SOD的研究进展综述文档格式.docx

1、氧的某些代谢产物及其衍生的含氧物质都是直接或间接山氧转化而成的。由于 它们都含有氧，而且具有较活泼的化学反应特性，遂统称为活性氧（Active oxygen species, AOS） 1包括超氧根离子02-、氢氧根离子0H-、经自由基（0H）过氧 化氢H202、单线态氧（102）和过氧化物自山基（R00-）。它们可导致膜脂过氧化、 碱基突变、链的断裂和蛋白质的损伤，等。植物体在正常生长条件下也能产生少量 的02-,它主要来源于线粒体的电子转移系统、光合作用，以及一些氧化还原酶的 产物2。但在正常的生理情况下，活性氧在不断产生，也不断地被清除，因而不 会造成自由基对机体的损伤。活性氧在植物体内

2、的清除山保护酶和抗氧化物质来完成。保护酶主要是超氧化 物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）、过氧化氢酶（Catalase, CAT） 过氧化物 酶（Peroxidase, POD）等，其中SOD起主要作用；植物体内抗氧化物质主要包括抗 坏血酸、维生素及还原性谷胱甘肽等。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）,是一种催化超氧化物阴离子 自由基发生歧化，生成氧和过氧化氢，从而清除超氧化物阴离子自由基并含有不同 金属离子的氧化还原酶。SOD作为体内自山基的有效清除剂，能使自山基的形成和 消除处于动态的平衡，从而抵御02-的毒害作用3 。该酶最早

3、于1938年Mann和 Ke订in4在进行牛血红细胞的分级分离时，从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜 蛋白质，命名为血球铜蛋白（Erythrocuprein）,但其生理机能并未研究清楚。到 1969年才111 McCord和Fridovich5发现该蛋口具有生物酶活性，能催化超氧阴 离子进行歧化反应，从而命名为超氧化物歧化酶6；直至U询，有关SOD的研究 已涉及化学、生物、医药、日用化工、食品诸领域，对SOD的研究逐步深人、扩 展。本文就超氧化物歧化酶的来源、种类和分布、结构和理化特性、SOD基因的克 隆和表达、分离纯化、及制备开发应用等方面做一综述，旨在为其进一步研究、开 发、应用提供参考。1

4、SOD的分类和来源超氧化物歧化酶是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到的。1969年 McCord等重新发现这种蛋口，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化氧自山 基发生歧化反应的性质，因此正式将其命名为超氧化物歧化酶。迄今为止的研究表明7, SOD广泛存在于多种生物体内，已从细菌、真菌、 原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内分离得到了 SOD。1.1 SOD的分类按金属辅基不同，SOD主要分为：Cu/Zn-SOD,主要存在于真核细胞的细胞 质中；Mn-SOD,主要存在于原核及真核细胞的线粒体中；Fe-SOD,主要存在 于原核细胞中，但也有人报道Fe- SOD存在于真

5、核藻类及植物叶绿体基质中8。 人体内的SOD主要有三种：SOD-1 （Cu/Zn-SOD）:主要存在于细胞质中；SOD- 2（Mn-S0D）：主要存在于线粒体中；SOD-3（extracellular superoxide dismutase, EC-SOD） 9：主要存在于细胞外基质和细胞表面上，是细胞外液如血 浆、淋巴液、关节液及脑脊液中最主要的SOD同工酶，也是清除细胞外02-的主要 酶。但是，除了以上三种SOD外，有科学家最近乂发现了两种新的SOD, 种是含 银酶即Ni-SOD, 一种是含铁和锌的酶即Fe /Zn-SODo它们均为四聚体，且它们之 间没有免疫交义反应。1.2 SOD的来

