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1、因此就需要有新的方法来迅速测定基因的功能和鉴定新基因。瞬时表达分析不适合复杂的生物体研究，但是植物原生质体瞬时表达分析在研究广泛的分子机制，包括信号传导和新陈代谢通道，以及转录的网络调控是很有用的。,何为瞬时表达（Transient expression）,瞬时表达：外源基因进入受体细胞后，未整合进受体细胞基因组而立即转录，出现基因产物。是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位及基因间互作的一种重要手段，与传统的转基因相比，瞬时表达不需要整合到染色体上，因此具有简单、快速、周期短、准确等优点。瞬时表达不受基因的位置效应和基因沉默的影响，表达效率较稳定，转化率高。同时，瞬时表达不产生可遗传的子

2、代，生物安全性高。,本文要点,实验用的载体选择方法原生质体PEG自动化转染双荧光素酶转录读出标准化分析原生质体转化效率分析尼古丁生物合成途径中潜在调控因子筛选NtORC1 和NtJAP1 转入BY-2 影响分析,设计自动化瞬时表达系统,根据已发表的瞬时表达步骤（http:/genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb），设计了自动化的瞬时表达操作系统。该系统在TECAN Genesis 200机械化平台上进行 操作。（为本文章所独创的）。该系统的好处如下：1、降低了实验规模和容器的需求量。2、与传统的原生质体富集相比，该系统采用简单的微滴定沉淀法。3、自动化移液，精确简单

3、。4、周期短，小于2天，严格的无菌环境。,自动化操作平台,自动化操作系统,载体质粒对比分析,在任何实验方案中，能够准确又简单的克隆出所有必需的DNA片段是很重要的，目的是为了对大型基因组进行系统的功能分析本文设计将绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶，分别连接大的双向T-DNA质粒和最小的骨架质粒，转入拟南芥和烟草BY-2原生质体进行瞬时表达。结果表明最小质粒的表达效率高。确定实验用的载体质粒为大肠杆菌最小质粒,比对结果,双荧光素酶转录读出分析标准化,瞬时表达分析最终结果受到很多内在因素的影响，比如原生质体的异质性，移液误差和DNA的含量等。为了对瞬时表达分析进行标准化，参考了生物统计原理，本文通过萤

4、火虫荧光素酶（fLUC）和海肾荧光素酶（rLUC），分别连接上35S CaMV promoter，形成35Spro:fLUC:35Ster 和35Spro:rLUC:35Ster，做共瞬时瞬时表达分析，共测定了八组48个样品在42分钟内的酶活性变化。,酶活测定结果,分析,上图显示，尽管fLUC和rLUC的酶活数目不同，但是有相同的趋势，他们的关联系数R=0.932。HEAT map 显示相同的样品之间fLUC酶活性就存在很大的差异。他们之间的平均标准误为6.9%，但是根据统计学关联差异度，如果以rLUC的酶活数目为内部调控做标准化，这种标准误就降低到了2.6%。这就说明，在瞬时表达分析时，加入

5、内部调控报告基因，能够大大降低误差。,转化效率研究,分别以拟南芥PSB-L细胞原生质体和烟草BY-2细胞原生质体为转录体，用10 g带有35Spro:eGFP:35Ster最小载体DNA做瞬时表达分析，20h后，荧光蛋白量达到30%。如果想提高含量，需要长时间的孵育。fLUC需要超过一天。,质粒DNA的用量标准验证,因为质粒DNA的总量是瞬时表达实验的一个限制因子。设计了带有35Spro:35Ster的最小质粒，转染拟南芥和烟草BY-2.来测定0.510 g之间，rLUC的活性。BY-2显示的是一个对数关系曲线（R2=0.9943;n=8），拟南芥显示的是一个指数关系（R2=0.9941;n=

6、4）。根据瞬时表达的要求原生质体数目为104 到105 原生质体数，选择了BY-2的使用量为1g。,图示（R平方为相似度）,烟草茉莉酸信号途径研究,技术路线 一、茉莉酸处理结果分析 二、发生改变的基因分类 三、确定基因研究参考指标 四、实验验证参考指标 五、筛选可能的诱导基因 六、过表达研究获得的基因,何为BY-2细胞,烟草BY2细胞（Nicotiana tabacum Lev Bright Yellow2。BY2）是一个非常重要且用途广泛的细胞系。它由Kato等于1972分离得到在现有已建立的成熟植物细胞系中被认为是植物细胞中的Hela细胞。BY2细胞可以比较容易的转化外源基因，且转基因细胞

7、团和悬浮培养细胞都较易得到。此外，该细胞系具有高度的同一性，并且生长迅速，经阿非迪霉素（aphidicholin）处理后，可以获得具有高度同周期性的细胞1周内可以增加80100倍。因此BY2细胞已经成为研究细胞周期的模式系统，这使得该细胞系成为分子生物学和细胞生物学研究的良好材料。,尼古丁生物合成调控功能因子的筛选,1、查阅文献，了解相关研究后，通过代谢物分析和cDNA-AFLP技术，研究茉莉酸甲酯处理烟草BY-2细胞后基因的变化情况。结果是：茉莉酸甲酯处理几个小时，细胞新陈代谢系统完全改变，许多生物碱，尼古丁，新烟碱，新烟草碱迅速积累，许多基因的表达模式改变，多数为上调。,何为cDNA-AF

