CB发育与生殖相关的小分子化合物库及相关技术平台的建立Word文档下载推荐.docx

1、能否应用小分子化合物维持干细胞全能性、诱导干细胞定向分化及体细胞重编程是本项目拟解决的一个关键科学问题。要解决这个问题我们需要建立具有一定结构多样性及靶标针对性的小分子化合物库及灵敏、稳定的活性鉴定和筛选模型。2. 干细胞调控相关的小分子化合物库的建立。利用筛选模型，通过对化合物库的高通量筛选是获得具有生物活性的小分子化合物的有效途径。国内也有单位进行类似筛选以获得小分子药物先导化合物。但目前国内的化合物库容量比较小，而且化合物挑选也是随机进行，因此活性化合物的命中率非常低。国际上目前已开发出针对一类配体的化合物库，如针对G蛋白偶联受体、核受体、离子通道或激酶的化合物库，但针对干细胞调控的小分

2、子化合物库尚未报道。因此干细胞调控相关的小分子化合物的挑选及库的建立也是本项目拟解决的一个关键科学问题。我们将通过生物/化学信息学及计算生物学，建立虚拟筛选平台，挑选可能与干细胞调控关键蛋白或通路有相互作用的小分子化合物或天然产物，用于活性研究；另我们也将建立合成平台，对已有报道的或我们筛选发现的活性化合物进行结构改造和修饰，合成衍生物库，用于活性筛选。通过化学与生物学的结合建立干细胞调控相关的小分子化合物库。3. 干细胞自我更新、定向分化及体细胞重编程模型的建立。有了具有一定结构多样性及靶标针对性的小分子化合物库，还必需建立灵敏、稳定的活性鉴定和筛选模型，才能从库中发现具有干细胞调控活性的化

3、合物。因此干细胞自我更新、定向分化及体细胞重编程模型的建立是本项目拟解决的另一个关键科学问题。我们拟在已有的人、猴、小鼠胚胎干细胞系培养技术平台基础上，利用形态、标记分子、干细胞多能因子Oct4/Nanog以及细胞的表观遗传修饰状态等方面的变化来综合评价表达来评价干细胞的多能性或分化状态，从而建立活性鉴定模型。主要研究内容1. 建立生殖和发育相关特别是干细胞研究相关的小分子化合物及天然化合物库，为相关领域的科学家提供研究及活性筛选用的化合物资源：1） 通过文章、专利等检索收集已有报道的、与干细胞诱导、增值及定向分化相关的小分子化合物信息，通过购买或合成收集此类已有报道活性的化合物（70100个

4、），为科学家提供相关研究的标准化合物；2） 通过对干细胞相关信号转导通路或其中重要蛋白质的计算生物学研究及虚拟筛选，挑选并收集可能具有干细胞调控功能的天然化合物，扩充化合物库，为进一步的活性鉴定实验提供材料；3） 挑选、收集具有结构新颖性及成药性的小分子化合物扩充化合物库，为进一步的活性鉴定实验提供材料；4） 利用网络和电子技术，建立我国干细胞相关化合物资源的中心数据库系统（包括网站、综合数据库和多层多点的操作管理界面）以汇总和共享有关小分子化合物调控干细胞的信息；推广小分子化合物调控干细胞的知识、技术、操作经验等；5） 建立化合物库的管理运行规范、建立合理的化合物资源共享机制。2. 建立稳定

5、的小分子化合物调控干细胞的活性鉴定和筛选平台，研究小分子化合物在干细胞全能性维持、定向分化及体细胞向干细胞重编程方面的功能；1） 建立维持干细胞多能性小分子化合物的筛选平台：在已有的人、猴、小鼠胚胎干细胞系培养技术平台基础上，按形态、表面分子SSEA和核内因子Oct4/Nanog的表达来评价干细胞的多能性状态，通过小分子化合物对干细胞短期和长期培养的影响，来检测、验证其功能，同时检测它们对干细胞的毒性；2） 建立诱导干细胞定向分化的小分子化合物筛选平台：在已有的胚胎干细胞系培养和分化技术平台基础上，加入小分子化合物与胚胎干细胞共培养，利用各种细胞的特定分子标记建立定向分化筛选模型，从化合物库中