6、源1. 2. 1动物源SOD动物血（原多从牛血中提取）中SOD不仅含量丰富，且提取和纯化较方便成本 低，红细胞膜易破，用常规分离纯化方法可获得高纯度的SODElOlo经过采血、取 血球、丙酮沉淀、热处理、透析、上柱、浓缩、冷冻干燥而成，可作为药用。 1. 2. 2植物源SOD自1997年欧盟禁止使用动物提取SOD,从植物中提取SOD就成了一个很重要 的来源。植物来源SOD为Cu /Zn-SOD,是从鲜叶茎中提取的一种极好的水溶性蛋 口利于人体吸收11。该途径解决了从动物血液中提取的SOD存在病毒交义感染的 弊端。因此，从植物中提取的SOD安全性很高，避免了可能发生的交义感染，且具 有明显的社会

7、和经济效益，市场前景广阔。1.2. 3酶法生产SOD由于微生物发酵法生产SOD不受季节、气候和地域的限制，具有生产周期短、 产量高、成本低、能大规模生产等特点，近年来得到了迅速的发展。菌种是发酵生 产酶制剂的重要条件，可考虑筛选或选育能在极端条件下如嗜热、耐酸、耐碱、抗 压等条件生长的SOD生产菌。必要时还可采取诱导手段，如用5-漠尿咗噪诱导酵 母SOD表达活性效果明显，可以在此基础上继续试验，以筛选酵母SOD高产菌株 12 o目前开发用于SOD发酵生产的菌种有酵母株Y-22, SIPI-215y, ZDF-48；嗜 热栖热菌ATCC27634；嗜热脂肪芽泡杆菌BS211-15； SOD高产菌

8、株BIT-8701等； 另外，还有大肠埃希菌、乳酸杆菌等。2SOD的结构和性质2.1同类SOD在进化上的保守性及其结构上的同一性近10年来，通过对已完成的全部氨基酸序列分析结果的比较研究，发现不同 来源的Cu/Zn-SOD在氨基酸序列上有较高同源性，且理化性质相似，而不同来源的 Mn-SOD和Fe-SOD也有较高的aa同源性和相似的理化性质13,它们可能分别由 两种原始酶进化而来，但是它们有明显的差异氨基酸以及对的敬感性14,同一类 SOD不仅在进化上有高度的保守性，而且结构上也有高度的同一性。Fe-SOD和Mn-SOD在空间结构上与Cu/Zn-SOD不同，较高程度的a-螺旋而较 少0 -折叠

9、。结合底物02-的是一个椭圆形的“ 口袋”，为15X9XAo 口袋外缘一 边是由 T135, G136, A138 和 G139 组成,另一边则由 G59, P60, H61 及 F62 和 N63 组成。K134和R141的侧链组成口袋两侧。Cu, Zn和D81, H118, H44, H78, H69 组成口袋底部。在这个活性中心，Cu与4个His的咪哇环N原于形成近四方平面 的配位结构。Cu和Zn之间通过共同连接一个H61而形成“咪哇桥”。在Cu/Zn-SOD, Cu接近于溶剂，Zn被包埋于疏水内部。在Cu离子上还结合有 1分子H20,铜为5配位的铜。在Fe-SOD中，除His残基参与金

10、属辅基的配位外，还有Trp残基与Fe形成配 位。ESR和NMR研究揭示，Fe-SOD和Mn-SOD中的金属离子是处于高自旋态的 Fe3+和Mn3+o天然SOD活性中心金属配位结构见图1, Cu/ZnSOD酶活性中心结 构见图2。6- N5 - OH1天铁SOD牙性申心金厲配恢结构B0 2 Cu/Zft-SOD苗港件中心给粕2.2 SOD的理化性质SOD的等电点偏酸性，为酸性蛋口，在酶分子上共价连接金属辅基，因此SOD 对热、pH值和蛋白水解酶的稳定性比一般酶要高。三种SOD的主要理化性质见表 115。war M- HX.WDlttl池tew卜Of I MioiaaeRaei佥a2* a仙0MO