8、LP,cDNA-AFLP技术结合了RT-PCR和AFLP技术，其基本原理：以纯化的mRNA为模板，反转录合成cDNA。用识别序列分别为6-bp和4-bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切片段与人工接头连接后，利用与接头序列互补的引物进行预扩增和选择性扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示 常用的分析差异表达基因的方法，准确反映基因间表达量的差别。,对改变的基因分类,茉莉酸甲酯（MeJa）处理后的基因改变有两种可能，一种是受MeJa诱导后基因表达改变，但是不影响生物碱的合成，另外一种就是基因改变引起了生物碱的积累。为了基因分类，选取了两种蛋白启动子的表达量作为标准，对预测基因进行实验研究

9、。PMT（腐胺-N-甲基转移酶）和PAL（L-苯丙酸氨基水解酶）,Why chose these two proteins as the standard?,PMT 在尼古丁生物合成的第一步，是一个关键的催化作用酶。他的含量决定的尼古丁合成的强度。PAL是酚类复合物合成的核心酶，他的含量决定尼古丁的含量。,初步验证两个参考标准,分别克隆PMT 和PAL的上游和ORF，在他们的下游连接上报告基因fLUC，构建表达载体GCS:35Ster。验证原生质体是否像细胞一样受MeJa诱导。分别将两种两种载体转化烟草BY-2原生质体做瞬时表达分析，八个重复的平均 MeJa诱导前后的结果如下：,选择可能的诱导

10、基因,通过cDNA-AFLP 标记研究6h MeJa诱导后编码蛋白但功能未知的基因，挑选已经有预测的可能参与转录过程的基因。共得到17条。如下图通过菌落杂交筛选BY-2细胞cDNA文库或RACE-PCR获得了17个基因的ORF。全部替代克隆进同一种载体p2GW7（值得注意，这样做是为了进一步做研究相似功能的基因协同性准备）,获得的基因,一次筛选及结果,每组做四个重复，实验均有一个内参。即是PMTpro:35Ster+一个基因（35Spro:GCS:35Ster）+35Spro:35Ster或者PALpro:共转染。用GUS作对照。第一天是转染，第二天进行细胞溶解和荧光素酶分析。最终发现NtOR

11、C1 和NtJAP1 和MC307导致PMT启动子的活性增加，但是不影响PAL启动子活性。,结果图,二次筛选,通过超过十次的二次转染，统计数据与GUS 比较，分析结果表明，NtORC1 和NtJAP1 分别是对照的2.9-10.3倍和1.4-2.9倍。而MC307则未被证实。如下图（P值为差异值）,协同效应研究,通过共转染，研究了新发现的两个转录调控因子NtORC1 和NtJAP1 的协同效应。结果如下图,过表达转染BY-2细胞,将两个新发现的基因克隆进过表达载体，后导入农杆菌，侵染受过MeJa诱导过转基因BY-2细胞系。作为对照，只带有新霉素磷酸转移酶标记基因的载体pDE1001和经过瞬时表

12、达分析验证过，不影响PMT活性的基因T172 ORF的载体。结果显示，NtORC1 和NtJAP1 的过表达会导致转基因组织的过早褐化。,结果图,原因分析,1、活化的植物防御响应在转基因植物中的适应性已经显示降低了。2、这项观察可用生物碱（或其他次生代谢分子）的积累来解释，生物碱的积累对多数细胞类型是有毒性的，包括产生它们的烟草细胞（Goossens et al.,2003a）。尽管NtORC1和NtJAP1过表达不会导致强烈的生长抑制，可是它会导致增强对胁迫的敏感性通过大片胼胝体变成褐色来显示出来。,如何构建载体,1、利用PCR技术扩增目的基因2、利用Gateway技术创建入门克隆载体3、进

13、一步构建表达载体,Gateway技术,总结与讨论,1、基因组学研究方法在某种程度上依赖于克隆序列技能的有效性。并且，开发这些技能的障碍在于创造上千的转基因个体非常困难，实验设计了自动化的瞬时表达分析过程，提高了实验的精确性和效率。对研究信号或生化途径中的特异片段是至关重要的。2、利用Gateway技术创建入门克隆载体，这种载体为相关的实验研究提供了足够的质粒。并且验证了载体的大小和使用量。3、通过设置内部调控基因，对TEAs进行了标准化分析，进一步提高了实验的准确性。,4、利用自动化的TEAs,成功的破解了烟草尼古丁生物合成的激活通道，发现了两个转录调控因子，NtORC1 和NtJAP1。序列分析表明两者都属于AP-2家族，含有ORCA转录因子来调节长春花中萜类吲哚生物碱的合成。,个人心得,通过本文献的学习，基本了解了瞬时表达应用于基因功能筛选的原理及思路设计流程。懂得了一个良好的实验需要缜密的实验设计和充分的实验验证。,请老师，同学指点谢谢,