6、筛选出能促进或阻断定向分化过程的小分子化合物并以之为探针进行蛋白靶标鉴定和分化机制的研究；3） 建立诱导iPS的小分子化合物筛选平台：我们已利用反转录病毒导入了4个转录因子基因（Oct-4, Sox2, c-Myc和KLF4），成功地进行了人与小鼠体细胞向iPS干细胞的诱导。在此基础上，我们将通过小分子化合物的共孵育来调节转录因子对iPS的诱导效率，并逐渐利用筛选出的活性化合物替代4种转录因子中的1种到多种，最终实现完全用化合物组合高效诱导形成iPS。3. 建立化学合成平台，针对性地合成可能参与干细胞命运调控的信号通路的小分子调节剂，构建调控干细胞命运的小分子化合物库。1） 利用化学合成平台，

7、对文献报道的可有效维持干细胞自我更新能力、诱导干细胞定向分化以及成体细胞重编程的大约100个小分子化合物开发有效的化学合成方法并完成其化学合成，每个化合物合成200mg，为干细胞命运调控研究提供标准化合物；2） 在对文献报导的或筛选获得的可有效调控干细胞命运的小分子化合物合成的基础上，对它们的进行比较系统的结构多样化改造，初步构建一个约有25003000个小分子化合物的小型定向化合物库，为进行可调控干细胞命运的小分子化合物的筛选提供初步的重要物质基础；3） 一些调控细胞生长、增殖等信号转导通路如MAPK、Hedghog、Notch、致死因子（Death receptor）/NFB、Akt、Wn

8、t和蛋白激酶/磷酸酶等信号通路在干细胞的自我更新、定向分化中也起着重要的调节作用。我们将以已有文献报道的且有代表性而尚未商业化的这些信号通路的小分子调节剂为基础，对它们进行有效的化学合成并进行结构多样化改造，构建信号通路导向性小分子化合物库（Signal Pathway Oriented Chemical Library, SPOCL。二、预期目标总体目标本项目总体目标是联合国内干细胞研究、天然产物化学及有机合成的主要力量，优势集成，技术互补，建立能满足发育与生殖领域基础与应用研究需求，特别是干细胞重编程、全能性维持及定向分化研究相关的小分子化合物与天然产物库，以及相应的合成平台、活性鉴定与筛

9、选平台；并通过对小分子化合物在干细胞信号通路中的活性鉴定和筛选，寻找可以维持干细胞全能性、定向诱导干细胞分化或诱导体细胞向干细胞重编程的化合物组合。通过本项目的实施，我们将整合国内现有的主要干细胞研究、药物化学、天然产物化学及计算化学的力量，在项目实施的5年内，分阶段地建立起全国共享的发育与生殖及干细胞研究相关的化合物库及活性鉴定和筛选平台，建立和完善化合物库的管理运行规范和资源共享机制，向国内相关研究同行提供干细胞研究相关的小分子化合物、信息（数据库和网站）和技术的支撑等；同时，培养一批高水平研究人才，推动我国在小分子调控发育与生殖以及诱导干细胞领域的发展。五年预期目标：1. 小分子化合物库

10、的建立：建成总量为2500030000个化合物的小分子化合物库用于发育与生殖领域特别是干细胞调控方面的研究，建立化合物库的管理运行规范、建立合理的化合物资源共享机制。库中主要包括5类化合物：a） 第一类是已有报道的与干细胞调控通路相关的活性化合物，大约70100个，将作为干细胞研究的标准化合物；b） 第二类是天然小分子化合物单体（3000个）；c） 第三类是经标准程序提取的中草药组分（2000个）；d） 第四类是具有新颖结构的合成小分子化合物（20000个）；e） 第五类是已有报道的活性化合物和通过我们筛选获得的活性化合物的衍生物（3000个）。2. 干细胞调控相关蛋白或信号通路的虚拟筛选平台

