槐米中芦丁的提取及分离工艺研究.docx

1、槐米中芦丁的提取及分离工艺研究学号 2010261130 毕 业 论 文（设 计）（ 2014 届本科） 论文题目: 槐米中芦丁的提取及分离工艺研究 学 院： 陇东学院化学化工学院 专 业： 应用化学 班 级： 10应用化学 作者姓名： 指导教师： 职称： 教授 完成日期： 2014 年 4 月 20 日槐米中芦丁的提取及分离工艺研究 摘 要：目的 以槐米为原料提取黄酮类化合物芦丁，学习黄酮类化合物的提取、分离、鉴定的原理和方法，掌握黄酮类成分的主要性质，优选出提取芦丁的工艺条件。方法 主要采用碱提酸沉法提取分离芦丁，再由芦丁在稀酸中水解得到槲皮素，用单因素法优选出提取的最佳条件。结果 用碱提

2、酸沉法提取的芦丁质量合格，且颗粒大小、提取次数、提取时间、提取温度、酸度、结晶时间等因素均对芦丁的产率和纯度有影响。结论 此方法装置简单，操作方便，费用和成本低，但提取过程中很难过滤，效率不是很高。各提取因素中酸度对芦丁的产率影响最大。关键词：槐米；芦丁；槲皮素；碱提取酸沉淀；鉴定Study on Extraction and Separation of Rutin in Flos Sophorae Zhenzhu Li(College of Chemistry and Chemical Engineering, Longdong University, Gansu Qingyang 7450

3、00)Abstract: Objective To extract Rutin from Sophora flavone compounds, learning flavonoids extraction, separation, identification principle and method, grasping the main properties flavonoids, and choosing the optimum extraction technology of rutin. Methods Mainly using the method of alkali extract

4、ion and acid precipitation to extract rutin, the next, making quercetin by hydrolyzing rutin in dilute acid, selecting the best extraction conditions by single factor method. Result The quality of rutin that made by alkali extraction and acid precipitation method is eligible, and particle size, extr

5、action times, extraction time, extraction temperature, acidity, crystallization time and other factors have effect on the yield and purity of rutin. Conclusion This method has the advantages of simple device, convenient operation, low charge and cost, but the extraction process is difficult to filte

6、r, the efficiency is not high. In the factors of extracting rutin, acidity is the greatest impact to the yield. Keywords: Sophora japonica; rutin; quercetin; alkali extraction and acid precipitation; identification0 引 言 槐米，别名白槐、槐花，为豆科植物槐（Sophora japonica L.）的未开放花蕾，两千年前即作药用，公元2800多年前的神农本草经首次将槐米列为上品1。

7、中国药典称其凉血止血、清肝泻火，用于便血、痔血血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕等症2。槐米中含有芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、异黄酮苷元染料木素、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等，其中芦丁是主要活性成分。其含量因产地和收取时间不同而不同，约为12%35%3。芦丁（Rutin），又名芸香苷（Rue glucoside），属黄酮类化合物，其化学名称为：5,7,3,4-四羟基-3-芸香糖黄酮。性状为黄色结晶粉末或无晶形粉末，有苦味，略溶于水，能溶于热水、甲醇及乙醇。芦丁具有广泛的药理活性，既可作为治疗药物，又可作为保健品。具有维生素P样作用，能降低毛细血管通透性和脆性，促进细胞增生和

8、防止血细胞凝聚，临床上用于治疗毛细血管脆性引起的出血症，有助于恢复毛细血管弹性，如治疗脑血管出血、高血压、视网膜出血、急性出血性肾炎等4。芦丁水解所得的槲皮素是很好的天然染料，作为药品，具有很好的祛痰止咳作用。芦丁广泛存在于自然界，几乎所有的芸香科和石楠科植物中都有。尤以芸香科植物的芸香草、豆科植物的槐米、蓼科植物的荞麦、金丝桃科植物的红旱莲、鼠李科植物的光枝勾儿茶、大蓟科植物的野梧桐叶等含量较为丰富5。药理研究表明，芦丁具有清除自由基、吸收紫外线、抗氧化、保护胃黏膜、抗骨质疏松、增强免疫、抗衰老、降低血糖、抗癌细胞、抗病毒、抑菌、抗炎、镇痛的功效，是预防和治疗糖尿病、心绞痛、慢性心功能不全、

