蛋白质农药产业化研究进展Word格式.doc

1、2004年， Messenger经我国农业部农药检定所（ICAMA）审定，取得了农药临时登记证，推荐在番茄、辣椒、烟草和油菜上使用。 蛋白激发子是基于诱导增强植物抗病性、抗逆性而研制的新型生物农药，与一般概念上的生物农药不同，其本身对病原物无直接杀死作用。根据激发子来源和性质的不同，主要分为3类，其主要特征见表l。1 过敏蛋白（Harpin） 过敏蛋白是一种能够使植物发生过敏反应的一类蛋白质的总称，这类蛋白质来源于植物病原微生物。Wei等首次发现梨火疫病菌（Erwinia omyZ ouora）的hrpN基因编码的一种新蛋白质能诱导植物产生过敏反应，并将其命名为Harpin。并首次提出Harp

2、in激发植物过敏反应（Hypersensitive response，HR）与抗病性的关系，提出了过敏蛋白具有诱导植物抗病功能LIj。Harpin蛋白并不直接作用于靶标作物，而是刺激作物产生自然的免疫机制，使植物能抵抗一系列的细菌、真菌和病毒的侵染。其作用机理是与植物表面的特殊受体结合，产生植物防御信号，激发植物产生多种防卫反应。 Harpin能诱导多种植物产生HR，Harpin蛋白既能诱导非寄主植物产生过敏反应，其本身又是寄主的一种致病因子。 2001年，美国Comell大学和EDEN生物科技公司基于过敏蛋白的研究，共同开发和研制成功了具有抗病防虫功能的广谱无公害微生物蛋白农药 Messen

3、ger。该产品是2001年生物农药中最具代表性的新产品之一，也是当前国际上利用高技术手段开发生物农药最成功的例子。对多种病虫害防治效果达5080，增产效果1020。这类农药功能广泛，作用机制独特，对环境友好，荣获2001年度美国环境保护委员会颁发的“总统绿色化学挑战奖”。 赵立平博士等也研究证实了细菌蛋白质具有提高植物抗病虫和促进植物增产的功能，并进行了Harpin结构与功能关系、Harpin固氮工程菌的构建、产Harpin的团成泛菌工程菌构建等方面的研究。李汝刚，范云六等人进行了Harpin蛋白基因的克隆及序列分析以及转基因马铃薯降低晚疫病斑生长率方面的研究。 自1986年首次报道hrp基因

4、以来，人们对植物病原细菌hrp基因的分布、结构、功能等进行了大量研究。已相继从多种植物病原细菌中克隆到 hrp基因，目前，从各类病原菌中寻找产生Harpin的hrp基因、研究Harpin诱导防卫功能及其机制已成为分子植物病理学的一个研究热点。 南京农业大学王金生教授实验室进行了水稻黄单胞菌（Xanthomonas oxyzae pvoryzae）harpin基因的克隆与表达；测定了hrp基因簇全序列，发现其中含有23个hrp调节基因和hrp基因簇（24个基因）；并从水稻黄单胞菌和水稻中克隆分离了lO余种抗病激活蛋白编码基因，从水稻黄单胞条斑病菌（Xanthomonas oryzicola pv

5、oryzieola）的型泌出系统突变体M51中分离、纯化到激发烟草过敏性反应的蛋白。水稻条斑病细菌hrp基因簇中 Ap。基因编码诱导表达产物Harpin、刪蛋白可在烟草上激发产生过敏反应。用Harpinxooc蛋白处理烟草，经RT-PCR检测发现，与烟草抗病信号途径相关的基因PR-la、hinl和hsr203J被激活转录表达；处理水稻后NPRl、OsPRla、OsPRlb和PAL被激活转录表达，表明Harpin x00c蛋白与植物互作后通过水杨酸信号传导途径激活病程相关蛋白等防卫反应基因的转录表达，从而使植物产生系统获得抗病性。Harpin x00c加工后制成的1可溶性微颗粒制剂可诱导水稻产生

6、抗病性，防治稻瘟病效果与稻瘟必克（三环唑）相当，防治水稻纹枯病、稻曲病效果与井冈霉素相当，对水稻增产的效果主要表现在增加粒重，增产达6以上。2 隐地蛋白（Elicitin） 隐地蛋白是由隐地疫霉分泌的蛋白类激发子，自1977年观察到Phytophthora cryptogea的菌体提取物和培养滤液能引起烟草叶片坏死性反应以来，从只cryptogea，P）cinnamomi和Pcapsici中已纯化了分子量约10 kD的多种蛋白类激发子，Huet等（1989）将这类活性蛋白命名为Elicitin。研究证明： Elicitin是通过水杨酸介导抗病信号途径，激发植物获得对真菌、细菌等病原物的系统抗性

