多色荧光原位杂交技术检测急性淋巴细胞白血病复杂核型异常.docx

1、多色荧光原位杂交技术检测急性淋巴细胞白血病复杂核型异常多色荧光原位杂交技术检测急性淋巴细胞白血病复杂核型异常【摘要】 本研究建立多色荧光原位杂交技术平台，探讨其在检测急性淋巴细胞白血病复杂核型异常中的应用。联合应用常规细胞遗传学方法和M-FISH技术分析了5例伴有复杂核型异常的ALL患者。结果表明：M-FISH 证实了原有的异常t(9；22)、t(1；19)和 t(y；1)，同时还发现了新的异常der(1)(137)、der(6) t(6；9)(q?；p13)、der(1)t(1；11)、der(12)t(1；12)、der(3)t(3；5)、der(2)t(2；16)、der(9)(9187

2、)和der(7)(9187)，并且纠正了原有的错误分析，其中der(9)(9187)及der(7)(9187)为世界上首例报道。结论：M-FISH在检测ALL复杂核型中的应用前景广阔，是进行精确染色体核型分析所不可缺少的先进手段。【关键词】 多色荧光原位杂交Detection of the Complex Chromosomal Aberrations in Acute Lymphoblastic Leukemia by Means of Multiplex Fluorescence in situ HybridizationAbstract This study was aimed to e

3、stablish the technique of multiplex fluorescence in situ hybridization (M-FISH) and to explore its usefulness in detection of complex chromosomal aberrations (CCAs) in acute lymphoblastic leukemia (ALL). Five ALL patients with CCAs were analyzed by combining the techniques of conventional cytogeneti

4、cs (CC) and M-FISH. The results demonstrated that M-FISH confirmed the aberrations previously detected by CC，such as t(9；22)，t(1；19) and t(y；1)，and revealed new abnormalities as der(1)(137)，der(6)t(6；9)(q?；p13)，der(1)t(1；11)， der(12)t(1；12)，der(3)t(3；5)，der(2)t(2；16)，der(9)(9187) and der(7)(9187)，an

5、d also corrected the wrong results in CC. Among these abnormalities，der(9)(9187) and der(7)(9187) were reported for the first time. In conclusion，M-FISH has proved to be useful in characterization of the CCAs in ALL，and it is an essential method to refine the karyotype analysis.Key words multiplex f

6、luorescence in situ hybridization；acute lymphoblastic leukemia；complex chromosomalaberration伴随血液系统疾病WHO分型的提出，细胞遗传学已被提升到了更重要的地位。但是常规细胞遗传学方法对微小染色体重排或复杂核型分析效果较差，而荧光原位杂交技术又只能用1-2种探针来检测证实已知的异常。这两种方法都难以识别复杂的染色体结构改变和标记染色体的来源。多色荧光原位杂交 技术1则可以有效的解决上述难题。M-FISH技术在国外开展应用相对较多，但国内仅有赵萌等2应用 M-FISH 技术检测了2例急性白血病患者的核型异

7、常。我们应用M-FISH技术对5例伴有复杂核型异常的急性淋巴细胞白血病病例进行了检测，以探讨该技术在检测ALL复杂核型异常中的应用。材料和方法研究对象5例ALL患者，男4例，女1例，诊断和分型根据细胞形态学、细胞化学染色、多参数流式细胞术免疫分型和染色体核型分析确定，出现的染色体异常累计2个以上染色体和3个以上断裂位点。例正常男性作为对照。细胞遗传学分析采用骨髓短期培养法，按常规制备染色体。应用R显带技术进行核型分析，核型异常按人类细胞遗传学国际命名体制1995加以描述。M-FISH分析M-FISH 探针为 Vysis 公司提供，以联合标记的方式共标记SpectrumAquaTM、Spectr

8、umGreenTM、SpectrumGoldTM、SpectrumRedTM、 SpectrumFRedTM 5种荧光素，用SpectraVysion 分析系统分析可得出24种不同的色彩分别标记于每一条染色体上。M-FISH的具体步骤 取出储存于-20的染色体标本，气干法滴片，自然干燥后放入37 2SSC中老化30分钟； 分别用RNA酶、胃蛋白酶及甲醛消化处理玻片，具体时间随玻片上细胞多少及胞浆多少而定，用相差显微镜观察确定； 72、70%甲酰胺/2SSC变性玻片2分钟，室温乙醇梯度脱水待干； 取出10 微升/1张玻片量的探针，72水浴5分钟；加探针10 l于玻片上，上盖22 mm22 mm盖

9、玻片，四周封胶，放入湿盒中37杂交12-18小时；第2天，取出玻片，揭去盖玻片，放入72 SSC/% Tween-20中洗片2分钟，再放入室温2SSC/% Tween-20中洗片1分钟，待干； 加DAPI III 10 l 复染，1小时后看片。系统分析采用SpectraVysion 分析系统及Leica DRMA2型荧光显微镜，按照顺序换用 5 种滤光片，每一个分裂象分别于SpectrumGoldTM、SpectrumFRedTM 、SpectrumAquaTM、SpectrumRedTM和SpectrumGreenTM滤光片下采集5种荧光素的原始图象，软件分析合成最后的分类图象，即每一条染色

