课题申请书淫羊藿的炮制机理Word格式.docx

1、马聘等5的研究表明草乌用新方法炮制后具有对心律影响小、毒性低等优点。总之，目前中药炮制机理研究主要通过炮制前后药物有效成分含量或溶出量增加、与治疗无关的成分的减少和药材中所含酶的活力的破坏以保留有效成分等化学成分变化的角度和炮制前后药理毒理的对比等角度来阐述。*从目前对中药炮制机理的研究现状可看出：对炮制机理阐述的过程中缺少一架沟通中药炮制前后化学成分变化与药理药效变化之间关系的桥梁中药活性成分ADME/Tox系统的研究；中药活性成分吸收与代谢是中药产生生物效应的重要环节，更是彻底阐述中药炮制机理的最佳切入点。本研究拟利用中药活性成分细胞层次的ADME/Tox系统研究中药淫羊藿的入药品种之一淫

2、羊藿（Epimedium koreanum Nakai.）的炮制机理。1.3 为了充分发挥药物的疗效，必须增加有效成分在体内的溶出度、释放度和吸收率，以提高生物利用度。然而药物在体内药效的发挥很大程度上取决于血药浓度的高低，而药物在生物体内的吸收、代谢与血药浓度的高低有密切关系。目前，口服给药在各种给药途径中占有主导地位，因此，药物的ADME/Tox系统研究是生物药剂学研究的重点之一，ADME/Tox 系统区别于以前的吸收、分布、代谢、排泄的串级研究不同在于：提取与筛选同时进行，可以全面检测和预见药物提取过程中成分及在体内吸收、分布、代谢、排泄和毒性各方面的问题；用细胞（特别是人源细胞）进行，

3、采用高通量技术6。国外对药物ADME/Tox系统（吸收、分布、代谢、排泄、毒理、药物药物之间相互作用）方面的研究非常重视，从而多种研究药物肠道吸收的生物学方法应运而生。ADME/Tox系统研究中最著名的吸收模型Caco-2模型被美国FDA认为是预测人体药物吸收的行之有效的方法，Caco-2模型辅以大鼠在体肠灌流模型可以从在体和细胞两方面全面阐述药物的ADME过程及其变化。（1）Caco-2细胞模型7Caco-2细胞来源于人体结肠腺癌细胞。由于Caco-2细胞在培养条件下可自发进行上皮样分化并可形成紧密联结,其形态学、标志酶的功能表达及渗透特征与小肠类似, Caco-2细胞模型可作为研究小肠表皮

4、细胞药物转运和代谢的体外模型。其优点为:省时、可测定药物的细胞摄取及跨膜转运、Caco-2细胞内有药物代谢酶,可在代谢状况下测定药物的跨膜转运、Caco-2细胞与小肠上皮细胞近似、Caco-2细胞易于培养且生命力强、Caco-2细胞来源是人结肠癌细胞,同源性好，可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别。Caco-2细胞模型的基本特点Caco-2细胞系结构和生化作用类似于人小肠上皮细胞,含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系,与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现逆向分化（反分化）不同, Caco-2细胞在传统的细胞培养条件下,生长在多孔的可渗透的聚酯（Polycarbonate）膜上可达到融合并自发分

5、化为肠上皮细胞,形成连续的单层（monolayer）8。培育约10后,单层的跨膜电阻约为2600cm2,细胞密度约为0.9106细胞cm2,此时Caco-2细胞单层对漏出标志物如聚乙二醇（Mr4000）或甘露醇是不渗透的,这种性质可以维持恒定约20,由于Caco-2细胞性质类似小肠上皮细胞,因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验9,10。Caco-2细胞模型的药物转运机理在Caco-2细胞模型中,药物的转运过程为:药物分子从Caco-2单细胞层的顶侧肠腔侧（侧）跨过Caco-2单细胞层或经由细胞间隙到达基底侧（侧）。药物跨过肠上皮有4条途径:被动转运;胞旁转运;载体介导转运;胞饮。（2）在体