7、（systemic acquired resistance，SAR），同时产生活性氧自由基、脂过氧化物、植保素、PR蛋白等防御反应相关物质。迄今已发现17种疫霉菌中存在Elicitin活性蛋白，根据等电点和对烟草的激活反应可分为ct-elieitin（酸性）和Belieitin（碱性）2类，2种类型蛋白的氨基酸序列同源性达到60以上。近年来，从一些腐霉菌中也发现有Elicitin类似活性蛋白存在，并能高效激发番茄的系统获得性抗性”。3 激活蛋白（Activator） 激活蛋白是从葡萄孢菌（Botrytis）、交链孢菌（Alternaria）、黄曲霉菌（Asporgillus）、稻瘟菌（Pyrc

8、u1aria）、青霉菌（Penicillium）、纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、木霉菌（Trichoderma）、镰刀菌（Fusarium）等多种真菌中筛选、分离、纯化出的一类新型蛋白质，相关核心技术已获得1项发明专利，公开2项专利。研究已证明，从交链孢菌和稻瘟菌分离的激活蛋白的氨基酸和核酸序列均不同于过敏蛋白和隐地蛋白，是一类新型的蛋白激发子。通过酵母双杂交技术，研究了激活蛋白与植物的作用关系，初步认为激活蛋白可能通过与植物表面受体的互作，诱导植物的信号传导，引起植物体内一系列代谢反应，诱导和激活植物自身免疫系统和生长系统，从而对病虫害产生抗性，促进植物生长，提高作物产量

9、。研究获得的激活蛋白初试产品性能稳定，便于规模化生产，产品无毒，无残留，可用于植物的拌种、浸种、浇根和叶面喷施。经多种植物的室内盆栽和田间试验表明，对病虫害的防治效果为4080，提高作物产量1020。3l 激活蛋白的基因克隆在国家973”和“863”项目的资助下，进行了激活蛋白的分离纯化、基因克隆、激活蛋白与植物互作机理、蛋白质结构分析与分子药物设计、生物药物的发酵工艺及制剂技术。已完成了交链孢菌和稻瘟菌激活蛋白的分离、纯化，制备了激活蛋白多克隆抗体，利用抗体对激活蛋白产生菌的基因文库进行了筛选，获得了激活蛋白基因并进行了基因的原核和毕赤酵母转化体系的构建和表达研究，其中具有激发子功能的稻瘟菌

10、激活蛋白基因工程菌株申报了发明专利。32 激活蛋白作用机理 研究表明，植物激活蛋白能显著提高植物抗病相关酶活性和生长相关物质的积累，激活蛋白处理水稻后5h苯丙氨酸解氨酶（PAL）和几丁质酶活力提高50以上，处理黄瓜种子后90 min可检测到大量脯氨酸的积累。 水稻基因芯片结果表明，激活蛋白可引起800个基因的表达变化，其中有104个上调基因和256个下调基因，上调基因与光合作用、生长发育、免疫反应、信号转导和翻译转录相关，其分子功能主要涉及催化活性，蛋白、核酸及脂肪结合活性，运输、电子传递和信号转换，水解酶活性等。上调基因所参与的生物过程涉及对生物、非生物、外在及内在刺激的应激反应，转录、代谢

11、、生物合成生长发育和光合作用等生物过程。上调基因的细胞定位有细胞壁、细胞膜、质膜、细胞核、核膜，叶绿体、类囊体、内质网和质体。用定量PCR方法验证了水稻基因芯片部分基因的表达量变化，再次说明激活蛋白能提高植物抗病相关基因表达量，引起了植物代谢系统的一系列反应，激活了抗逆相关蛋白基因的表达，因此表现出抗病和促生长作用。33 激活蛋白应用研究 试验表明，激活蛋白能诱导多种作物产生抗病性，同时能促进植物生长，显著提高产量、改善产品品质。连续在湖南、浙江、辽宁用于烟草、草莓、白菜、辣椒、蚕豆、棉花和水稻等作物，对辣椒、白菜和水稻增产效果达到102652；对烟草花叶病、豌豆赤斑病和草莓蛇眼的控制效果达6

