细胞生物学实验复习.doc

1、实验一、细胞膜的渗透性1. 细胞膜具有对物质选择透过的生理功能。脂溶性越高通透性越大，水溶性越高通透性越小；非极性分子比极性容易透过，小分子比大分子容易透过。水分子可通过由膜脂运动而产生的间隙。非极性的小分子如O2、CO2、N2可以很快透过脂双层，不带电荷的极性小分子，如尿素、甘油等也可以透过人工脂双层，尽管速度较慢，分子量略大一点的葡萄糖、蔗糖则很难透过，而膜对带电荷的物质如：H+、Na+、K+、Cl、HCO3 是高度不通透的。2.hemolysis（溶血现象）：渗入红细胞的溶质能提高红细胞的渗透压，使水进入细胞，引起细胞吸水胀破；即红细胞膜破裂，血红蛋白从红细胞中逸出的现象称为溶血现象。3

2、.isotonic solution（等渗溶液）：渗透压与血浆渗透压相等的溶液称为等渗溶液。4.Hypertonic solution（高渗溶液）：渗透压高于血浆渗透压的溶液称为高渗液。5.Hypotonic solution（低渗溶液）：渗透压低于血浆渗透压的溶液称为低渗溶液。6.semipermeable（半透性）：膜或膜状结构只允许溶剂(通常是水)或部分溶质(一般为小分子物质)透过，而不允许其他溶质(一般为大分子物质)透过的特性。 7.osmosis（渗透作用）：膜两侧溶液浓度存在差异，造成化学势能差，在势能差的驱动下，溶剂穿过对溶质不透膜的过程。一、 实验材料及作用：150 mmol/

3、L NaCl , 蒸馏水，5 mmol/L NaCl，65 mmol/L NaCl，0.8 mol/L甲醇，0.8 mol/L乙醇，0.8 mol/L丙醇，0.8 mol/L乙二醇，0.8 mol/L丙三醇，2%Triton X-100，氯仿(三氯甲烷)。1.NaCl的作用：将正常红细胞悬浮于不同浓度的NaCI溶液中：等渗溶液中的红细胞保持正常大小和双凹圆碟形；渗透压递减的一系列溶液中，红细胞逐步胀大并双侧凸起，当体积增加30%时成为球形；体积增加45%60%则细胞膜损伤而发生溶血，这时血红蛋白逸出细胞外，仅留下一个双凹圆碟形细胞膜空壳，称为血影细胞（ghost cell）。正常人的红细胞一般

4、在0.42%NaCI溶液中时开始出 现溶血,在0.35%NaCI溶液中时完全溶血. 2.甲醇：小分子、亲脂性的非极性分子甲醇为低渗溶液，容易溶解于脂双层，并迅速透过，提高红细胞的渗透压，促使水分进入细胞，引起溶血。3. 乙醇：乙醇是脂溶性小分子，可以自由扩散进出细胞。红细胞外有相对高浓度的乙醇，大量乙醇分子顺浓度差进入红细胞，使红细胞内渗透压高于红细胞外渗透压，水通道开放，大量水分子进入红细胞，发生溶血。4. 丙醇，丙二醇，丙三醇的作用与甲醇，乙醇的作用相似，都是脂溶性分子，随着分子量的增加，分子的增大，溶血时间增加。5. 去垢剂是一些具有亲水的极性基团和疏水的非极性基团的长链分子。非离子型去

5、垢剂如TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)可与脂双层形成混合微团，它们主要与蛋白质疏水部位相互作用，一般不会引起蛋白质变性。而离子型去垢剂与蛋白结合后可改变蛋白质结构，使之变性，尤其是加热后可使蛋白质解离为单体，如十二烷基磺酸钠（SDS）等。多种去污剂可以溶解细胞膜上的磷脂化合物，从而使细胞膜破裂，释放出细胞内物质。6.氯仿：氯仿是很好的脂类萃取剂，不能够发生溶血现象。实验二、植物细胞的胞吞作用和内膜系统的荧光显微观察分析及抑制恢复： 叠氮化钠可抑制呼吸作用，从而阻断能量供应，但是没有发生溶血抑制，说明水孔蛋白不需要提供能量。 水通道蛋白对水的通透性受氯化汞的可逆性抑制,对汞的敏感位点