6、肠灌流模型特点：保证了肠道神经以及内分泌输入的完好无损,同时也保证了血液及淋巴液的供应,提高了生物活性。在该模型中还可测定肠道代谢物。该法既可从肠腔取样,又可从血液中取样。虽然这些研究常在麻醉的小动物上进行,但借助肠插管,非麻醉的实验动物及人体的灌流研究亦可进行11。在体肠道灌流不仅提供了较高的组织活性,而且提供了额外的取样部位。已经建立了鼠肠原位灌流实验取得的药物肠道渗透率同人体研究中口服给予药物溶液后吸收的药物量之间的关系。Hu M.等学者采用Coca-2和肠灌流模型等方法对黄酮和类黄酮成分的吸收与代谢进行了研究1219；研究结果表明1923：黄酮苷类化合物在肠道中降解成苷元再吸收，而淫羊

7、藿苷主要是以它的次级鼠李糖苷形式吸收。类黄酮的吸收与代谢途径可归纳为 Fig 1。*淫羊藿为传统补肾中药，在民间沿用已有千年历史，具补肾阳，强筋骨，祛风湿功效。临床常用于阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛等证。淫羊藿中含多种黄酮类成分，目前研究证明24：淫羊藿总黄酮为淫羊藿主要活性成分。淫羊藿总黄酮在心血管系统、中枢神经系统、血液系统、免疫系统、抗炎、抗骨质疏松、抗衰老、抗肿瘤等25方面取得较大的进展。临床常见的淫羊藿炮制品有淫羊藿、羊脂炙淫羊藿、盐淫羊藿和酒淫羊藿等。目前对淫羊藿的炮制研究主要有以下两个方面：（1）炮制前后黄酮类等化学成分的变化陈惠玲等26采用紫外分光光度法测定粗毛淫羊藿生品及4种

8、不同炮制品中总黄酮的含量，总黄酮含量由高到低顺序为：生品清炒品酒炙品盐炙品羊脂炙品。（2）炮制前后药理、药效的变化淫羊藿炮制后对心血管、中枢神经系统等方面药理、药效较生品有显著提高，故历代临床用药均以炮制品为主。淫羊藿炮制品中总黄酮含量低于生品,而临床用药历代均以炮制品为主，且认为淫羊藿炮制后药效较生品有显著提高。因此从淫羊藿炮制前后化学成分变化的角度并不能解释其炮制机理；对炮制后其药效的增强也缺乏令人信服的阐述，即只知其然而不知其所以然。淫羊藿炮制品中总黄酮含量低于生品,而临床用药历代均以炮制品为主，即其炮制品药效较生品有显著提高，因此我们的假说为：淫羊藿的炮制机理是：淫羊藿炮制后能被机体吸

9、收的黄酮含量相对增加；中药经过炮制，可提高活性成分的吸收，从而达到增强其药效之目的。即该研究试图从活性成分ADME/Tox层次阐明淫羊藿的炮制机理，以期填补国内目前中药炮制机理研究领域的一个空白。中药炮制的科学研究起步较晚，许多炮制经验，只知道炮制后可以降低毒性、可以增强疗效，但对减毒或增效的物质基础及炮制机理却长期处于无知状态，即只知其然而不知其所以然。目前对中药炮制机理的阐述只是停留在该过程的两端即化学成分的变化和药理药效的变化，而对阐明炮制机理的关键环节炮制前后中药活性成分的吸收等研究不够深入，本课题拟从更深层次上阐明中药炮制机理，同时为制定合理的炮制工艺和质量标准提供科学依据，为中药现