11、ta.7）m50Tw Tip*r tip*TW Tip 刃早n 人 Fe SODWD HW M. 93D干代t e-t2 -m lowiD PQJ HDAKM2.2. 1 SOD对氛化物和H202的敏感性所有的CuZn-SOD对氤化物敬感，只有lmmol/L-2mmol/L的氤化物浓度即使其 活性完全丧失，而Mn-SOD和Fe-SOD却不被氛化物抑制。长时间用过氧化氢处理可 使CuZn-SOD和Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影响。2. 2. 2 SOD的吸收光谱特性CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，它在 280 nm处并没有最大吸收峰。CuZn-SOD

12、的可见光最大吸收波长都在680 nm左右， 这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。2. 2.3 SOD稳定性及影响因素PH、热、蛋白酶的影响：SOD在PH5.39. 6间催化性能良好,在pH4.5pHll 间能稳定存在。pH3. 6时，CuZn-SOD中95%的Zn要脱落,在pH12. 2时，SOD的构 象会发生不可逆的转变而使酶失活。SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当 离子强度很低时，即使加热到95C,其活性损失也很少。SOD在模拟胃酸和模拟胃 肠道蛋口酶、胰蛋口酶环境中的稳定性研究表明，SOD在动物胃肠道中具一定的稳 定性，在胃酸的环境中，37C保温150min,活性仍残存81%,在

13、胃蛋白酶和胰蛋白 酶环境中，保温210 min活性残存率分别为82%和84%16。其他因素：S0D活性 受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中 性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定17。列外还发现有机溶剂和CL对SOD的活性 具抑制作用18 o2.2.4 SOD的安全性大量试验和临床应用表明，无论何种给药方式，除罕见的超敬反应外，SOD对 人体无毒性。虽然SOD是Mr在30000以上的蛋白质，但却未发现具有抗原性，其 原因也正在进一步研究中。3SOD的作用机理和生理功能3.1 SOD的作用机理近年来对SOD家族的深入研究表明，人Mn-SOD是一个由位于6925位基因

14、编码 的抗氧化酶，由于其紧挨着胶质细胞瘤、淋巴瘤、卵巢癌等多种肿瘤染色体畸变的 频发部位。有人提出Mn-SOD是潜在的新型肿瘤抑制基因；还有研究表明，Mn-SOD 具有抑制肿瘤细胞生长的功能，尤其是对恶性肿瘤细胞有抑制作用，SOD在生命体 中的表达因不同类型而异。Fe-SOD和Cu /Zn-SOD大多数是组成型表达，而Mn-SOD 主要是诱导表达。在生物体中，一种形式SOD的表达受抑制会导致其他形式SOD表 达的增加。相反，外源SOD基因的过量表达可以降低超氧化物或信号分子的浓度， 从而导致内源SOD基因表达的降低。原核生物SOD基因的表达调控与生长的营养条 件、所处环境有直接的关系，而真核来

15、源的SOD基因的表达调控则与植物或动物的 生长发育阶段、体内激素有关19。3.2 SOD的生理功能正常情况下，体内超氧阴离子自由基（02-）的产生与清除是平衡的，当（02- ）产生过多时，会对机体产生毒害作用。SOD是体内的一个抗氧化酶，特异性催 化下列反应202-+2H+-H202+02即将超氧阴离子自曲基歧化为过氧化氢和氧气， 起到消除超氧阴离子自由基的作用。因而SOD具抗衰老、提高机体对多种疾病的抵 抗力、增强机体对外界环境的适应力、减轻肿瘤患者在放疗、化疗过程中的严重毒 副作用等生理功能。4SOD的基因克隆和表达4.1 SOD的基因克隆目前SOD大多是从天然动植物中提取，但是，提取法由

16、于天然原料含量极微、 提取工艺复杂等原因导致制品纯度低，产量少。为解决来源的限制问题，寻找比较 经济的途径是必要的。利用微生物特别是基因丄程微生物制取SOD的研究日益受到 关注。4.1. 1 PCR扩增克隆这是一种参考已知基因的序列克隆基因的方法。目前已经基本知道了 SOD基 因的序列，当克隆类似基因时可先从Gene bank库中找到有关基因序列，用PCR技 术克隆SOD基因。基本方法是根据已知基因的序列设计并合成一对引物，提取DA 进行PCR扩增，扩增的片段纯化后连接到合适的载体上，用双酶切分析和序列分析 检测重组子，并与已知基因序列进行比较。袁伟等20实验用PCR技术成功克隆出 大肠杆菌C

