蒽酮比色法测总糖.docx

1、蒽酮比色法测总糖1姚立虎,徐茜. 蒽酮比色法测食品总糖含量的简化研究J. 食品工业 992,03:40-42.1. 2试剂 0. 1 mg / mL, 1葡萄糖标准溶液:准确称取10mg葡萄糖标准品溶于少量蒸馏水中，溶解后转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL. 蒽酮硫酸溶液:准确称取蕙酮50 mg于100mL二烧杯中，加入蒸馏水25 mL,，缓慢加入98%质量分数)浓硫酸75 mL,，边加边搅(于冰水浴中完成)，直至蕙酮溶解，冷却至室温后使用(临用新配)。 浓盐酸、浓硫酸、NaOH，以上试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。1. 3方法1. 3. 1显色剂（蒽酮硫醇溶液）用量选择。向试管中加

2、入0. 1 mg / mL 葡萄糖标液0. 1 mL,，并加入蒸馏水至1m L,，分别加入不同量的显色剂显色测定，以0. 1 mL,蒸馏水为空白对照。1.3.2显色时间选择。向10 mL二试管中加入0. 1mg / mL葡萄糖标液0. 1 mL二并加入蒸馏水至1mL,，在冰水浴中缓慢加入9 mL显色剂摇匀，改变沸水浴时问，冷却至室温后测体系吸光度。1.3.3葡萄搪标准曲线的绘制。改变0. 1 mgmL 葡萄糖标准液和蒸馏水的用量，再分别加入9mL显色剂，进行显色测定。1.3.4正交试验确定提取条件。采用正交试验，考查4个影响因素(料液比、盐酸浓度、提取时间、水解时问)对实验的影响，因素水平见表

3、1.1.3.5水溶性总搪的提取。取0. 5 g棉花纤维于150 mL圆底烧瓶中，加入30 mL,蒸馏水，在沸水浴中加热60 mLn,滤出提取液20 mL于50 mL烧瓶中，加5 mol / L 盐酸5 mL继续在沸水浴中加热30 mLn，冷却后，滴加一滴酚酞，用5 mol / L, 1的氧氧化钠中和至中性。1. 3. 6水溶性总搪的测定。取提取液1 mL于10mL试管中，在冰水浴中缓慢加入9 mL,蕙酮硫酸溶液摇匀，在沸水浴中加热9 mLn，冷却后放置30min测定吸光度。从标准曲线上查得对应的浓度并计算总糖含量。2结果与分析2. 1吸收曲线 用紫外刊一见分光光度计在500 700 nm波长范

4、围内进行光谱扫描，结果发现在625 nm处有最大吸收，故本实验采用625 nm为测定波长。2. 2显色剂用量 由图1可以看出，当显色剂用量为9 ml二时吸光度最大，故实验采用显色剂用量为9 m l。2. 3显色时问 由图2可知，沸水浴时问在9 min内，随着时问的延长吸光度值明显增大，9 min后吸光度值减小，12 min后吸光度值基本不变，因此最佳显色时间为9 min。2. 4标准曲线 实验得到吸光度(A)与葡萄糖浓度(C)的回归方程为11=0.0401C+0.0036 ,r=0. 9994，在010mg/mL浓度范围内线性关系良好(图3)。2. 5提取条件的确定 准确称取棉花纤维，按表1的

5、提取条件提取棉花纤维中的水溶性总糖，采用1. 3. 6方法测定总糖含量，结果见表2。 由表2可见，影响总糖含量的提取条件主次关系为提取时间盐酸浓度料液比水解时问，其中提取时间对提取效果影响最明显，盐酸浓度和料液比其次，实验最佳提取条件为料液比1：30，盐酸浓度5 mol /L,水解时问30 min，提取时问60 min。2.6提取液显色稳定性 按2.5项最佳条件提取棉花纤维中的总糖，取提取液后，按1. 3. 6方法操作，分别在显色后10min，20 min，30 min， 60 min，90 min，120 min内测定吸光度，结果见图4。由图4可知，吸光度在3 0 60 min内最大且稳定，

6、以后随着时问推移下降。因此，要在提取液显色后3060 min内测定吸光度，以减少误差。2. 7方法的精密度 从表3可以看出，同一均匀样品5份，测得棉花中的水溶性总糖平均含量为7.861 mg/ g，变异系数为1.8%，说明该方法具有较好的精密度。2.8回收率实验 精密吸取己知浓度棉花总糖提取液5份，分别加入1 mg /ml葡萄糖标液0. 3 mL,制备供试溶液，按1.3.6方法操作，测定吸光度，求回收率。结果见表4。1姚立虎,徐茜. 蒽酮比色法测食品总糖含量的简化研究J. 食品工业,1992,03:40-42.2.试验方法2.1样品处理及标准溶液配制2.1.1标液制备:将葡萄糖分别配成5014