10、代化、国际化做出更大贡献。 参 考 文 献1.叶定江主编.中药炮制学M.上海:上海科学技术出版社,1996:82.蔡宝昌等.马钱子不同炮制品中总生物碱的测定及急性毒性试验的比较.中国中药杂志，1994,19（10）:5983.蔡宝昌等.炮制对马钱子中马钱子甙的影响.中国中药杂志,1994,19（6）:3464.蔡宝昌等.马钱子中16个生物碱类化合物13CNMR谱的数据分析.药学学报,1994,29（1）:445.马聘,蔡宝昌,陈龙.草乌几种炮制品的毒性实验比较.中国中药杂志,1994,19（4）:2166. 王夔主编.中药研究现代方法学M.北京：化学工业出版社，2004：67.杨海涛，王广基，

11、Caco-2单层细胞模型基其在药学中的应用，药学学报，2000,35（10）,797-800.*,robeitAC,PhilipSB.Caco-2 cell monolayers as model or drug transport across the intertinal mucosaJ.Pharm Res ,1990,7（9）:902.* Ij Raub Tj,Borchardt RT.Characterization of the human colon carcinoma cell line（Caco-2） as a model system for intestinal epith

12、elial permeabilityJ.Gast*,DhirenRT,Applications of the Caco-2 model in the design and development of orally actived drugs;elucidation of biochemical and physical barriers posed by the intestinal epitheliumJ.Adv Drug Deliv Rev,1997,23（1）:77.* H Ahrenstedt O.Hallgren R,et al .Reginal jejunal perfusion

13、,a new in vivo approach to study oral drug absorption in manJ.Pharm res,1992,9:1234.* M,Chen J,Lin H.Disposition of Flavonoids via Recycling:Mechanistic Studies of Disposition of Apigenininthe Caco-2 Cell Culture Model.J.Pharmacol.Exp.Therap, 307（1）314-21,2003b* M,Sinko,PJ,DeMeere,ALJ,Johnson,DA and

14、 Amidon,GL Membrane permeability parameters for some amino acids and -lactam antibiotics:appliction of the boundary layer approach.J. Theor.Biol.,131,107-114,1998* M,Roland,K,Ge,L,Chen,J,Tyle,P,and Roy,S.Determination of AbsorptionCharacteristics of AG337,A Noel Thymidylate Synthase Inhibitor,Using

15、a PerfusedRat Intestinal Model.J.Pharm.Sci.,87,886-890,1998* M,Chen Z,Zheng L.Functional and molecular characterization of rat intestinal*.,e-pub ahead of print publication,2003a*,Y.and Hu,M.Absorption and Metabolism of Flavonoids in the Caco-2 Cell CultureModel and a Perused Rat Intestinal Model.Dr

16、ug Metab.Disp.30:370-377,2002*,Y.Liu Y,Dai,Y,Xun,L and Hu M.Enteric Dispostion and Recycling of Flavonodisand Ginkgo Flavonodis.J Altern.Complement.Med.,9（5）:631-640,2003*,Penman,BW and Hu M.The Development of Caco-2 Cells Expressing HighLevels of cDNA-Derived Cytochrome P4503A4.Pharm.Res.13,1635-16

17、41,1996.* J,Lin H,Hu M.Metabolism of Flavonoids via Enteric Recycling:Role ofIntestinal Dispostion.J.Pharmacol.Expt.304:1228-1235,2003* K,Nakada Y,Suziki A,et al.Biliary metabolites of hesprrein in rats.Shoyakugaku Zasshi,1993,47:43* T,Kano Y,Saito K,et al.Urinary and biliary metabolites of daidzin

18、anddaidzein in Rats.Biol Pharm Bull,1994,17:136922.李枫,刘永.宝藿苷-I,VI,VII和宝藿素的分离和结构研究.药学学报,1998,23:73923.邱峰等.淫羊藿苷在大鼠体内的代谢.药学学报,1999,34（3）:22222624.欧阳军,欧阳红.淫羊藿化学成分及药理研究的新探讨.中国民族医药杂志,1997,S1:15825.许碧连,吴铁,王晖.淫羊藿总黄酮药理作用的研究现状.中国临床药理学与治疗学,2003,8（1）:11526.陈惠玲等.粗毛淫羊藿及其不同炮制品中总黄酮的含量.中国中药杂志,2000,25（4）:2392.项目的研究内容