9、高血脂和预防动脉硬化、心机梗死、脑血栓等疾病的天然绿色药物4。因此，芦丁作为黄酮类主要成分的代表，受到科研界的高度重视。目前对芦丁的研究比较成熟，在提取分离纯化方法、制剂研究、分析检测技术等各方面取得了显著成果。提取方法主要有：（热）碱提取酸沉淀、索氏提取法、热水提冷析出法、超声辐射法、热水提大孔吸附树脂纯化法、热水提、醇除杂、酸沉淀法、冷碱渗漉提取酸沉淀、连续回流提取、乙醇浸提法、超临界二氧化碳提取法、杀酶碱提、连续萃取法、微波法等6。主要剂型有：芦丁缓释片、芦丁环糊精包合物、芦丁微囊与微球、芦丁亚微乳剂、芦丁滴丸、芦丁水凝胶剂、芦丁泡腾颗粒剂7。分析鉴定方法主要有：分光光度法8、高效液相色

10、谱法（HPLC）、热分析、红外光谱法、X-射线衍射技术9、薄层扫描法、毛细管电泳法等。本实验以槐米为原料，采用碱提取酸沉淀的方法来提取芦丁，并以芦丁为例学习黄酮类化合物的性质及部分鉴定方法。1 实验部分1.1 实验原理 中药槐米中主要化学成分为：芦丁、槲皮素，还含有少量皂苷类及多糖、粘液质等。芦丁（Rutin）：C27H30O163H2O，分子量610.51，浅黄色针状结晶，mp 176178 ，188 （无水物）；难溶于冷水（1:10000），难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮。可溶于热水（1:200），沸乙醇（1:60），冷乙醇（1:650），热甲醇（1:10），冷甲醇（1:10

11、0），吡啶、甘油；易溶于碱液10。芦丁槲皮素（Quercetin）：为芦丁的苷元，C15H10O72H2O，分子量202.16，黄色结晶，mp 313314 ，316 （无水物）。能溶于冷乙醇（1:290），易溶于沸乙醇（1:23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等，难溶于水、苯、石油醚等溶剂。槲皮素芦丁的水解： +鼠李糖+葡萄糖本实验依据芦丁为黄酮苷，其结构中具有酚羟基，显酸性，能与碱反应，生成盐溶于水，向此盐溶液中加入酸，则芦丁游离析出的性质进行提取分离。利用芦丁易溶于热水、热甲醇、热乙醇，较难溶于冷水、冷甲醇、冷乙醇的性质采用重结晶的方法进行精制。再根据芦丁可被稀酸水解生成槲皮

12、素及葡萄糖、鼠李糖进行槲皮素的制备。用红外光谱法、薄层色谱法和黄酮类物质特征反应来鉴定芦丁和槲皮素。最后，采用单因素实验对提取方法进行探讨，得出最优反应条件。1.2 实验仪器及药品HH-Z电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），SHZ-D循环水式真空泵（河南省巩义市英峪仪器一厂），TDL-4型低速台式离心机（上海双旭电子有限公司），DHT型磁力搅拌恒温电热套（山东菏泽石油化工学校仪器厂），DZF-6020型真空干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司），2F-2型三用紫外分析仪（上海安亭电子仪器厂），红外光谱测定仪（）。槐花米（市售），硼砂，氢氧化钙，无水亚硫酸钠，95%乙醇，浓硫酸，浓盐酸，无水甲醇，无

13、水乙醇，镁粉，1-萘酚，溴化钾，醋酸乙酯，甲酸，羧甲基纤维素钠，硅胶G，2%三氯化铝-乙醇溶液（以上试剂均为分析纯）。1.3 芦丁的提取分离1.3.1 碱提取准确称取槐米颗粒20g于500mL烧杯中，加入配好的0.4%的硼砂水溶液250mL，煮至刚刚沸腾时加入1.25g无水亚硫酸钠。不断搅拌下小心加入石灰乳调节提取液pH 为8911，微沸下搅拌提取60min，不断加入失去的水，趁热用纱布过滤12。滤渣同法再重复提取两次，合并三次滤液。1.3.2 酸沉淀 用盐酸调节滤液pH= 23，静置12h后离心处理，沉淀用pH= 12的盐酸洗涤1次，再用蒸馏水洗涤23次至中性。取下滤饼置于表面皿上放在真空干