11、的建立：根据与干细胞多能性维持、定向分化及体细胞重编程相关的蛋白、信号通路及调控网络，建立干细胞形成和分化相关的蛋白质结构数据库SCRPD （Stem Cell Related Protein Database），建立和完善天然产物数据库CNPD （Chinese Natural Product Database）。应用化学信息技术、生物信息技术和计算机虚拟筛选方法，针对SCRPD中的所有蛋白质结构，搜寻CNPD数据库，获得具有调控干细胞形成或分化的天然产物信息。根据上述计算结果，收集天然产物样品，并为活性化合物的结构改造提供依据。3. 干细胞调控相关的小分子活性检测平台的建立：建立干细胞自我

12、更新、定向分化及体细胞重编程三个活性筛选平台，建立9-12种可用于高通量筛选的干细胞或分化细胞株，三个筛选平台中每个平台拥有3-4种稳定细胞株。通过上述平台筛选并验证能影响这些过程的小分子化合物，筛选出10-15个能有效影响干细胞多能性与自我更新的小分子化合物，10-15个能有诱导或阻断细胞定向分化的化合物，8-10个能促进或抑制iPS效率的小分子化合物，8-10个能激活iPS关键基因或其下游基因的小分子化合物，3-5个能部分或完全替代iPS中4个转录因子的小分化合物。并以筛选到的小分子化合物为探针找出35个与干细胞多能性和细胞定向分化相关的靶标蛋白，并进行深入的研究干细胞自我更新、定向分化和

13、重编程的分子机理，争取实现化学方法诱导iPS。4. 活性小分子有机合成及结构改造平台的建立：对文献报道的可有效维持干细胞自我更新能力、诱导干细胞定向分化以及成体细胞重编程的大约70100 个小分子化合物开发有效的化学合成方法并完成其化学合成，为干细胞命运调控研究提供标准化合物；另通过对上述活性化合物的结构优化改造，构建一个约有25003000个化合物的小型定向化合物库，为进行可调控干细胞命运的小分子化合物的筛选提供初步的重要物质基础；另针对性参与干细胞命运调控的信号通路，合成其中有代表性而尚未商业化的小分子调节剂并进行结构多样性改造，构建信号通路导向性小分子化合物库（Signal Pathwa

14、y Oriented Chemical Library, SPOCL）。5. 干细胞相关化合物资源中心数据库的建立：利用网络和电子技术，建立我国干细胞相关化合物资源的中心数据库系统（包括网站、综合数据库和多层多点的操作管理界面）以汇总和共享有关小分子化合物调控干细胞的信息；推广小分子化合物调控干细胞的知识、技术、操作经验等。6. 技术服务和支持：保障发育与生殖研究的国家重大科学研究计划顺利完成；向全国相关同行提供用于干细胞研究的小分子化合物、信息和技术支撑；在服务方式上采取多样化模式以满足不同研究机构和科学家的需要，如：单纯提供标准化合物、提供用于活性筛选的化合物、提供小分子化合物对干细胞调控

15、作用的活性筛选服务、对用户的研究方案提供咨询或根据研究需要提供技术方案、受用户委托完成新技术的开发等等。7. 预期在小分子化合物建库及活性筛选的过程中将有20-30篇研究论文发表在有一定影响的国际期刊上。8. 在干细胞相关研究领域培养高水平的科研队伍，包括：博士后（5人）、博士研究生（20-30人）、硕士研究生（20-30人）、技术员约10人。三、研究方案学术思路： 干细胞已成为发育与生殖领域研究的重点，其根本原因是干细胞和干细胞技术为人类战胜难治疾病、健康长寿地生活带来了巨大的希望。国际上干细胞研究正在进入一个新的发展阶段，其中有关体细胞重编程为胚胎干细胞、胚胎干细胞的体外全能性维持以及胚胎