19、、研究目标,以及拟解决的关键问题。*研究目标：从中药活性成分吸收的角度阐明淫羊藿的炮制机理。本研究选择淫羊藿（Epimedium koreanum Nakai.），利用ADME/Tox系统研究单体活性成分Epimedin A、Epimedin B、Epimedin C、Icariin 、Baohuside 的吸收、代谢机理与动力学及淫羊藿炮制品的标准提取物中这5个主要活性成分的吸收与代谢及其相互作用。*研究内容：淫羊藿中含有多种化学成分，黄酮类成分是其主要活性成分，本研究拟选用淫羊藿的入药品种之一淫羊藿（Epimedium koreanum Nakai），对其中的5个黄酮单体活性成分及淫羊藿（

20、Epimedium koreamum Nakai）炮制品的标准提取物中这5个主要单体活性成分的吸收与代谢及其相互作用进行研究。结构式如下：R1 R2 Compound 1. rhaglc glc Epimedin A（朝藿定A）2. rhaxyl glc Epimedin B（朝藿定B）*rha glc Epimedin C（朝藿定C）* glc Icariin（淫羊藿苷）* H Baohuside （宝藿苷）（1） 淫羊藿黄酮类成分的HPLC和LC-MS的分析方法：建立Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、Baohuside的HPLC分析方法

21、，并用LC-MS，LC-MS-MS等分析手段对标准提取物中其他成分进行峰归属。（2） HPLC测定淫羊藿不同炮制品标准提取物中Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、Baohuside五个单体活性成分的含量变化。（3） 利用ADME/Tox系统研究Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、Baohuside五个单体活性成分的吸收与代谢机理、动力学、毒理学、药物药物之间相互作用（4） 研究比较生品与羊脂炙炮制品的标准品提取物中，上述5个黄酮单体活性成分（Epimedin A、 Epimedin B 、E

22、pimedin C、Icariin 、Baohuside）的吸收与代谢机理及其相互作用。 *拟解决的关键问题：淫羊藿经炮制后总黄酮含量降低，但是历代临床用药却以炮制品为主，本研究拟采用ADME/Tox系统研究淫羊藿炮制品中黄酮类成分的吸收与代谢，试图从中药活性成分吸收的角度阐述炮制的机理：炮制可提高中药活性成分的吸收。3.拟采取的研究方案及可行性分析*技术路线淫羊藿药材品种鉴定炮制品制备（盐炙、酒炙、羊脂炙）HPLC测定炮制品中5个黄酮单体（Epimedin A、 Epimedin B 、Epimedin C、Icariin 、Baohuside）的含量LC-MS、LC-MS-MS等技术对标准

23、提取物中其它黄酮类成分进行成分归属5个黄酮单体（同上）的吸收与代谢动力学淫羊藿生品与羊脂炙品标准提取物中5个黄酮单体的ADME/Tox系统研究*研究方法及实验手段：（1）HPLC、LC-MS分析方法：条件：色谱柱：C18柱（4.6150，5um）；流动相：A（0.5%冰醋酸溶液）,B（乙腈）；B相浓度梯度洗脱：020min （25%B），2045min（25%35%B）；流速:1.0 ml/ min ；检测波长:272 nm；进样量:20ul。（2）Caco2细胞模型研究黄酮成分的吸收代谢： Fig2 Caco-2 model细胞培养：Caco-2细胞种植于transwell上，种植密度为（1