7、0ug/mL标液。吸取标液1mL加入装有8mL葱酮试剂的试管或量瓶，水浴加热后用lcm比色皿在620nm波长下比色，获得一系列E值。3结果分析与讨论3.1糖溶度与其消光值E间的关系3.1.1.对应关系:将配制的不同浓度的标液与蒽酮试剂作用，再置于620nm处比色，则得相应E值。重复试验，将测定结果列于表1，并绘制成如图1的标准曲线。从表1中看出，各组试验间的结果十分接近，绘制成标准曲线，则重复间的三条线是弥合重迭的(如图1)。对消光值与糖浓度间相关关系数进行计算，三组试验的相关系数均大于0.99，为极显著正相关。由此可以证明，糖含量与其消光值之间的关系在特定波长下是恒定的，彼此对应。找出这种关

8、系，便可在实测中省去制标准曲线的工作，从而简化蕙酮比色法测糖含量的测定工作。3.1.2。利用回归分析建立表达式将表1中糖浓度与其E值进行回归分析，获得如表2的表达式。表2中，Y=179.5X-2.74即总的回归表达式，它是三个重复的平均回归，而非回归之简单平均。此式即是用来代替标准曲线运用于实测的关系式。从三个重复的关系式可看出彼此间存在一定的离散，但很微小。将其作图可看出，它们基本弥合在总式上，即呈重迭状态如图2。这更进一步表明所求总式的代表性强，精度高。 3.2实测结果 选择几种具代表性的样品进行测定结果比较，茶叶可作为干样典型，菠萝等则可作为湿样代表。将样品按标准操作规程测出与其糖浓度对

9、应的消光值，然后按常规方法查标准曲线计算出所获得的值;同时利用换算式直接计算出糖含量。将测定结果进行对比，便知其准确程度与实用性。在表3中E值为多组测定值的平均，而常规法总糖的计算则按公式计算。式中c为标准曲线上查得的糖量值ug/mL; L为供试液总量，此为500mL;L为取用试液量，此为1mL; 106为ug转换成g。M为样品重。 简化法中，C变成Y值，即前述Y=C =179 . 5x-2 . 74，余同总糖计算式。由表3可看出，常规法与简化法分析的值相差极微，将两种方法进行统计比较其结果如表4。从表4可知，两种方法计算所获得结果相差极微，表明简化法完全符合实测要求。对表4再求两值间的平一均

10、相对相差则得-0.07%，对几组试验值求出的平均偏差D=0.0115;标准偏差S=0.0181。因此利用多项统计测验均显示出简化法与常规法所获结果趋于高度一致，证明葱酮比色法测总糖简化后十分精确，从而为省去标准曲线制作步骤提供了充足实验依据。 3.3简化法计算公式及其意义: 由于简化法与常规法均是利用葱酮比色法测总糖含量的同样操作方法与步骤，只是简化法以关系式代替了常规法的标准曲线，故总糖计算式简化为式中：:X即E，为实测的消化值。1杨建荣,李玉胜,殷军港. 蒽酮比色法快速测定复合硅铝酸盐霉菌吸附剂中酵母多糖含量J. 粮食与饲料工业,2014,12:57-59.1材料与力一法1. 1仪器和试剂

11、1.1.1材料 复合硅铝酸盐霉菌吸附剂(主要成分:水合硅铝酸盐约85%,酵母细胞壁约5%10%。1. 1. 2仪器 T6新悦可见分光光度计，涡漩混合器，分析天平(精确度0. 000 1 g) , MI6微波消解仪。1. 1. 3试剂 甘露糖标准品(纯度98 % , Sigma公司);浓盐酸(质量分数37% 38%)、浓硫酸(质量分数98%)和蕙酮皆为分析纯;实验室用水为蒸馏水。 50 g/I, Na()H溶液:5g分析纯氧氧化钠溶于100 ml蒸馏水中;质量分数15%三氯乙酸溶液:15g分析纯三氯乙酸溶于85 g蒸馏水中;6 mol/I二盐酸溶液:25 ml浓盐酸和25 ml蒸馏水混匀。1.

12、2方法1.2.1样品预处理 准确称取约0.5g复合硅铝酸盐霉菌吸附剂于微波消解罐中，加入50 g/I, Na()H溶液10 ml,涡旋振荡2 min,混匀。在温度60条件下微波消解20 min，冷却后用6 mol/I二盐酸溶液调至中性，再加入浓盐酸使其最终浓度为6 mol/I,。微波消解采用程序升温，条件为:微波功率为4% W,温度8 0 0C时问5 min,温度1%0C、时问5 min和温度12%C时问90 min。冷却后转移至1% ml容量瓶中稀释定容，过滤后滤液备用。1.2.2溶液配制1.2.2.1甘露糖标准贮备液的配制 准确称取约0.29甘露糖于小烧杯中，用蒸馏水溶解后转移至100 m