17、uZn-SOD基因，在设II- PCR引物时，基于简化试验步骤和提高试验效 率，引物5端添加酶切位点时选用常用的酶，并且最好2种酶是使用相同的缓冲 液,为此在设计的上、下游引物5端添加了 Sac I和Knp I酶切位点，汪濃等 21添加的2个酶切位点是B amH I和S al I , 2种酶的缓冲液均为10XL Buf fer（ pH 7. 5）,并在2条引物上添加了相应的保护碱基。在试验的过程中需对 PCR体系（引物浓度、馆2+浓度、dNT P用量、模板量、PCR退火温度）进行了正交 优化以减少PCR过程中可能发生的碱基错配。袁伟，王小丽等20,22采用了高效 克隆载体pMD18-T Vec

18、tor （ 2692 bp）,该载体ill pUC18载体改建而成，使用该载 体可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。PCR产物经纯化回收后克隆至 pMD18-T载体中，转化E. coli DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒进行 双酶切及PCR扩增鉴定，并对sod基因片段进行序列测定。4.2.2 RT-PCR扩增克隆基本方法是根据超氧化物歧化酶基因的保守cDA序列设计并合成引物，提取 总RNA为模板，用反转录合成的cDA作为PCR反应模板，扩增的片段纯化后连接 到合适的载体上，双酶切分析和序列分析检测重组子，并与已知基因序列进行比 较。丛海峰等23利用RNAiso Reagent （

19、参照试剂盒说明书）提取总RNA,以oligo （dT）为引物进行反转录，利用CB I的家蚕EST数据，并参照文献24有关家蚕 超氧化物歧化酶基因序列的研究结果，釆用DNAstar进行电子克隆并设计引物。姚 立虎等25实验采用RT-PCR技术克隆了柞蚕Cu /Zn2S0D的ORF序列，并在柞蚕 蛹脂肪体中获得了该序列，试验中为了提高PCR产物的连接、克隆效率采用了 PMD-19T载体，为探究柞蚕Cu /Zn2S0D基因在柞蚕体内的分子作用机制提供了基 础信息。此外，依据序列同源性克隆基因是根据生物的种、属之间编码基因序列的同源 性高于非编码区的序列。此方法的基本作法是在其它种属的同源基因被克隆的

20、前提 下，构建cDNA文库，然后以已知的基因序列为探针来筛选LI的克隆。杨力明等26 构建哈茨木霉菌丝ESTs本地数据库，对该数据库进行tBlastn比对，成功地获得 了哈茨木霉超氧化物歧化酶的ESTs序列，通过测序，获得了哈茨木霉超氧化物歧 化酶基因全长cDA,说明这种基因克隆方法方便易行。同时，该方法具有针对性 强、快速、简捷的特点，减少了对ESTs全面分析的工作量。因此，这是一种理想 的生物信息学手段克隆基因的方法27。4.2 SOD的基因表达大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、 培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉，可以快速大规模地生 产L

21、I的蛋白等优点28,而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系 统，表达的LI的蛋口量其至能超过细菌总蛋口量的30%,因此大肠杆菌是口前应 用最广泛的蛋白质表达系统29。pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋口的 最强大系统，它是最初由Studier等30利用与启动子配套能高效转录特定基因的 外源RNA聚合酶构建的T7 RNA聚合酶/启动子系统31,可以从各种基因（包括原 核、真核细胞）生产大量的LI的蛋口，pET表达系统的优势主要表现在优化靶蛋口 表达、严格控制基础表达水平，是宿主菌的最佳背景。张建光等32实验中，幽门 螺杆菌SOD蛋白为Fe - SOD，序列分析发现，SOD无信号肽