24、00,000细胞/cm2），培养基为含有10小牛血清的DMEM溶液，细胞在37的CO2培养箱中培养，隔一天更换培养液，单层细胞于1921天左右分化形成，即可用于试验。实验过程：37下用PH7.4的HBSS将单层细胞冲洗3次，测量跨膜电阻，弃去跨膜电阻值小于500ohmscm2的细胞。细胞在缓冲液中孵育1h后吸走孵化介质，在细胞层的绒毛面（AP）加入含有待试药物的溶液，随后发生一系列的跨膜转运。AP侧底液于开始和结束时取样两份，BL侧底液每隔30min中取样400ul，并补充同体积空白底液保持BL侧体积恒定。在每份样品中加入50ul溶液（乙腈:冰醋酸94:6，其中含作为内标物的100uM睾丸酮）

25、，混合物离心（13,000rpm）8分钟，上清液用HPLC法分析。（3）大鼠在体单向肠灌注模型研究黄酮成分的吸收代谢：方法：麻醉动物,打开腹腔, 靠近十二指肠处插入胆汁导管，分别在the duodenum；the jejunum；the terminal ileum；the colon两端插管, 实验时用等渗生理盐水浸渍的纱布覆盖于肠组织表面以保湿，用等渗生理盐水冲洗肠内容物后换灌流液,用一恒速泵灌流肠腔, 泵的流速为0.191ml/min。每隔30min收集出口管中灌流液，灌注前收集一次胆汁样品（约0.4ml），随后每隔30min收集一份，灌注后测量小肠的长度。出口管中药物浓度用HPLC检测

26、。胆汁样品用缓冲液按（1:10）比例稀释，加入葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶，反应6h，释放出苷元，供HPLC检测。 （4）微粒体：肠微粒体制备：大鼠禁食24h，不禁水，注射苯巴比妥钠（200mg/kg）处死，切开8只鼠的小肠部分，按照以下的方法分离：小肠部分（始端10cm作为 十二指肠；末端10cm作为回肠；其余的作为空肠）；大肠部分（盲肠弃去，结肠用于微粒体制备）。集中八只鼠肠的相同部分，每段用冰冷的溶液（冰盐水加二硫基丁二醇1mM）清洗。纵向切开各部分肠，洗去排泄物，放置于冰冷溶液A8 mM KH2PO4, 5.6 mM Na2HPO4, 1.5 mM KCl, 96 mM NaCl, 27 m

27、M sodium citrate, and 0.04 mg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride （PMSF）中,用溶液A清洗两次，将刮出的粘膜细胞放进溶液B（8mM KH2PO4, 5.6 mM Na2HPO4, 1.5 mM EDTA, and 0.5 mM dithiothreitol and 0.04 mg/ml PMSF）中，收集细胞，在900g转速离心5分钟，用12ml均匀的缓冲液洗两次（PH7.4mM KH2PO4,250mM 蔗糖，1mM EDTA，0.04mg/mlPMSF）将细胞重新悬浮于2ml上述缓冲液中，用电动匀浆机使均匀化，经15min低速

28、离心（15,000g，4），上清液用巴氏吸管吸走，脂肪层和碎片弃去。微粒体再经高速离心（60min，4，90,000g，）将所得微粒体悬浮于250mM 蔗糖溶液中，分装于微量离心管中，80下保存备用。肝微粒体制备：切除麻醉成年雄性SpragueDawley大鼠新鲜肝脏，放于冰冷盐溶液中，称重，切碎，在冰冷缓冲溶液（50mM PH7.4磷酸钾缓冲液，250mM蔗糖，1mM EDTA）中用电动匀浆机搅匀，离心（77,000g，15min，4），收集上清液，离心（18,500g，15min，4）弃去沉淀，上清液再离心1h（85,600g，4），产生微粒体。将所得微粒体悬浮于250mM 蔗糖溶液中，分装于小瓶中（0.5ml/瓶），80下保存备用。以小牛血清蛋白作为标准用BioRad分析方法检测蛋白浓度。用微粒体检测UDP-葡萄糖醛酸转移酶活性：步骤如下：（1）微粒体混合物（最终浓度大约0.05mg蛋白质/ml），MgCl2（0.88mM）,葡糖二酸单内酯（4.4mM）；丙甲素（0.022mg