16、干细胞的定向分化是干细胞研究中几个热点问题。小分子化合物由于其结构多样、质量易控和可口服利用等特点一直是新药及工具药的重要来源。而小分子化合物参与干细胞调控的研究目前在国际上虽处于起始阶段，但必将在不远的将来取得重大突破。我国有着丰富多样的天然化合物资源，应及早开展小分子化合物在发育与生殖领域及干细胞诱导、全能性维持和定向分化方面的研究和应用，使我国在上述领域的研究处于国际前沿地位。本项目将建立国家干细胞调控相关的小分子化合物及天然产物库以及相应的合成、活性鉴定与筛选平台，制定相应的硬件标准、技术指标、管理规范，确保资源的共享，以推进我国在小分子调控发育与生殖以及干细胞调控领域的研究。我们将首

17、先建立能调控干细胞命运的小分子化合物库，为后续筛选工作提供充足的实验对象；同时建立干细胞多能性、定向分化和体细胞重编程三个方向的化合物筛选模型，验证筛选出的活性化合物，并寻找相应靶点；然后运用这些化合物研究干细胞多能性维持、定向分化和体细胞重编程的分子机制，为筛选模型的改进提供理论依据。1. 建立调控干细胞命运的小分子化合物库建立有效的筛选模型，通过对化合物库的高通量筛选是获得可以调节复杂生命活动的小分子化合物的有效途径。这种策略的有效性很大程度上依赖于化合物库的质量。很自然地，化合物库的容量越大，其中的化合物的结构多样性越高，化合物库的质量就越高，进而通过筛选获得活性化合物的几率就越大。但由

18、于有机化合物的结构千变万化，没有任何一个化合物库可以涵盖所有的小分子化合物。另一方面，化合物产生生物学效应必须与特定的生物靶点相互作用，而化合物必须具备一定的结构特点才能够与相应的生物靶点作用。因此，通过随机合成的方法虽能够快速构建具有一定库容量和结构多样性的小分子化合物库，但试图从中获取生物活性分子的几率却微乎其微。在构建化合物库时，所选化合物结构上与潜在靶点的“匹配性”，与化合物的结构多样性及库容量相比显得更为重要。因此，在小分子化合物库构建时，我们首先将通过生物信息学及计算生物学寻找已知的可以调控胚胎干细胞自我更新和定向分化的小分子化合物的结构特点，并结合它们已经证实或潜在的生物靶标的特

19、点，保证它们在分子结构的“匹配性”。将以这些已知小分子为基础定向改造出的新化合物，或通过虚拟筛选获得的可能与干细胞调控蛋白相互作用的小分子化合物组成一个新型小分子化合物库用于干细胞调控活性的筛选，获得活性化合物的几率会非常大。1） 化学信息及计算生物学平台的建立：，建立和完善天然产物数据库CNPD （Chinese Natural Product Database），建立干细胞形成和分化相关的蛋白质结构数据库SCRPD （Stem Cell Related Protein Database）。根据上述计算结果，收集天然产物样品，建立干细胞调控活性天然产物库，并为活性化合物的结构改造提供依据。2

20、） 有机合成平台的建立：先针对已报道的可有效调控干细胞自我更新和定向分化的非商业化小分子化合物（约100个）开发有效的合成方法进行化学合成，为干细胞命运调控研究提供标准化合物。在此基础上对这些化合物的结构进行比较系统的多样化改造，初步构建一个约有30004000个小分子化合物的小型定向化合物库，为进行可调控干细胞命运的小分子化合物的筛选提供初步的重要物质基础。以可以有效维持胚胎干细胞的自我更新和增殖能力的p38抑制剂SB203580（图二）为例，我们可以有效地以该化合物地结构为基础衍生出Group 1 - Group 8等一系列具有结构相关性，但有可能作用于不同生物靶标的小分子化合物亚库。而这

21、一个个小分子化合物亚库就构成了可调控干细胞命运的定向小分子化合物库。我们还将针对在干细胞命运调控过程能够发挥重要作用的一些关键调节因子如Hedghog 信号通路、Notch 信号通路、致死因子（Death receptor）/NFB 信号通路、Akt 信号通路、Wnt 信号通路和TGF生长因子信号通路等，定向地以已经报导的这些信号通路的小分子调节剂为基础，构建它们导向性的小分子调节化合物库（约5001000个化合物）。图三为针对这些信号的部分已知小分子调节剂：另外，与其它几乎所有的信号转导过程一样，细胞的命运调控过程中也可能包含蛋白激酶/磷酸酶调控的大量功能蛋白磷酸化/去磷酸化过程。因此，我们