6、是结构域5与6之间的189位的半胱氨酸。氯化汞到达一定的浓度时就可以抑制水的通透性，从而抑制溶血现象的产生。水通道蛋白对氯化汞的敏感位点是结构域5与6之间的189位的半胱氨酸。半胱氨酸含有巯基，而-巯基乙醇能消除氯化汞对水孔蛋白的抑制作用。因为-巯基乙醇可以修复被氯化汞破坏的巯基，从而是水顺利通过。1、细胞伸长生长所需要的物质分别在内质网(如蛋白质、脂类)和高尔基体(细胞壁的一些组分，如果胶、半纤维素)合成，运输小泡通过胞吐作用分泌至胞外或质膜上，促进新的细胞膜和细胞壁的生长。2、在细胞扩展增长过程中一些过剩的蛋白质、多糖、细胞壁前体物质等细胞成分，需要通过胞吞作用重新回到胞质中使之得以及时回

7、收，循环利用，即细胞的内吞和外排两个过程保持基本的相对平衡。3、在整个膜泡吞排作用中，必须有能量的保证。4、内膜系统是指内质网、高尔基体、囊泡、溶酶体和液泡等细胞器和质膜。这些细胞器的膜是相互流动的, 处于动态平衡, 在功能上也是相互协同的。一、 实验材料：1、 水稻悬浮细胞：非极性生长，生长速度慢。2、 FM4-64染料：是一种膜染料，水溶性的苯乙烯类复合物，对细胞无毒性作用，能与质膜及内膜细胞器特异结合后发出高强度的荧光。FM4-64由一条亲脂的尾部和一个带正电荷的头部经双键相连而成的，亲脂尾部可以插入脂双层的外叶中，而头部则阻止其进一步穿越脂双层，需要借助胞吞作用才能进入细胞内。FM4-

8、64在水相中没有荧光，只有插入脂质生物膜后才显示较强的荧光，胞吞回收的囊泡因吞进细胞内部而被荧光标记，利用这种荧光探针能够对细胞的胞吞过程进行有效标记。3、 叠氮化钠：抑制细胞的内吞作用。它能够抑制细胞色素氧化酶和其他酶活性，由于细胞的内吞作用是一个耗能的过程，所以叠氮化钠能够通过切断能量供应来抑制内吞作用。4、 ER-Tracker Blue-White：是Dapoxyl 染料中的一种，它的主要成分是格列本脲，是一种糖尿病患者每日降低血糖的药物。也被用于研究胰腺B-细胞活性和胰岛素分泌和研究心肌细胞功能和心律不齐。格列本脲连接到ATP-敏感 K+通道的磺脲受体，这个受体主要在ER上。能够对内

9、质网染色。5、山梨醇：为高渗溶液，能够诱发质壁分离。1）FM4-64染料可以进行什么生理过程及细胞器的标记？答：FM4-64染料可以对细胞膜系统进行荧光染色，所以凡是与膜系统相关的生理过程及细胞器都可以用FM4-64染料染色。例如：光合作用，呼吸作用，内吞外排作用，细胞的分泌作用等等 细胞器：叶绿体，线粒体，内质网，细胞膜，高尔基体等。2） 你在实验过程中看到的山梨醇预处理及叠氮化钠预处理后再染色的实验现象有何不同，为什么？答：山梨醇预处理后，可观察到质壁分离现象，并且细胞壁上没有荧光染色，从而证明染色发生在细胞膜上。但是细胞内部也有染色现象。 叠氮化钠预处理后，没有发生质壁分离，细胞膜被染色

10、，但是细胞内部几乎没有荧光染色。 这是因为山梨醇是高渗溶液，可以使细胞发生质壁分离现象，而叠氮化钠可以阻止细胞的内吞作用。二者的作用机理不同，所以实验现象也不同。实验三、原生质体的制备及基因瞬时转化与分选观察1.植物原生质体是除去细胞壁的被质膜所包围的裸露细胞。用酶解法脱去细胞壁的原生质体在合适的离体培养条件下具有繁殖、分化、再生成为完整植物的能力。利用原生质体可开展因细胞壁存在而难以进行研究的问题，如质膜的表面特性，细胞壁的形成、细胞器的提取，体细胞的杂交，也适于作为基因工程的良好受体系统，通过基因转化获得转基因植物。植物原生质体是细胞水平生的一种良好的研究系统。2.质膜蛋白分选：蛋白质的分