12、589。植物激活蛋白尤其对植物花叶病表现更好的控制效果，能显著诱导烟草抑制花叶病的发生和发展，对枯斑抑制率达7018；小区处理后7 d的诱抗效果达4849537。2004-2005年连续在湖南烟草基地的试验证明，3植物激活蛋白粉剂大田施药后20d和45d后的诱抗效果达7287734，效果优于和相当于目前广泛使用的化学抗病毒剂，与菌克毒克效果相当，高于抑毒星，表现出良好的应用推广前景。此外，植物激活蛋白能明显促进烟草生长，表现为株高，留叶数和叶面积增加，其中株高增长742，中上部叶面积分别增加1035和148；激活蛋白对烟叶品质有较明显的影响，其中可溶性糖、还原性糖、蛋白质含量以及施木克值比对照

13、高，其化学物质含量符合优质烤烟质量指标，对改善烤烟品质有明显作用。 植物激活蛋白对多种作物具有改善品质的效果，如草莓大果率提高，果面光亮并且耐贮存；柑桔果型好，果面光滑；大白菜的株高、叶长、叶宽增加，提高白菜叶片中粗蛋白、可溶性糖和维生素C含量，其中080zL植物激活蛋白维生素C提高了214。4 其他相关蛋白 张正光等从引起棉花烂铃的棉疫病菌（Phytophthora boehmeriae）培养滤液中纯化到一种特异的90 kD蛋白激发子，研究了该蛋白激发子诱导烟草过敏反应过程中细胞死亡和防卫反应酶系活性变化以及对病程相关蛋白PR5的诱导作用。研究表明：以10 nmolL激发子溶液注射处理W38

14、烟草叶片，HR枯斑周围5 mm组织在UV光下呈现蓝色荧光，对处理部位进行Evans blue染色，结果发现20 h处理部位细胞全部死亡；激发子可诱导烟草防卫反应中苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性提高；可快速诱导PR5基因的转录。上述结果表明90 kD蛋白激发子可诱发烟草的细胞死亡、苯丙烷代谢和PR基因的表达等多条信号途径。2001年，Veit等在腐霉（Pythium aphanidermatum）细胞壁中分离到一种新的蛋白类激发子，能诱导双子叶植物产生多种防卫反应，但对单子叶植物无活性，该蛋白是许多微生物如卵菌、细菌、真菌等细胞壁的共有成分”。5 激活蛋白制剂研究及产业前景 针对激活蛋白特性，采

15、用了蛋白质保护剂和蛋白质稳定剂，较好地解决了天然蛋白在田间应用所遇到的实际问题。研制的3激活蛋白可湿性粉剂真空包装后在室温下可稳定保存2年以上，2003年已申报该制剂的国家发明专利。毒性毒理测定表明，植物激活蛋白制剂对人畜低毒，符合农药临时登记要求，正在进行农药临时登记，2005年获得了农业部农药药检所颁发的农药田间试验许可证书。 随着可持续农业的不断发展以及化学农药抗性和污染问题的日益严重，生物农药越来越受到重视，并成为综合防治的主要部分。激活蛋白农药是基于诱导增强植物抗病性、抗逆性而研制的新型蛋白质农药，产品安全无毒，不会引起植物的抗性，对植物有显著抗病增产作用，同时能提高作物的品质，生产

16、上可以减少或不使用化学农药，生产的产品可以达到绿色产品和有机食品的要求，特别是在有机蔬菜和果品生产中将发挥重要的作用，符合当前我国农业产业结构调整，有利于提高农产品附加值，增加农民收入，具有非常广阔的市场前景和良好的市场竞争能力，具有较好的综合效益。 目前生物农药的研发已经在原有微生物制剂开发的基础上，向新功能、分子设计或重组生物农药方向发展。微生物蛋白质农药属于植物免疫调控剂，能最大限度地诱导植物自身抗逆性，提高产量，是从根本上解决植保问题的重要途径。通过激活蛋白结构与功能研究的不断深入，利用分子设计创制新功能、安全高效的蛋白药物是今后研究的主要方向之一。随着全球食品安全生产的日益重视，蛋白激发子生物农药将成为21世纪农业可持续发展的重要内容，具有十分广阔的应用前景。中国农业枓技导报，2006，8（6）邱德文， 杨秀芬（中国农业科学院植物保护研究所，北京100081）