22、将首先将完成这些已知的有代表性的蛋白激酶/磷酸酶小分子抑制剂的合成，同时并较为系统地分析已知的蛋白激酶或磷酸酶小分子抑制剂地结构特点，找出最常见的分子骨架，并以这些分子骨架为模板，通过不同的结构修饰构建较为系统的蛋白激酶和磷酸酶抑制剂小分子化合物库（约10002000个化合物）。通过分析，我们发现已有的蛋白激酶小分子抑制剂在分子结构上主要集中在以下几种类型（图四），因此，我们可以以这些分子骨架为基础，对它们进行较为系统的结构改造，增强化合物的多样性，构建有针对性的蛋白激酶抑制剂类新型小分子库。为干细胞自我更新和定向分化研究提供重要的小分子探针和研究工具。2. 调节和维持干细胞多能性的小分子化合

23、物筛选和验证平台的建立胚胎干细胞拥有一个庞大而精确的分子调控网络来维持其不分化状态，目前的研究成果在还不能充分解释这个庞大的网络。当传统分子生物学手段不能对如此庞大的网络进行有效率的研究时，最需要的就是利用交叉学科以及引入新的研究方法和技术。所以我们计划构建针对干细胞多能性相关的不同信号通路的小分子化合物库，为化学生物学方法研究干细胞多能性提供充足的研究对象。而稳定的、可以用于高通量筛选的细胞体系的建立和验证平台是对小分子化合物库进行筛选和确认的重要基础条件。这方面我们将开展以下几个方面的工作，来保障未来相关工作的顺利进行：1） 建立稳定的、可进行高通量筛选的干细胞模型：a） 收集和建立基于形

24、态学和基于报告基因的干细胞筛选体系：基于形态学的主要检测指标包括干细胞形态检测，干细胞多能性基因Oct4表达的检测，重要标记物SSEA1和AP的检测。我们还会利用Oct4GFP的OG2转基因鼠的干细胞可用于小分子化合物的筛选。因为这种细胞系具有的EGFP片段在18kb的Oct4的基因调控片段调控下表达GFP，可以用来监测多能性标记Oct4的表达情况，同时干细胞形态的变化与GFP表达保持一致，这些指标可以用来作为小分子化合物调控干细胞自我更新与分化的一个重要检测指标。b） 干细胞高通量筛选体系的优化：化合物筛选过程中，对细胞的状态要求比较严格。细胞的状态，密度，培养方式，培养条件均会影响筛选的结

25、果。如：在筛选过程中化合物会与培养基中的血清和其他细胞因子的成分相互作用，影响筛选的效果和真实性。因此，干细胞培养体系的优化和标准化对于小分子化合物的筛选十分重要。另干细胞是一种特殊的细胞，具有分化和自我更新的双重功能。如鼠的干细胞需要依赖LIF（白血病抑制因子）或Feeder（滋养层细胞）来维持其不分化的状态。因此，利用干细胞作为高通量筛选的载体研究小分子化合物对自我更新的影响，需要设立较为可信的阴性和阳性对照条件和鉴定假阳性的标准，以获得可信的筛选结果。我们已经具备了一套完整的细胞形态/表面分子/特异基因表达等标准，来保证筛选过程中，阳性与阴性结果的确立。2） 建立小分子化合物筛选结果的验

26、证与确证体系：对于促进自我更新的小分子化合物来说，经过筛选的细胞需要对其多能性标记进行检测，并对EB形成，畸胎瘤形成能力和嵌合鼠等方面进行一系列验证，确认可以保持的干细胞的多能性和自我更新能力，且化合物在干细胞水平没有致癌。致畸和致突变的作用。主要的技术手段包括分子生物学、细胞生物学和动物胚胎操作，我们在这方面的工作已经积累了相当的经验。3） 小分子化合物调节或维持干细胞自我更新能力的靶点、生物活性和调控机理：本项目中，我们会尝试采用不同的方法来验证化合物作用的靶点。其中包括：a.亲和色谱法来验证化合物作用的干细胞靶向蛋白。b.通过研究化合物对主要信号转导通路上的基因表达的影响，鉴定出化合物作