13、l容量瓶中并定容至100 m1。1.2.2.2甘露糖标准使用液的配制 分别准确移取甘露糖标准贮备液1. 00,2. 00,3.00,4.00,5.00和6. 00 ml于50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释定容至50 ml。1.2.2.3显色剂蕙酮习壳酸溶液的配制 用量筒量取75 ml浓硫酸(质量分数98%)缓缓倒入装有25 ml蒸馏水的小烧杯中，并不断搅拌冷却至室温;然后加入0.05 g蕙酮，搅拌使其溶解，避光保存，现用现配。1.2.3蕙酮比色法条件的确定 通过紫外分光光度计扫描显色后的溶液，确定最大吸收波长。在甘露糖标准溶液中加入不同体积的蒽酮试剂(分别为3,5,7,9,11和13 ml) ,

14、沸水浴时问10 min，显色测定吸光度后确定蒽酮试剂的最佳体积;加入相同体积的蕙酮试剂，采用不同的沸水浴时问(3,5,7,9,11和13 min)，显色测定吸光度后确定最佳沸水浴时问。1. 2. 4甘露糖标准曲线的制作和样品总糖含量的测定分别准确移取1. 00 ml蒸馏水、6个不同浓度的甘露糖标准使用液1. 00 ml和经消解过滤后的样液1. 00 ml于8支25 ml具塞比色管中。在确定的蒽酮比色法的最佳条件下(蒽酮试剂体积7 ml,沸水浴时问9 min)显色，将比色管在流动水下迅速冷却，于最大吸收波长处测其吸光度。根据标准溶液的吸光度和浓度作图，得到标准曲线和回归方程。根据回归方程和样品的

15、吸光度求出样品中总糖含量(以甘露糖计)。总糖含量=(C*10-3X100/m)X 0. 9 X 100%，式中，C为根据标准曲线求出的100 ml样品消解液中甘露糖的质量浓度，mg/ml;m为样品的质量,g;0. 9为甘露糖和甘露低聚糖的换算系数;100为样品消解液定容体积，ml。2结果与分析2. 1蕙酮比色条件的确定2.1.1最大吸收波长的确定将甘露糖标准溶液经蕙酮试剂显色后在500700nm波长之问进行全波长扫描。由图1可知，在630nm处有最大吸收峰，因此确定其检测波长为630nm。2. 1. 2蕙酮显色剂用量的确定由图2可知，当显色剂用量为7 ml时，甘露糖的吸光度最大，灵敏度最高。因

16、此选择显色剂用量为7 ml。2. 1. 3沸水浴时问的确定由图3可知，随着沸水浴时问的增加，吸光度值呈先增后减的趋势，并在9 min时取得最大值;因此确定最佳沸水浴时问为9 min。2. 2样品测定2. 2. 1样品中蛋白质干扰的排除 取过滤后的酵母多糖消解液2 ml于试管中，向其中滴加质量分数15%三氯乙酸溶液，未发现有沉淀析出，故可确定水解液中己无蛋白质存在，同时也排除了蛋白质对显色可能造成的十扰。2.2.2样品中总糖含量的测定分别准确移取1. 00 ml蒸馏水、1. 00 ml甘露糖标准使用液及1. 00 ml过滤后的样液于8支25 ml具塞比色管中，在每支25 ml具塞比色管中再准确加

17、入7 ml蕙酮试剂显色剂;然后在沸水浴中加热9 min，取出后在流动水下迅速冷却。于波长630 nm处测其吸光度，得标准曲线(见图4)和回归力一程。根据回归力一程和样品的吸光度求出样品中酵母名糖的含量。回归力一程为:y=2. 238 1x+0. 038 2，相关系数为R2= 0. 998 1，说明线性关系良好。根据样品的吸光度计算出100 ml样品消解液中酵母多糖含量(以甘露糖计)为0. 286 mg/ml，则复合硅铝酸盐霉菌吸附剂中酵母多糖的含量为5. 13 %，与实际添加量相符，说明该测定力一法准确可靠。2. 3加标回收率、相对标准偏差的测定2. 3. 1加标回收率的测定准确称取质量相同的两份约0.5g复合硅铝酸盐霉菌吸附剂，其中一份加0. 1 g甘露糖标准品，在相同条件下测定，求得加标回收率为102%，见表1。2. 3. 2相对标准偏差的测定分别称取6份质量约0. 5 g的样品在相同条件下进行测定，得相对标准偏差为0.15%，结果见表2。3小结 样品中先加入50 g/I, NaOH溶液，在温度60下微波消解20 min;再加入盐酸使其最终浓度为6 mol/I,。采用程序升温，最终温度在120摄氏度，微波消解共100 min;蒽酮试剂显色的最佳体积为7ml,沸水浴时问9 min。在该条件下可准确测定出复合硅铝酸盐霉菌吸附剂中酵母多糖的含量。