11、选有翻译后转运和共翻译转运两种类型。质膜蛋白的分选属于后者。首先在细胞质基质合成的质膜蛋白通过跨膜转运进入内质网，在粗面内质网合成后转运至高尔基体，最终通过膜泡运输的方式分选至质膜。绿色荧光蛋白的特性：是一种能够自身催化形成发色结构，并在蓝光或紫光的激发下发出荧光的新型报告基因。3.绿色荧光蛋白GFP是一种能够自身催化形成发色结构，并在蓝光或紫光的激发下发出荧光的新型报告基因。GFP之所以能够产生绿色荧光是由于其蛋白质分子多肽链内含有特殊的生色团，即第65-67位氨基酸ser-Tyr-Gly链，他们在氧气的参与下自身环化与周围其他三个氨基酸形成六肽生色团。晶体结构分析，GFP分子为致密管状，由

12、周围11个折叠片围绕中央一个螺旋构成，其生色团即包含在该中央螺旋结构种。GFP蛋白非常稳定。其光谱性质一般不受变性溶液的影响。4.利用GFP的荧光特性对某一蛋白质的N端或C端进行标记，然后借助荧光显微镜或共聚焦显微镜便可以对标记的蛋白质进行细胞活体观察。标记过程是利用常规的DNA重组技术将GFP基因与目的蛋白基因的编码区连接形成一个单一的融合基因表达载体，然后将这一重组表达载体导入细胞，使融合蛋白得到瞬时或稳定表达，通过检测这些GFP的荧光来测定这些蛋白质的位置。一、 实验材料及作用：大肠杆菌菌液，水稻悬浮细胞原生质体，转化质粒，各种试剂1.酶解液：去除水稻细胞的细胞壁，使其成为原生质体。2.

13、Solution I：含有葡萄糖，Tris，EDTA。 其中葡萄糖可以增加粘度，防止DNA受机械作用而断裂 Tris起缓冲作用，稳定pH EDTA是鳌合金属离子，抑制DNase，防止DNA降解3.Solution II：含有SDS，NaOH（pH12.6） 其中SDS是离子型表面活性剂，去污剂 NaOH（pH12.6）：使核酸变性4.Solution III：含有KAc：（pH4.8），可中和复性，使质粒DNA复性，但染色体由于分子量大，复性所需时间长，所以在10min左右内质粒复性，为可溶状态，而染色体则为沉淀；K与SDS、蛋白质和膜形成溶解度小的复合物。5.Buffer GPS ：是OME

14、GA Bio-Tek公司研发的硅胶柱平衡缓冲液。HiBind DNA 结合柱子（硅胶柱）经Buffer GPS预处理后，可大大减少柱子中硅胶膜的疏水基团，提高核酸的结合能力。柱子在长期放置过程中，会同空气中的电荷/尘埃等发生反应而影响其核酸的结合能力。Buffer GPS对长期放置的柱子，甚至已经变坏的柱子都有着非常显著的效果，可大大提高其结合效率。6.Wash buffer: 主要成分是乙醇，用来清洗柱子。7.Elution Buffer：洗脱质粒。8.PEG solution：PEG(聚乙二醇)为高分子聚合物。细胞粘合及扰乱细胞膜磷脂双分子层作用。可使DNA与膜形成分子桥，促使相互间接触和

15、粘连。可改变细胞膜结构，是磷脂分子发生疏散，进而使其结构发生重排。最佳PH8.0-8.2之间。引起膜表面电荷紊乱，干扰细胞识别，有利于细胞膜间融合和外缘DNA进入原生质体。9.W5:洗液,洗去各种酶解液.10.Incubation buffer:孵育buffer。使细胞在更好的环境中培养。实验四 核酸(DNA and RNA)的细胞核定位观察1.Unna染色法原理：核酸是酸性的，它们对于碱性染料具有亲和力，但是DNA和 RNA对甲基绿-派洛宁混合染料的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。【实验材

