基因工程复习要点Word文档下载推荐.docx

1、是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，可使整个菌落产生蓝色变化。人工插入外源基因后突变型大肠杆菌的-半乳糖苷酶被插入的外源基因切断，无法形成完整的-半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。9.噬菌体载体与质粒相比的优点是什么1. 感染效率更高 2.扩增速度快，复制量大 3.插入容量大 4.筛选更简单10.描述碱变性法提取质粒的原理和过程原理：大肠杆菌裂解后有两种DNA为染色体DNA和质粒DNA，将细胞裂解后的溶液中加入强碱调pH至12.0，两种DNA均变性，再加入高盐溶液如

2、KAc将pH调至中性，此时，染色体DNA生成白色絮状沉淀，而质粒DNA很快复性。过程：1.酶或机械法等破坏细胞，释放出胞内物质2. 加碱使DNA与蛋白质变性，加中和液复性3. 在上清液中通过酚-氯仿抽提，去垢剂或酶使剩余蛋白质变性或水解，除去蛋白质4. 加入醇溶液使质粒DNA变性沉淀而与其他水溶性物质分离5. 将沉淀溶解于有RNase的TE溶液中，温浴降解RNA后电泳检测，-20保存。11.三种提取质粒方法的特点和应用1. 碱变性法：提取量可大可小，纯度相对较高，大部分实验可用2. 沸水浴法：提取快速，纯度不高，提取量小，可用于快速筛选3. 离心法：纯度非常高，提取时间长，操作复杂，主要用于基

3、因治疗12.基因工程学科的局限性1. 生态上，基因不受控制的扩散，如植物花粉传播使杂草获得抗虫抗除草基因2. 转基因食物随人体肠道菌群排泄到水体，从而进入生态链，造成基因污染3. 可能造成人种的基因歧视二1. 酶切反应如何终止？1） 将反应液在65下加热510分钟；2） 向反应液中加入EDTA（螯合激活剂Mg2+）。2. 影响DNA连接反应的因素有哪些？最重要的是哪一点？1） DNA连接酶的酶量：黏性末端一般为0.1U，平末端一般为1U；2） 连接时间：5分钟至过夜；3） 反应温度：416；4） 插入DNA与载体DNA的分子摩尔比，最佳比为3:1（最重要的一点）3. 对于平末端，如何进行更好的

4、连接？1） 末端同聚物加尾法：利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA（dG）和dT（dC），然后在DNA连接酶作用下连接成为重组的DNA。2） 衔接物连接法：先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。4. 简述碱性磷酸酶的作用。碱性磷酸酶可将5磷酸转化为5-OH，从而防止DNA自连，提高DNA连接效率。5. 介绍两种制备探针的方法。1）切口平移法制备DNA 探针的过程:使用DNA 酶在DNA 双链上随机切开若干切口,切口处分别形成3和

5、5末端。利用DNA 聚合酶的53核酸外切活性,在切口处按53方向切除单核苷酸;同时利用DNA 聚合酶的53的聚合酶活性,在切口处3端加入底物中的单核苷酸,使脱氧核苷酸链得以延伸。随着反应的进行,切口不断按53的方向移动,底物中被标记的单核苷酸被掺入到DNA 链中,直至被标记的DNA 片段两条链的3端时完成标记。2）末端标记法：（三种：3末端标记法、5末端标记法、T4聚合酶替代法，这里讲的是3末端标记法）利用Klenow片段填补由限制酶消解DNA所产生的凹陷末端，通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶催化标记的dNTP加到3末端上。6. 什么是末端转移酶？其作用是什么？定义：一种能够将脱氧核苷酸三磷酸（d

6、NTP）加到某DNA片段上3-OH上的不需要模板的DNA聚合酶。作用：可在DNA3末端添加特定的核苷酸，在人工黏性末端的构建中极有用处。特点：无需模板的DNA聚合酶、具有5至3端的DNA聚合活性7.什么是限制与修饰作用，描述过程。原核细胞为了保护自己，选择性的降解外源DNA，并保护个体免疫于外来DNA侵入系统。主要由限制性内切酶和甲基化酶组成的二元系统。8.影响限制性核酸内切酶的影响因素。酶的纯度、酶切反应的温度与时间、DNA样品的纯度、DNA分子的构型、DNA甲基化的程度、限制性核酸内切酶的反应缓冲液。9.三种限制性核酸内切酶的特点。型：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切

7、割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。型：能识别专一的核苷酸顺序，并在改顺序内的固定位置上切割双链，识别顺序是一个回文对称顺序。型：有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。10.Klenow酶的定义活性及作用Klenow酶是大肠杆菌DNA聚合酶端的大片段活性：53的聚合活性，35的外切教正功能。用途：修复由内切酶造成的3凹断，使之成为平末端、催化cDNA第二条链的合成、用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。11.逆转录酶有哪些酶活性RNA指导的DNA聚合酶活性、RNase H活性（水解DNA）、DNA指导的DNA聚合酶活

