Tn5转座酶建库原理资料下载.pdf

1、比如模式植物大多都有很好的突变体库，其中玉米的两个应用最为广泛的突变体库（uniformMu 和 Ac/Ds 突变体库）就是利用转座子创建的。转座子标签技术克隆基因的基本原理：转座子是染色体上一段可移动的 DNA 片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型。通过遗传分析可确定某基因的突变是否由转座子引起，由转座子引起的突变便可以转座子 DNA 为探针，从突变株的基因组文库中钓出含该转座子的 DNA 片段，并获得含有部分突变株 DNA 序列的克隆，进而以该 DNA 为探针，筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。在基

2、因工程中，来源于微生物的转座子运用的更为广泛，Tn5 就是一个很好例子。Tn5 因其转座的随机性好、稳定性高、插入位点容易测序等特点，已经成为分子遗传学及基因诊断学研究的热门工具。Tn5 as a Molecular Genetics Tool作为经典的方法，被收录进了 Springer 大名鼎鼎的Methods in MolecularBiology。Epicentre 的专利产品 EZ-Tn5 转座子突变系统无疑是其中的佼佼者，是公认的易操作系统。该系统经过工程改造，使得 Tn5 转座酶比天然转座酶的活性强 100倍。EZ-Tn5 转座子可在体外插入到含有靶 DNA 的载体上，在没有镁离子

3、孵育时，EZ-Tn5 转座子能够形成稳定的 EZ-Tn5 转座体复合体，可以通过电击进入活细胞，转座体经细胞内镁离子活化后，就能随机插入到宿主的基因组 DNA 中。图 1A.Tn5 的结构图 1B.Tn5 插入基因组示意图2000 年，science 上 发 表 的Three-Dimensional Structure of the Tn5Synaptic Complex Transposition Intermediate解析了 Tn5 插入基因组的机理。Tn5 全长约 5.8kb，由编码三个抗生素（新霉素、博莱霉素、链霉素）的核心序列和两条倒置的 IS50 序列组成（如图 1A），其中 I

4、S50R 和 IS50L 的序列高度同源，只有 IS50L 的一个碱基存在突变。IS50 具有 19bp 的倒置末端（外末端 outsideend，OE 和内末端 inside end，IE），两倒置末端有 7 个 bp 不同，此倒置末端是转座酶（Tnp）的作用位点。转座发生时，两个转座酶分子结合到 Tn5 转座子的 OE 末端，形成两个 Tnp-OE 复合体，随后两个复合体联会，Tnp 的 C 末端相互作用而二聚体化，形成由一个二聚体蛋白质和两分子 DNA 组成的联会复合体（如图 1B）。形成该联会复合体后，Tnp 才具有切割 DNA 的活性。形成这种结构有利于协同 Tn5 DNA 链的切割

5、和转移，有利于防止 Tnp 只对转座子 DNA 链的一端进行切割。结合在左末端的 Tnp 负责催化右末端的磷酸二酯键水解，而结合在右末端的 Tnp 负责催化左末端的磷酸二酯键水解。Tnp 活化水分子，此活化的水分子水解 DNA 链，在 Tn5 的两末端分别形成两个 3-OH 亲核基团，该亲核基团进而攻击互补链形成发夹结构。随后另一活化的水分子水解该发夹结构,形成平末端的 Tn5，整个联会复合体离开供体链，并结合到靶 DNA 上。Tn5 的 3-OH亲核攻击靶序列，在转座子插入位点之间形成 9bp 的粘性末端，转座子的 3-OH同靶 DNA 的 5-P 之间形成共价键，转座子就插入到靶序列之中。

6、在 DNA 聚合酶的作用下补平缺口，转座子的两端形成 9 bp 的正向重复序列。整个转座过程完成了基因从原始 DNA 被剪切之后粘贴在另一受体 DNA 的过程，实现了基因的“跳跃”（如图 2）。图 2 Tn5 插入基因组的机理后来研究人员发现，整个转座子序列并不是转座必须的，只需转座子的末端核心序列，转座酶便能将该部分序列插入并连接至基因组内。根据这个原理，将测序接头序列加入末端核心序列中，可简捷地引入测序接头，完成文库构建。Epicentre 这次又走到了前面，它的核心专利 Nextera技术，相信大家都很清楚。图 3 Tn5 进行 DNA 打断这一次，最大的赢家是 Illumina。201