22、序列，为非分泌型蛋 白。其晶体结构最明显的特点是它的活性部位结构保守，尤其在二聚体表面相互作 用部位非常保守。与其他有生物活性的Fe-SOD结构比较，幽门螺杆菌Fe-SOD有 20个C-末端尾巴，呈a-螺旋结构。SOD基因也可以在其他的体系中表达33。5SOD的提取分离纯化5.1磷酸缓冲液提取法SOD极性较大，易溶于水，根据“相似相溶”原理，可用水来浸取大蒜SOD。 但磷酸缓冲液可提高浸取效能，增加制品的稳定性，减少杂质，因此实际操作中常 采用pH7.8的磷酸缓冲液代替水来浸取SOD,得到粗提取液。但方法的缺点是浸出 范围广，选择性相对差，容易浸出大量的无效成分，且会引起一些有效成分的水 解。

23、5.2超声波破碎法超声波破碎法是一种辅助浸取技术。超声波的“空化作用”产生极大的压力造 成被粉碎物细胞壁或整个细胞的破碎，而且整个破碎过程在瞬间完成。超声波产生 的振动作用增加了溶剂的湍流强度及相接触面积，加快了细胞内物质的释放、扩散 及溶解，从而强化了传质，有利于细胞内有效成分的提取34。5.3热变性法热变性法是依据SOD的热稳定性原理设计的。SOD的热稳定性高，当温度低 于60C时，短时间的热处理不会使酶活力有明显的变化，而一般的杂蛋口却在温 度高于55C时就易变性沉淀，因此，对SOD粗提液进行短时间的热处理可以达到 去除杂蛋口的LI的。孙永君33研究得出提取植物SOD的最适宜温度为呢 6

24、5C,最适宜的热变时间为15 mine热变性法作为一种初步的纯化手段，操作简 便，经济实惠，是工业上常用的分离SOD的方法。5. 4有机溶剂分级沉淀法5. 4. 1丙酮沉淀法利用向蛋口质溶液中加入弱极性的有机溶剂，改变溶液的介电常数，使不同种 类蛋口质的溶解度产生不同程度降低的原理可进行蛋口质的纯化。在粗酶液中逐量 加入丙酮，可使SOD及其他朵蛋白的溶解度发生变化，依次从溶液中沉淀出来。邓 旭等研究认为，当丙酮加入量达到1.0（V/V）时，SOD比活最高，再加入丙酮将导 致SOD活力急剧下降，因此当以去除杂蛋白为H的时，丙酮的加入量不宜超过1.0 （V/V）36。原龙等37通过实验进一步得出，

25、不同的丙酮加入量与搅拌时间会影 响SOD的纯化结果，其最佳条件是加入0.6倍体积的丙酮，搅拌15mino 5. 4. 2氯仿-乙醇沉淀法氯仿-乙醇混合液可作为萃取剂将SOD溶解于其中，并将杂蛋白沉淀出来。另 外，Cu/Zn-SOD对氯仿-乙醇的作用不敏感，处理12 h后，活性没有明显的变 化，因此用该法粗分离大蒜SOD是可行的。张恒等38试验证实，按氯仿-乙醇 （V/V二3： 5）混合液为提取液量的2. 5倍加入氯仿-乙醇混合液，离心分离后弃去 沉淀，可得到较纯的SOD酶液。5. 5硫酸钱分级盐析法盐析法是利用在高浓度的电解质溶液内，蛋口质分子表面的水化层被破坏， 使蛋口质分子中的憎水区域裸露