8、性12.S1核酸酶是一种高度单链特异的核酸内切酶，酸性条件下，由Zn2+激活、降解单链DNA或RNA、降解反应方式为内切或外切，酶量过大时会伴有双核苷酸的降解切平突出的单链末端三1. 核酸提取的注意点（提取通则）1） 冰上操作，可降低酶活性，防止核酸被降解；2） 操作尽可能快速；3） 操作时要温柔，如不能用振荡器来振荡核酸，否则核酸容易断裂；4） 防止酶的降解，尤其是RNA,因为RNA酶多，且多数耐高温，耐酸碱不易失活。2. 为什么RNA提取比DNA更困难？1） RNA比DNA易被降解：RNase（核糖核酸酶）是非常稳定的酶，能够耐受高温高压，很难除去，DNase（脱氧核糖核酸酶）高温下易失活

9、，因此RNA比DNA更容易因为污染了酶而被酶降解；2） RNA在弱碱性条件下更容易分解，酸碱性耐受性差；3） 从结构来说，RNA更容易分解的机理是：在2位置上有游离的-OH，以致形成2,3-环形磷酸盐的中间产物，分解需要更低的自由能，因此易分解。3. 核酸提取之后，如何确定产量和浓度？1） 测核酸的OD260的值，若OD260=1，则代表有50g/L的DNA，40g/L的RNA；2） 测OD260/ OD280的值，DNA在1.61.8，RNA在1.82.0，若比值小，则表明蛋白质超标。4. 凝胶电泳分离核酸的原理。将凝胶置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到

10、核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。5. 化学合成的三种策略。1） 小片段粘接法： 将待合成的目的基因分成若干小片段，每段长12-15bp（碱基长度），两条互补链分别设计成交错覆盖的两套小片段，然后通过化学方法合成，并退火形成双链DNA大片段。2） 中片段法（补丁延长法）：将目的基因的一条链分成若干40-50bp大小的片段，另一条链设计成与上述大片段交错互补的小片

11、段（约20bp的补丁）。两组不同大小的DNA单链片段退火后，用klenow酶将空缺部分补齐，最后用T4-DNA连接酶修复缺口。3） 大片段酶促法：将目的基因两条链均分成40-50bp的单链DNA片段，分别进行化学合成，然后用klenow酶和T4-DNA连接酶补平。6. 化学合成法的特点和用途。优点反应快，操作简单；缺点价格昂贵，大部分情况下仅限于小片段的合成。合成PCR所需的引物；合成探针；合成接头；可合成新的人造基因。7. 什么是平台效应？在PCR扩增反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，引物、模板、聚合酶达到一定比值时，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进

12、 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，也叫平台效应。原因：产物量增多、dNTP消耗殆尽、酶活趋于平稳。8. PCR的五要素。模板、引物、Taq酶、dNTP（4种）、Mg2+浓度。9. PCR用途：（1）基因分离、克隆（2）扩增DNA靶序列并测序（3）DNA靶序列的突变分析（4）衡量DNA样品检测与分析。四1.引物设计的原则（1） 引物长度控制在15-30bp（2） 引物要是一对有相同的或相近的GC含量（3） 设计出的引物最好不要有其他的结合位点（4） 上下两条引物最好不要有互补区域（5） 引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个碱基，保证引物能够被切割2.PCR没有获得目的产物或得到杂产

13、物的原因（1） 没有获得目的产物1.Taq酶少；2.退火温度过高；3.dNTP太少；Mgcl2太少；5.循环次数太少；6.模板太少或不纯；解决方案：1.多加Taq酶、dNTP、Mgcl2、模板；2.降低退火温度；3.纯化模板；4.增加循环次数（2） 得到杂产物1.循环次数过多；2.酶太多；3.退火温度过低；4.模板、Mgcl2、dNTP过多；5.引物设计不合理1.增加循环次数；2.减少酶量、模板、Mgcl2、dNTP；3.升高退火温度；4.重新设计引物；5.增加延伸时间（3） 若上述解决方案都无法在奏效，可采用热启动PCR技术，有三种方案：a.在PCR体系中先不加入酶，当温度达到94时，再添加

14、酶进行PCR反应；b.将酶用石蜡珠包裹（或在反应液上部铺一层融化的石蜡，待其凝固后加酶），直到石蜡融化后再进入反应液中；c.使用热启动DNA聚合酶，在酶上作抗体封闭，或化学修饰，使其在94时才具有活性（原理：阻止温度升高到变性温度前的PCR反应的发生）3.做PCR实验时为什么要做对照实验（1） 检查PCR试剂，PCR扩增产物是否污染（2） 在医学检测方面，可检测PCR检查结果的正确性，以防出现错误的诊断4.介绍实时定量PCR实时定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法，由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所