14、燥箱中65干燥至恒重，即得芦丁粗品。1.4 芦丁的精制 重结晶将粗品芦丁研细后按芦丁在热水中1:200的溶解度加蒸馏水进行提纯。将沉淀悬浮于蒸馏水中，加热煮沸15min，趁热抽滤。将滤液静置12h，离心处理后滤取沉淀，6070干燥至恒重，得提纯后的芦丁，称重。取1/2提纯后的芦丁粉末于青霉素瓶中，用胶头滴管加无水甲醇至芦丁恰好完全溶解，放置使其结晶析出。待甲醇挥发至基本析晶完成，用胶头滴管小心吸出残留的甲醇，将瓶壁擦干净，65真空干燥得黄色针状结晶，为芦丁精制品。称重，计算产率。1.5 槲皮素的制备取用蒸馏水提纯过的芦丁1g，研碎后置于150mL圆底烧瓶中，加入2%硫酸溶液80mL，用恒温电热

15、套加热微沸90min。反应完毕，静置30min，抽滤取结晶，用少量水洗涤沉淀，65真空干燥得槲皮素粗品。然后加95%乙醇加热回流使槲皮素粗晶溶解，趁热抽滤，放置析晶，抽滤，沉淀于110下减压干燥，得槲皮素精制品13，称重。1.6 鉴定1.6.1 性质实验1.6.1.1 盐酸-镁粉反应取芦丁少量于试管中，加乙醇数滴置水浴上稍加热溶解，再加浓盐酸23滴，最后加少量镁粉，观察颜色变化14。此反应是还原反应，是黄酮类化合物的显色反应。1.6.1.2 三氯化铝反应取芦丁醇溶液于滤纸上，紫外灯下观察荧光，然后喷三氯化铝-乙醇试液，再在紫外灯下观察荧光颜色的变化。1.6.1.3Molish反应取芦丁少量于试

16、管中，加乙醇数滴溶解，再加1%1-奈酚溶液数滴，摇匀后沿管壁滴加浓硫酸，观察界面处有何变化。1.6.2 红外光谱鉴定分别取芦丁精制品和槲皮素精制品5mg，与溴化钾150mg混合研匀，压片，放入样品室，分别测定各自红外吸收光谱图。如图1和图2： 图 1 芦丁红外光谱图 图2 槲皮素红外光谱图1.6.3 薄层层析鉴定（1）薄层板的制备称取一定量的硅胶，加入3倍体积0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液，调匀，尽量避免气泡产生15。薄板洗净后晾干，将硅胶平铺于薄板上，厚度约为0.25mm，于室温下晾干备用。（2）样品溶液的制备 分别称取50mg芦丁和槲皮素，用无水乙醇溶解配成25mg/mL的溶液。（3）试验

17、方法以醋酸乙酯:甲酸:水=8:1:1作展开剂，以2%三氯化铝乙醇液作显色剂。用毛细管吸取样品溶液，点于硅胶板上，在展开剂中上行展开。取出晾干，喷上显色剂，在紫外分析仪365.0nm灯光下观察现象。2结果与讨论2.1 提取芦丁、槲皮素结果与讨论 由实验1.31.5所得结果如表1所示：表1 芦丁的提取、精制及水解Table 1 Rutin Extraction, refining and hydrolysis产物芦丁粗品精制芦丁槲皮素粗品精制槲皮素质量（g）6.694.10.870.56产率（%）33.420.517.811.4从表1可以看出本实验所得的精制芦丁含量为20.5%，在文献报道的槐米中

18、芦丁含量范围内。2.2 鉴定实验结果与讨论由实验1.6所得结果如表2、表3、表4所示：表2 芦丁的性质实验Table 2 Properties experiment of rutin反应类型盐酸-镁粉反应三氯化铝反应Molish反应实验现象红色黄色沉淀棕色环表3 薄层层析结果Table 3 TLC results样品芦丁槲皮素实验现象黄绿色荧光黄色荧光在可见光下，芦丁和槲皮素的色斑均呈现黄色，在365.0 nm紫外灯下，芦丁呈黄绿色荧光，槲皮素黄色荧光。喷上显色剂荧光亮度更大。芦丁和槲皮素的区别在于芦丁水解后失去了糖苷，其本身的结构发生了变化，故在紫外灯光的照射下呈现出不同的颜色。表4 红外光

19、谱鉴定分析Table 4 IR spectrum identification and analysis芦丁分子主要官能团红外吸收归属振动频率（cm-1）配位水、醇和酚羟基的伸缩振动吸收峰3421.48羰基伸缩振动吸收峰1654.81苯环键共轭体系的C=C伸缩振动吸收峰1608.52，1508.23酚羟基的C-O键伸缩振动与O-H键面内变形振动偶合吸收峰1361.65，1301.86醚的C-O-C伸缩振动吸收峰1203.50通过对芦丁和槲皮素的红外光谱图进行分析，由图1和图2可以看出，芦丁在3421cm-1的羟基伸缩振动吸收峰宽而强，表明其结构中羟基的数目较大。槲皮素分子在1508cm-1处苯