27、用的靶点。c.我们还可以通过采用小分子化合物探针筛选蛋白库或结合cDNA和RNAi文库来为找到化合物作用的靶点。我们将进一步研究这些靶点，在干细胞自我更新调控网中的作用，发现一批能调控胚胎干细胞多能性的新基因、新的信号通路。靶蛋白在干细胞多能性相关的信号转导途径的存在形式，调控因素及功能等。因此这些靶蛋白的出现，将为干细胞多能性和自我更新机制的研究积累重要的研究线索。3. 干细胞体外定向分化的小分子化合物筛选平台由于干细胞能被定向的诱导分化为生物体内任一细胞类型，根据已有文献报道，小分子化合物可以诱导干细胞定向分化为神经细胞、心肌细胞、内皮细胞、胰岛细胞、脂肪细胞等。而干细胞向脂肪细胞定向分化

28、是一个相对比较成熟的体系，同时脂肪细胞具有明确的特异性的分子标记物，我们将以干细胞向脂肪细胞的定向分化作为研究切入点，建立影响其分化过程的细胞筛选平台，筛选能诱导定向分化的活性小分子，并寻找其作用靶点，研究分化机理。具体研究方案如下：1） 构建分化细胞特异性基因-报告基因偶联载体：我们拟分别将脂肪前体细胞特异的标志基因ALBP（adipocyte lipid-binding protein，AP2）的启动子（promotor）与新霉素抗性基因（Neomycin）融合，以及脂联素（adiponectin）的启动子与荧光素酶基因（luciferase）融合。利用前一报告载体，可通过新霉素抗性筛选，

29、定性的检测脂肪前体细胞的形成；利用后一报告载体，可通过定量检测荧光素酶的活性，定量的检测脂肪细胞的分化程度，从而筛选促进或抑制脂肪细胞终末分化的小分子化合物。2） 构建AP2-Neo和pAdiponectin-Luc AP2-Neo稳定细胞株：将上述两个报告基因载体转染ES细胞，筛选获得稳定细胞株。将上述稳定细胞株经RA处理2-5天，检测其新霉素抗性，从而验证该细胞系用于进行脂肪前体细胞的筛选的可行性；再用分化培养液（胰岛素）处理该前体细胞系，检测其荧光素酶的表达强度，从而验证该细胞系用于进行脂肪细胞的成熟分化的筛选的可行性。3） 筛选促进或阻断细胞定向分化过程的小分子：用RA作阳性对照，从构

30、建的小分子化合物库中筛选能诱导iPS细胞向脂肪前体细胞分化的小分子。首先通过报告基因的检测进行筛选，再结合形态学观察、油红染色、RT-PCR，Western Blotting等技术手段进一步确认是否有脂肪细胞分化形成；以RA处理iPS细胞2-5天，待细胞成为脂肪前体细胞后，以分化培养液为阳性对照，从构建的小分子化合物库中筛选能诱导或抑制脂肪前体细胞向成熟脂肪分化的小分子。首先通过报告基因荧光素酶的检测进行筛选，再结合形态学观察、油红染色、RT-PCR，Western Blotting等技术手段进一步确认是否有脂肪细胞分化形成。4） 鉴定活性小分子的靶标：在获得可以影响iPS细胞向脂肪细胞分化的小分子化合物后，为鉴定小分子的靶标，我们将根据该小分子的化学结构将其共价偶联于合适的固相载体上（如琼脂糖亲和介质），为避免非特异性吸附，同时将该小分子的无活性的类似物也偶联在固相载体上，作为阴性选择物。将前述阴性选择物先与细胞裂解液结合，排除非特异性结合，然后将处理后的细胞裂解液与目标小分子进行亲和结合，并最终通过质谱方法鉴定与该小分子特异性结合的靶蛋白。4. 筛选对iPS有影响的小分子化合物，研究iPS的分子机理我们计划建立多种筛选体系，筛选出能影响