26、而导致蛋口质分子聚集沉淀的原理进行分离的。硫 酸钱因价廉、溶解度大，且能使蛋口质的性质保持稳定而成为最常用的盐析剂。 孙永君39通过试验表明，当植物SOD粗提液中硫酸钱的浓度从0开始增加时，其 中的一些蛋口质的溶解度增加，表现出“盐溶”特性；但当硫酸镀浓度继续升高达 到50%的饱和浓度时，超过了某些杂蛋口的溶解上限值，其溶解度乂会先后以不同 的速度下降，分别析出沉淀，而该浓度下植物SOD仍表现出“盐溶”特性；但由于 SOD的沉降系数较小，当硫酸鞍的饱和度达到90%时，植物SOD的溶解度才会下降 而沉淀析出。孔祥智等40则以40%和90%为分步盐析的最佳硫酸钱饱和点，从大 蒜提取物中获得了 SO

27、D和蒜氨酸酶两种产品。硫酸镀分级盐析法的优点是方便易 行，常温下也不易导致酶失活，纯化效果好，与有机溶剂分级沉淀法相比更有利于 保持蛋白质的生理活性，但分辨率不及有机溶剂分级沉淀法。5. 6透析透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜，而使蛋口质和其他小分子物质分开 的方法。透析通常不作为纯化酶的一种单元操作，但通过透析可除去酶液中的盐 类、有机溶剂、低分子量抑制剂等，所以它在纯化过程中极为常用。透析膜的截留 极限一般在分子量5000左右，而Cu/Zn-S0D的分子量远高于此，因此适合于透析 法。5. 7膜分离技术膜分离技术采用了能选择地透过一种物质，而阻碍另一种物质透过的具有特 定性质的半透膜，它

28、的实质是利用物质经过膜的传递速度不同而使其得以分离。陆 俊等41探讨了以中空纤维超滤膜分离提纯大蒜SOD的工艺，通过正交试验确定出 超滤膜分离法的最佳条件为温度32C,压力0.13MP&,透过率90%,并在此基础 上研究了用纳滤膜对S0D超滤液进行浓缩纯化的工艺条件，指出适宜的纳滤条件为 温度32C,压力1.4 MPa。膜分离技术是一项新兴的分离纯化技术，具有被分离成 分稳定、分离率高、耗能低、无二次污染、操作方便等优点。6SOD开发应用前景6.1 SOD在食品中的应用与其他抗氧化剂一样，SOD可作为罐头食品、果汁、啤酒等的抗氧化剂，防止 过氧化酶引起的食品变质及腐败现象；还可作为水果、蔬菜等

29、的良好保鲜剂。III于 绝大部分蔬菜、水果都含SOD,其中含量较高的有刺梨、香蕉、獗猴桃、菠萝、山 楂、大蒜等，水果果皮中SOD活性明显高于果肉。水果中SOD活性在储藏期间均呈 下降趋势。人们利用这些富含SOD的原料开发了天然保健食品如芦荟汁、大蒜素、 刺梨汁、菠萝汁等。将SOD作为营养强化剂加入食品中制成新的保 健食品，如绿茶饮料有预防翻齿、敬感症、痛风、降压、抑制氧化等作用；番木瓜 SOD酒采用低温生物技术发酵而成，是一种低度纯天然的绿色健康型果露酒 42。6.2 SOD在农业上的应用SOD在转基因植物中的过量表达能不同程度地提高植物对逆境的抵抗能力， Mn-SOD基因的过量表达在一定程度上可以提高植物转基因植物对氧胁迫的耐受 性。通过基因工程手段，增加植物内的SOD的表达，可以大大增强植物的抗逆性。 如43将存在于线粒体中的Mn-SOD导入烟草、苜蓿的叶绿体后，其转基因植株可 以增加对臭氧及干旱胁迫的抗性。拟南芥44的Fe-SOD基因转化烟草叶绿体， Fe-SOD的过量表达能够增强叶绿体质膜和光合系统【I对MV （屮基紫精）和高盐过 氧化胁迫的抗性。6.3 SOD在临床上的应用45研究表明，SOD具有抗炎、抗病毒、抗辐射、抗衰老等作用。在病毒性疾病、 自身免疫性疾病、心肌缺血和缺血再灌流综合症、老年性口内障、心血管疾病、