20、环骨架振动吸收峰强度明显高于芦丁分子相应位置吸收峰。另外，芦丁具备一些与芸香糖基有关的特征吸收峰：特征区内，2931cm-1处的吸收峰是糖类物质中CH2基团的CH反对称伸缩振动引起的16。2.3 颗粒大小对产率的影响准确称取研碎后的槐米粗粉与没有研过的槐米颗粒5.0g，分别加入50mL 0.4%硼砂水溶液煮至刚刚沸腾时加入0.25g无水亚硫酸钠做抗氧剂。不断搅拌下小心加入石灰乳调节提取液PH至9，微沸下搅拌提取30min，不断加入失去的水，趁热用尼龙布过滤。滤渣同法再重复提取两次，合并提取液。滤液放冷后用盐酸调节滤液pH = 23，静置12h后离心处理，沉淀用pH = 12的盐酸洗涤一次，再用

21、蒸馏水洗涤两三次至中性。取下滤饼置于表面皿上放在真空干燥箱中65干燥至恒重，即得芦丁粗品，称重，记录数据。结果如表5所示： 表5 颗粒大小对产率的影响Table 5 The effect of particle size on the yield颗粒大小未研细槐米研细的槐米产物质量(g)1.221.36产率(%)24.427.32.4 提取次数对芦丁产率的影响按上述步骤进行实验，其他条件保持不变，原材料用槐米颗粒，提取次数分别为1，2，3，4次，实验结果如表6所示：表6 提取次数对产率的影响Table 6 Effect of extraction times on the yield提取次数1

22、234产物质量（g）1.131.181.211.22产率（%）22.623.624.324.42.5 碱提pH对产率的影响按上述步骤进行实验，其他条件保持不变，原材料用槐米颗粒，碱提pH分别为：7，8，9，10，11，实验结果如表7所示：表7 碱提pH对产率的影响 Table 7 Effect of pH on yield, alkali extractionpH7891011产物质量（g）1.151.211.221.191.17产率（%）23.024.324.423.824.42.6 提取时间对产率的影响按上述步骤进行实验，其他条件保持不变，原材料用槐米颗粒，提取时间分别为：20min，30

23、min，40min，50min，60min，90min，结果如表8所示：表8 提取时间对产率的影响Table 8 Effect of extraction time on Yield提取时间(min) 203040506090产物质量(g)1.021.221.451.581.671.67产率(%)20.424.429.031.633.433.42.7 酸沉pH对产率的影响 按上述步骤进行实验，其他条件保持不变，原材料用槐米颗粒，酸沉pH分别为：1，2，3，4，5，实验结果如下：表9 酸沉pH对产率的影响Table 9 The effect of pH on yield of acid prec

24、ipitationpH12345产物质量(g)1.101.211.221.181.00产率(%)22.024.224.423.620.02.8 硼砂因能与芦丁结合，起保护邻二酚羟基，不被氧化破坏的作用，提取时加入硼砂，产品质量会好一些。加石灰乳既能达到碱溶解提取芦丁的目的，还可以除去槐米中大量的多糖黏液质和酸性树脂，但pH不能过高，因为钙能与芦丁形成螯合物而沉淀析出。酸沉pH过低会使芦丁形成烊盐重新溶解，降低收率。2.9 采用单因素实验提取出的芦丁由于是粗制品，提取出的物质中含其他成分，但总体可以判断出最佳条件。从表59中可以看出各提取因素中酸度对芦丁的产率影响最大。3 结论3.1本实验采用碱

25、提酸沉法提取的芦丁质量合格，提取率达20.5%，优选出的提取条件为：研碎过2040目筛的槐米粗粉10，约10倍体积溶剂，加0.4%硼砂提取3次，加入0.5%亚硫酸钠作为抗氧剂，提取时间为60min90min，提取温度为90，碱提pH为89，酸沉pH为23，结晶时间为12h以上。3.3 芦丁和槲皮素均属于黄酮类化合物，具有黄酮类化合物的特征吸收峰，但二者化学结构有所不同。芦丁是槲皮素C3位上的羟基与芸香糖相连形成的黄酮苷。引入糖基使得芦丁和槲皮素红外光谱中某些特征峰的峰形、峰位及相对强度有所不同。3.2 此方法提取出的芦丁纯度高，操作简便，污染少，成本低，但提取分离过程因产生的糖类黏液质使提取液

