菌落(3)异养兼性厌氧型(酸性)重铬酸钾2.某研究小组的同学用所学的微生物的实验室培养的方法进行“变质牛奶中金黄色葡萄球菌的分离和计数实验”,部分实验处理和结果如图所示。(注:培养皿旁的数字代表菌落数目；实验条件适宜；实验操作规范等)请回答相关问题。(1)在实验室培养微生物,一方面需要为培养的微生物提供合适的和条件；另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。(2)据图,研究小组采用的是法分离和计数金黄色葡萄球菌。由样品到4号试管的操

21、作中,第一步,将分别盛有9 mL生理盐水的4支试管,并编号14号；第二步,用移液管从样品中吸取1 mL牛奶,注入1号试管中,充分摇匀；第三步,重复第二步骤操作,以此类推。4号试管的稀释倍数是。(3)资料显示,金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性,可在10%15% NaCl肉汤中生长。本实验可配制含10%氯化钠的培养基,使之成为培养基,以利于金黄色葡萄球菌生长,抑制或阻止其他微生物的生长。(4)在统计菌落数目时,需按照菌落计数的要求计数,以保证计数结果准确。据图可得出1 mL牛奶样品中金黄色葡萄球菌的活菌数为。答案(1)营养环境(2)稀释涂布平板灭菌104(3)选择(4)3.6105(时间:20分钟)1

22、.(2018全国卷,37)生物选修1:生物技术实践回答下列与酵母菌有关的问题:(1)分离培养酵母菌通常使用(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基,该培养基应采用灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上,培养一段时间后可观察到菌落,菌落的含义是_。(2)酵母菌液体培养时,若通入氧气,可促进(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养,可促进(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。(3)制作面包时,为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌,酵母菌引起面包松软的原因是_。解析(1)酵母菌为异养型生物,通常使用麦芽汁琼脂培养基培养；培养基常用高压蒸汽灭菌法

23、灭菌；由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称为菌落。(2)酵母菌为兼性厌氧型生物,有氧条件利于其繁殖,无氧条件下其进行酒精发酵。(3)酵母菌分解葡萄糖可产生二氧化碳,使面包松软多孔。答案(1)麦芽汁琼脂高压蒸汽由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体(2)菌体快速增殖乙醇产生(3)酵母菌分解葡萄糖会产生CO2,CO2使面包松软2.(2019河南中原名校联考)多氯联苯(PCB)是一种对人体有害的有机物,某科技小组欲从受PCB污染的土壤中分离出能分解PCB的细菌。请回下列问题:(1)要从受PCB污染的土壤中分离出能分解PCB的细菌,应配制以作为唯一的碳源的选择培养基；配制培养基时用到的玻璃器皿

24、需用进行灭菌。(2)分离前可通过选择培养增加土壤中PCB分解菌的浓度,选择培养时需要不断震荡锥形瓶的目的是_。(3)用稀释涂布平板法统计PCB分解菌的浓度时,常需同时培养空白培养基, 其目的是。若实验中发现空白培养基上生长有3个菌落,为准确测定样液中PCB分解菌的浓度,则需要。(4)在纯化土壤中的PCB分解菌时,发现培养基上的菌落连成一片,最可能的原因是_,应当怎样操作才可避免此种现象？_。答案(1)多氯联苯(PCB)干热灭菌法(2)让PCB分解菌充分利用营养物质(3)检测所用培养基灭菌是否彻底重新配制培养基进行实验(4)菌液浓度过高对菌液进行梯度稀释(加大稀释倍数)3.环境污染物多氯联苯难以

25、降解,受到多氯联苯污染的土壤中,总有重金属污染同时存在。研究发现联苯降解菌内的某些酶是催化多氯联苯降解的关键酶。为了从富含多氯联苯的环境中分离联苯降解菌,某同学设计了甲、乙两种培养基(成分如表所示):维生素NH4NO3MgCl2多氯联苯水琼脂培养基甲培养基乙注:“”表示添加该物质,“”表示没有添加该物质。(1)培养基甲中的多氯联苯作为,用于培养联苯降解菌,该培养基中加入琼脂的目的是_。(2)取培养基乙中的培养液1 mL转接到9 mL培养基乙中,如此重复多次。多次转接后,取稀释液用如图所示的方法接种在培养基甲上。关于图示接种方法的叙述,正确的是(多选)。A.酒精灯提供了局部无菌环境 B.接种后的平板需倒置培养C.该接种方法能得到单个