15、以成为定量的依技术原理：将标记有荧光素的Taq man探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵循聚合酶链式反应规律，与模板DNA互补配对的Taq man探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测样本的目的基因的拷贝数5.热启动PCRPCR中，先将模板同引物在高于两者变性温度下处理一段时间，然后再加入酶和其他组分进行扩增的方式。消除非特异性扩增产物6.DNA测序方法桑格尔脱氧链末端终

16、止法（1） 分离待测核酸模板，模板可是DNA、RNA，可单链，可双链（2） 在4支试管中加入适当的引物、模板、4种ddNTP,再在上述4支试管中分别加入一种一定浓度的ddNTP（双脱氧核苷酸）（3） 与单链模板（如以双链作模板，要作变性剂处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下，以5端向3端进行延伸反应，35P随着引物延长掺入到新合成的链中。当ddNTP掺入时，由于它在3位置没有羟基，故不与下一个DMP结合，从而使链终止延伸。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链；（4） 用PAGE（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）同时分离4支反应试管中的反应产物，由于每一个反应管中只加一种dd

17、NTP，则该试管中各种长度的DNA都终止于该种碱基处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA3末端都为同一种双脱氧碱基（5） 放射自显影。根据四个泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列五1、什么叫基因文库？是指某一特定生物体全基因组的克隆集合。2、基因文库分为哪几种？按构建方法分为两种：基因组文库：把某种生物的基因组DNA 切成适当大小，分别与载体结合，导入宿主细胞，形成克隆。汇集这些克隆，这样的克隆片段的总汇，叫基因组文库cDNA文库：将某一个组织中的全部 mRNA 都反转录成cDNA，分别与载体连接形成的克隆的集合体。按载体分为四种：质粒文库、噬菌体文

18、库、黏粒文库、人造染色体文库3、基因组文库和cDNA文库的异同点相同点：都是由同一物种的DNA组成的文库。不同点：基因组DNA文库含有一种生物的全部基因，从基因组文库中获得的基因是完整的；cDNA文库含有一种生物的部分基因，cDNA本质就是外显子基因组文库大，其中基因含有启动子和内含子；cDNA文库小，没有内含子和启动子一种生物基因组文库只有一种，cDNA文库有多种。4、基因组文库或cDNA文库构建流程。（1）基因组文库：载体DNA片段的制备：DNA分离纯化限制酶切脱磷酸化反应供体DNA片段的制备：细胞中总DNA分离纯化机械剪切法（或酶切法）分离特定大小DNA片段供体与载体DNA连接重组DNA

19、分子的转移和基因组文库的扩增：利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增基因组文库质量的评价 载体的选择：噬菌体，YAC,BAC,粘粒等。（2）cDNA文库：载体DNA片段的制备多聚（A）RNA的分离与纯化双链cDNA的合成:a）单链cDNA的合成:反转录法;b）第二条cDNA的合成:碱解或酶解（ Rnaseh）法除去RNA分子;ds-cDNA与载体DNA相连：a）人工接头b）同聚物加尾c ）cDNA的定向插入重组cDNA分子的转移和文库的建立：选用载体为质粒,可直接转化 E coli;若为载体,则需进行体外包装、感染等5、基因文库获得目的基因的优缺点优

20、点：操作简单缺点:工作量大,盲目性大,专一性差6、什么叫转化？什么叫感受态细胞？转化：是目的基因进入受体细胞并在受体细胞中维持稳定和表达的过程。感受态细胞：指用理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。重组子：含有重组DNA的转化子。7、CaCl2法转化DNA操作原理及流程原理:细菌处于0，在CaCl2低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，DNA则与CaCl2形成抗Dnase的羟基磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并 分裂增殖，重组子的基因在被转化的细菌中得到

21、表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。流程：培养大肠杆菌,取一部分转接于LB培养基中,摇床培养离心,去掉上清液,加入冰冷CaCl2溶液,与沉淀混合重悬（冰上操作）再次离心,去掉上清液,再加冰冷CaCl2溶液与沉淀混合重悬,制成感受态细胞溶液向上述离心管的溶液中加入DNA,冰浴30min再放入42的水浴锅中90s,然后再放冰上1min向离心管中加入新鲜的LB接培养，37培养1h（不含抗生素的培养基），最后进行涂平板筛选。8、影响转化率的因素转化方法感受态细胞的状态是否良好（感受态是否做好）外源DNA本身的状态六1.什么叫核酸分子杂交热变性的DNA经缓慢冷却过程中，具有碱基序列部分互补的