26、粘稠不好抽滤，用离心机处理后，离心管中的产物不方便取出对产率有一定影响。因此，本研究认为在对芦丁的提取工艺进行探究的过程中，应尽可能采取更高效的提取方法，应对传统的碱提取酸沉淀进行不断改进，既保证产品纯度，也要保证提取效率。另外，随着天然药物化学提取精制技术和现代制剂技术的快速发展，相信对中药芦丁的研究会有更广阔的前景。参考文献:1 马国刚, 王建中, 卢晓蕊. 响应面分析法优化槐米芦丁超声波提取工艺的研究J. 食品与发酵工业, 2007, 20 (8): 167-172.2 国家药典委员会. 中国药典（一部）. 北京: 化学工业出版社, 2000. 291.3 李振志, 朱华, 谢峰等. 不

27、同产地槐米中芦丁的含量测定J. 世界中医药, 2013, 8 (8): 952-954.4 童婧, 郭晓蓉, 房文亮, 等. 槐米中芦丁提取工艺研究J. 中外医疗, 2011, 9 (b): 41-42.5 马溶, 庞广昌, 芦丁对现代文明病的作用J. 食品科学, 2013, 34 (7): 307-310.6 黄尚荣. 药用芦丁化学成分提取方法及其药理学研究进展A. 园艺学C, 现代农业科技: 2009, 100-101.7 艾凤伟, 李诗莹, 成效天, 等. 芦丁制剂的研究进展J. 中成药, 2012, 34 (7): 1347-1348.8 胡建平. 分光光度法测定芦丁条件的研究J. 分

28、析与检测, 2009, 209 (8): 143-145.9 赵希, 张黎明, 高文远. 芦丁和槲皮素的几种快速鉴定方法J. 分析试验室, 2008, 5 (27): 243-245.10 唐爱莲, 刘宁, 程难秋. pH值对芦丁提取工艺影响及槲皮素制备工艺的研究J. 桂林医学院学报, 1994, 7 (3): 29-31.11 张国华, 赵玉新.芦丁的提取分离及鉴定J. 哈药集团制药六厂.2004, 1 (4): 2-3.12 杨新河, 吕帮玉, 毛清黎. 槐花中芦丁的碱提酸沉法研究J. 食品工业科技, 2007, 4 (1): 184-185.13 刘亚萍. 时针国药M. 2004, 15

29、 (10): 657.14 张宏志, 管正学, 王建立. 荞麦中天然芦丁的提取方法研究J. 内蒙古农牧学院学报, 1997, 18 (2): 28.15 曾昭琼, 曾和平. 有机化学实验(第三版)M. 高等教育出版社: 曾昭琼, 2000, 74-75.16 孟令芝, 龚淑玲, 何永炳.有机波谱分析(第三版)M. 武汉大学出版社: 詹锦玲, 2009, 243-249.致 谢“宝剑锋从磨砺出，梅花香自苦寒来”，回首近四年的大学生活，我们收获了很多。在大学阶段，我在学习上和思想上都受益非浅，这除了自身的努力外，与各位老师、同学和朋友的关心、支持和鼓励是分不开的。四年的学习，随着本次论文的完成，也

30、将划下完美的句号。值此论文顺利完成之际，我首先要向我尊敬的导师胡浩斌老师表达深深的敬意和无以言表的感谢。从课题选择到准备和进行实验，再到具体的完成论文的过程，都凝聚着老师的心血和汗水。老师要指导很多同学的论文，加上本来就有的教学任务和科研项目，工作量之大可想而知，老师还在百忙之中抽出大量的时间来指导我们。他循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪，他渊博的专业知识，精益求精的工作作风，严以律己、宽以待人的崇高风范，将一直是我在工作、学习中的榜样。在我的毕业论文写作期间，老师的悉心指导、耐心教导使我的论文顺利完成。同时，论文的完成，离不开其它各位老师、同学和朋友的关心和帮助。在整个论文的写作中，各位老师、同学和朋友积极的帮助我查阅相关资料并提供大量有利于论文写作的建议和意见，让我掌握了毕业论文写作的基本过程。在他们的帮助下，论文才得以不断的完善。书到用时方恨少，在这篇论文的写作过程中，我深感自己的知识水平还很欠缺，所以在今后的生活中，无论我们是否还在校园，都要抱着活到老学到老的心态不断地完善自己，提升自己的知识水平。最后，我要感