10、体被赋予一种伪彩，每一份标本均采集约20个分裂象。结 果5例ALL患者具体情况见附表。 例正常男性对照的常规染色体和M-FISH均显示正常男性核型：46，XY。5例ALL患者的中期分裂相较多，染色体分散好，故采集后合成的图象效果较好。例1与例2均有t(9；22)易位，已预示预后较差，但因其还具有其他复杂异常，经M-FISH检测后发现，例1具有der(1)(137)、der(6)t(6；9)(q?；p13)；例2则具有多个复杂异常：der(1)t(1；11)、der(12)t(1；12)、der(3)t(3；5)、der(2)t(2；16)；例3为一超二倍体ALL患者，具有复杂异常，但因常规显带

11、效果较差，未分清是何种异常，经M-FISH证实为der(9) (9187)2与der(7)(9187)2；例4的M-FISH与常规核型分析相同，未发现新的异常；例5的常规核型分析发现较复杂，为47，XY，-4，11q-，14q+，der(15)，der(17)，+mar1，+mar2，但M-FISH结果证实为48，XY，+1，t(1；14)(p32；q31)2，+der(2)，-4，+der(7)，del(11)(q14)。例正常对照和5例患者的M-FISH图形见附图。 Table. CC and M-FISH features of five ALL patients 讨 论众所周知，细胞遗

12、传学对急性白血病患者的预后起重要作用，是急性白血病最重要的预后因素之一。但急性白血病患者的染色体制备较难，尤其是ALL患者，染色体易成团、成像粗糙、显带不清，常规细胞遗传学分析较困难。若ALL患者为CCAs，则分析更为困难。但是我们需要明确CCAs，以便将其分为不同的细胞遗传学亚型以指导治疗，判断预后。 目前，国际上开展M-FISH技术来明确急性白血病患者的CCAs。M-FISH技术是应用5种荧光素同时标记人类24条染色体，制备整套染色体涂抹探针，与待测病例的中期染色体分裂象进行杂交，杂交后应用配备有CCD冷式摄像系统与计算机图象处理系统等装置的荧光显微镜进行检测。M-FISH通过一次杂交即可

13、检测整套人类染色体的所有异常。 M-FISH在确定CCAs中起了重要作用，如确定复杂的结构或数量异常，揭示隐匿易位，查明标记染色体的来源等1-3。应用该技术对ALL患者的研究尚不多。我们已知10%-34%的原发性AML患者与%的儿童ALL患者中存在CCAs4，5，但尚不清楚CCAs在成人ALL患者中所占比例。因此，我们应用M-FISH技术检测5例伴有CCAs的ALL患者，以探讨M-FISH在检测ALL复杂核型中的价值，为今后研究ALL的复杂核型异常建立一扎实的技术平台。 通过本研究，我们建立了较稳定的M-FISH技术平台，成功地分析了5例ALL患者。这5例ALL患者均伴有CCAs，经M-FIS

14、H检测，证实了原有的异常，如t(9；22)、t(1；19)、t(y；1)，同时还发现了新的异常，如der(1)t(137)、der(6)t(6；9)(q?；p13)、der(1)t(1；11)、der(12)t(1；12)、der(3)t(3；5)、der(2)t(2；16)、der(9)(9187)和der(7)(9187)，其中der(9) (9187)及der(7)(9187)为目前世界上首例报道的核型异常。 M-FISH不仅发现与证实了常规细胞遗传学结果，还纠正了原有的错误分析。例5经常规细胞遗传学分析结果为47，XY，-4，11q-，14q+，der(15)，der(17)，+mar

15、1，+mar2，但M-FISH检测结果证实为48，XY，+1，t(1；14)(p32；q31)2，+der(2)，-4，+der(7)，del(11)(q14)。 M-FISH在检测过程中，不需要事先知道是否存在异常，而一次检测约2天时间，就可以检测4份标本，省时、省力，实现了核型分析自动化。因此我们认为M-FISH在检测ALL复杂核型异常中的应用前景广阔。 但是，通过本研究我们也发现了M-FISH技术的局限性，为此提出了一些相应改进要求：染色体分散要好，数量应较多，对质量要求高，但单个染色体可以毛糙。因此气干法滴片时，可选用4，95%乙醇泡过的玻片，滴片时玻片与滴管的距离尽量长；M-FISH

16、对染色体内的改变如臂内倒位，小的片段的缺失与重复检测效果较差。对上述异常需要结合常规显带技术或比较基因组杂交技术来确认。 总而言之，M-FISH技术能够明确ALL患者的复杂核型异常，并且真正实现了核型分析的自动化，应用前景广阔，它已成为精确染色体核型分析所不可缺少的先进手段。 【参考文献】 1 Liehr T，Srarke H，Weise A，et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol Histopathol，2004；19: 229-237 2赵萌，陈冰，王璐等. 多重荧光原位杂交技术体系的建立及其在检测白

17、血病复杂核型异常中的应用. 中华医学遗传学杂志，2002；19:375-3783Langer S，Kraus J，Jentsch I，et al. Multicolor chromosome pain- ting in diagnostic and research applications. Chromosome Res，2004；12:15-234van-Limbergen H，Poppe B，Michaux L，et al. Identification of cytogenetic subclasses and recurring chromosomal aberrations in AML and MDS with complex karyotypes using M-FISH . Genes Chromosomes Cancer，2002；33: 60-725Jarosova M，Holzerova M，MihaI V，et al. Complex karyotype in childhood acute lymphoblastic leukemia: cytogenetic and molecular cytogenetic study of 21 cases. Cancer Genet Cytogenet，2003；145:161-168