22、不同的DNA之间或DNA与RNA之间形成杂化双链的现象称为核酸分子杂交2.核算分子杂交的用途（1） 筛选重组子（2） 观察某一样品中是否有特定序列的存在（3） 观察某一样品中是否有特定基因的表达（4） 研究不同样品之间某一特定基因表达量的差异（5） 分析序列相似性程度（6） 建立基因芯片技术的基础3.重组子筛选的策略（1） 遗传标记法：抗生素法、蓝白斑筛选（2） 插入片段的大小：跑凝胶电泳、菌落PCR（3） 插入片段的序列：菌落原位杂交法、Southern杂交、Northern杂交（4） 插入片段的产物：Northern杂交、Western杂交4.Southern杂交原理及方法具有一定同源性的

23、两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性的杂交形成双链，此杂交过程是高度特异性的。（1）制备待测DNA（2） DNA限制酶消化（3） 琼脂糖凝胶电泳分离待测的DNA样品（4） 电泳凝胶预处理:DNA片段控制在大约2kb以下，使DNA保持单链状态（5） 转膜：将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上，DNA相对位置不变（6） 探针标记（7） 预杂交：将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，保证只有固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交（8） 固相DNA与探针杂交（9） 洗膜（10） 放射性自显影检测5.Northern杂交原理及方法在变形条件下将检测的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继

24、而按照同Southern杂交相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测（1）完整mRNA的分离（从细胞中）（2） 根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离（3） 将RNA转移到固相支持物上，在转移过程中保持RNA在凝胶中的相对分布（4） 将RNA固定到支持物上（5） 固相RNA与探针分子杂交（6） 出去非特异性结合到固相支持物上的探针分子（7） 对特异性结合的探针分子的图像进行检测，捕获和分离6.Western杂交原理及方法经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固体载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与

25、对应的抗体起免疫作用，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射性自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。（1）蛋白质样品制备及蛋白质质量（2） 电泳SDS-PAGE（3） 转膜（4） 免疫杂交反应杂交结合一抗、二抗（5） 发光鉴定，显影，定影（6） 凝胶图像分析七1.什么叫转基因动物？将外源重组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中，从而形成在体内表达外源基因的动物，称为转基因动物2.转基因动物的用途（1） 可作为疾病研究模型（2） 研究基因功能（3） 研究基因表达模式（4） 可用来生产蛋白质3.具体描述显微注射法和胚胎干细胞法构建小鼠的流程（1） 显微注射法将供体母鼠

26、与注射PMS/HCG激素的公鼠交配得受精卵准备供体DNA，得到目的基因的DNA片段，并准备假孕母鼠基因导入：在电子显微镜下，用一根极细的玻璃针直接将目的基因的DNA片段注射到胚胎干细胞的细胞核内胚胎移植：把注射过DNA的胚胎移植到假孕母鼠体内，使之发育成正常的幼仔对幼鼠进行鉴定：取仔鼠尾，剪碎消化，提取DNA，用PCR等方法进行鉴定是否含有外源基因建立转基因鼠系（2） 胚胎干细胞法分离培养ES细胞在ES细胞上进行基因操作，通过基因打靶技术，将外源基因导入ES细胞获取囊胚细胞，作为ES细胞的移植受体通过显微操作将ES细胞注入到囊胚期胚胎的腔内，与其细胞团紧靠在一起，成为嵌合体将注射过的胚胎，经培

27、养后筛选无收育缺损的囊胚，移植到假孕母鼠的子宫内，培育出幼仔对幼鼠进行鉴定建立转基因鼠系4.动物反应器动物生物反应器是利用转基因活体动物，高效表达某种外源蛋白的器官或组织，进行工业化生产功能的蛋白质的技术5.转基因动物研究的局限性（1） 成本高，效率低（2） 转基因的表达不理想（3） 目的基因与动物生产性状的多基因矛盾突出（4） 社会对转基因动物的可接受性有待进一步论证6.胚胎干细胞：早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，具有体外培养无限增殖，自我更新和多向分化的特性。7.动物细胞导入的方法。动物细胞物理转化法工程胚胎干细胞法动物病毒转染法体细胞转基因克隆法八1、基因芯片的原理及基因芯片研究基因表达变化的流程。基因芯片：是一种高密度的寡聚核苷酸阵列。采用原位组合合成化学和微电芯片的光蚀刻技术等方法，将大量特定序列的DNA片段直接固定在玻璃或硅附底上，从而构成存储大量信息的DNA芯片。采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上，然后加入标记的待测样品,进行多元杂交，通过杂交信号的强弱及分布，来分析目的分子的有无、数量及序列,从而获得受检样品的遗传信息。测序原理:杂交