16、料及作用】实验材料：洋葱鳞茎表皮细胞实验试剂：（1） Carnoy固定液：无水乙醇：冰乙酸（3：1） ：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。Carnoy固定液（甲醇冰乙酸=31）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。（2） 95%乙

17、醇和70%乙醇和H2O：浓度由高到低，缓慢使细胞复水，防止一次复水效果不好。（3） 5%的三氯乙酸（TCA）：蛋白质沉淀剂和显微样品固定剂。（4） Unna染液:DNA和 RNA对甲基绿-派洛宁混合染料的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。（5） 丙酮：分色剂。能够使强染色褪色，达到分色的目的。实验五、离心技术与细胞器的分离1.离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在受到外向的离心力后而沉淀一种分离技术。2.差速离心法 （differential velocity ce

18、ntrifugation）采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。常用于从组织匀浆中分离各种细胞器。3.等密度梯度离心(isodensity / isopycnic centrifugation）原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移动了，形成一系列密度区。从而使不同浮力密度的物质得到分离。 等密度梯度离心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介质。此法一般应用于

19、物质的大小相近，而密度差异较大时。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。 4.细胞和细胞器在连续梯度的介质中经足够大的离心力或足够长的时间沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。通过离心后的分层情况可以发现，30% percoll CSK buffer的等密度梯度层中是细胞核，60%percoll CSK buffer的等密度梯度层中是叶绿体，而且由于重力原因，叶绿体大部分存在与密度梯度层的最底端。实验六 细胞骨架的显微观察适当浓度的Triton X-100可使膜蛋白溶解下来并保持活性，胞质中可溶性成分随之流失，而细胞骨架成分在该试剂作用下能相

20、对稳定存在，保留下来。M缓冲液 和磷酸缓冲液维持适宜的细胞渗透压、离子浓度及酸碱度pH，起到缓冲调节和平衡作用；EDTA可螯合大部分金属离子；EGTA专一性螯合Ca2，主要是高浓度的Ca2可使骨架解聚，因此加入EGTA来降低Ca2的浓度 ，维持细胞骨架的聚合状态；戊二醇是良好的固定剂，对细胞内结构有活跃的亲和力，能迅速杀死细胞，并很好的保存它原有细微结构和某些酶的活性；考马斯亮蓝非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）。【实验材料及作用】 1. 洋葱内表皮细胞，人口腔上皮细胞 2.M缓冲液和磷酸缓冲液：维持适宜的细胞渗透压、离子浓度及酸碱度pH，起到缓冲调节和平衡作用。 3. Triton X1

21、00：常用的非离子去垢剂温和型，适当浓度的Triton X-100可使膜蛋白溶解下来并保持活性，胞质中可溶性成分随之流失，而主要存留细胞骨架系统。 4.戊二醛：良好的固定剂，对细胞内结构有活跃的亲和力，特别是蛋白质，起交联作用。能迅速杀死细胞，并很好的保存它原有细微结构和某些酶的活性。 5.考马斯亮蓝：非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）。七、 细胞凋亡形态及梯状DNA的观察1. 细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的自然过程; 由严格的遗传基因机制决定的程序性调控，又称细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)2. 细胞凋亡是动物生命过程中不可缺少的组成

22、部分, 正常的生命体一方面通过细胞分裂来产生新的细胞；一方面又通过程序性细胞死亡来清除“无用”的细胞；当这种程序发生紊乱时, 就会发生相关的疾病。3. 细胞凋亡时细胞膜内陷变样但完整，细胞分为一个个凋亡小体，被周围细胞吞噬，无炎症反应，核染色质凝聚固缩、趋边化、DNA有序裂解。细胞坏死时细胞膜破裂、胞浆外溢，产生严重的炎症反应。4. 线粒体介导的凋亡途径：在一些刺激下，内质网将其储存的钙离子释放，线粒体摄取钙离子，引起钙离子超载，导致线粒体损伤。细胞内源信号激活BAX/BAD,使其从胞质到线粒体膜，线粒体外膜通透性改变；cyto C 从凋亡的线粒体释放到胞质，与Apaf、前体caspase 9形成复合物；激活caspase 9，引发caspase级联反应，使细胞发生PCD。