7、1 年 1 月，Illumina 宣布收购了Epicentre 生物技术公司。尽管 Illumina 公司已经有常规的物理打断试剂盒（Truseq 系列），但是 Nextera 系列中，Tn5 打断技术的革新极大地减少了操作时间和操作步骤，在简便程度上有非常大的竞争力。比如 WES（全外显子测序），Tn5 建库加上快速杂交，理论上一天即可完成文库构建，速度不可谓不快。将 P5、P7 端部分接头序列（Adapter 1/2）和转座子末端序列形成包被接头，与 Tnp 形成 Tn5 转座复合体。该复合体打断受体 DNA，会形成一端带有 P5 部分接头 Adapter 1，一端带有 P7 部分接头 A

8、dapter 2 的 DNA，之后通过 PCR 加上 Barcode 以及接头其余部分，形成含 P5 端与 P7 端完整接头的 DNA 文库（如图 4）。图 4 Nextera 系列建库示意图顺便提一下，收购了 Epicentre 后，Illumina 拥有了其公司的 Ribo-zerorRNA去除试剂盒系列，基于该系列产品开发的 TruSeq Ribo-Zero 系列 LncRNA 建库试剂盒，大大提升了 Illumina 在 RNA 方向建库试剂盒的竞争力。Tn5 用于测序文库构建时，将 DNA 片段化、末修加、接头连接等多步反应转变为 1 步反应，极大缩短建库时间，提高工作效率。但是这一

9、步之后，接头与插入片段之间有 9bp 的 gab 需要补平（如图 5），这就是为什么 Tn5 建库在 PCR之前必须 72反应 5min，而且所用的 PCR 酶需要是具有链置换功能的非热启动酶。图 5 Tn5 文库缺口补平从图 5 也可以看出插入片段两端序列是 19bp 的固定序列，与常规物理打断法所构建的文库结构是不同的，所以测序引物不同。图 6 诺唯赞的 Tn5 测序文库结构在磁珠起源一文中提到的 NexteraDNA Flex Library Preparation Kit，从这项技术可以看出 Illumina 公司把文库制备的简便性做到了极致。Tn5 引爆了极速建库的战争，而竞争对手也

10、没有坐以待毙，Mu 转座子、Mos1转座子、哈氏弧菌（Vibrio harvey）转座子纷纷被用于文库构建。赛默飞用 Mu 转座酶推出了 MuSeek Library Preparation Kit for Ion Torrent，安捷伦推出了Vibrio，哈氏弧菌转座酶与 Tn5 之间的同源性高达 40%。可惜这些转座子的市场效果都不如 Tn5，而且转座酶打断识别特异性的问题经常受到竞争对手的诟病。全式金有数据统计，测序的前 9bp 有明显的偏好性（如表 1）（顺便说一下，全式金也有自己 Tn5 建库试剂盒并有不错的创新，大概是为了规避专利，看过的都知道 Epicentre 在 Tn5 建库

11、专利的保护十分严密）。尽管突变 Tn5 转座酶部分氨基酸位点可以降低 DNA 偏好性，但无法完全消除 bais。表 1 全式金统计转座酶识别位点偏好性因此，也有不少对手放弃仿制，与其推出一个效果较差的山寨版，不如另辟蹊径。摆脱物理打断，不只有转座酶法。NEB 和 KAPA 等推出了酶解法建库方案：NEB 推出的 NEBNext DNA 双链片段化酶是时间依赖型酶，能根据不同作用时间将 dsDNA 切割成 50-1000bp 片段。NEBNext DNA 双链片段化酶由两种酶组成，一种酶随机的在 dsDNA 上产生切刻，另一种酶识别切刻处并在对链进行切割，产生 dsDNA 片段（ZYMO 也有一

12、款效果不错的类似的产品：dsDNA ShearasePlus，当然用这些打断酶要注意 DNA 溶液 EDTA 含量，否则影响打断效果）。Qiagen 也推出了 QIAseq FX DNA Library Kit，这个试剂盒采用 FX 酶混合液将DNA 样品剪切为较小的片段，并开展末端修复，在 3端加 A 尾，让 DNA 片段可立即用于连接，只需 3 步反应即可完成建库，似乎比转座酶更快速（用“似乎”是因为小编没有真正用过）。当然转座酶法也有一些劣势。在液态活检或是 NIPT 方面，由于 cfDNA 都是170bp 的短片段，并不特别适合于转座酶建库。Tn5 建库是酶量依赖型，在纯化前是不会脱落

13、的（随后长片段之争会说），对 DNA 定量要求高，否则酶和 DNA比例不准确。Tn5 酶对 DNA 溶液中的一些杂质也可能不耐受，影响打断效果。虽然 Tn5 在极速建库的优势被削弱，但是它还有不少其他优秀的应用。Tn5 用于 DNA 打断，直到它们被化学方法去除掉之前，转座子和 DNA 序列片段一直是连接起来的（如图 7）。利用 Tn5 的这一特性，研究人员研发了使用短读序列组装成长读长片段，弥补二代测序读长短这一最大的软肋。即长片段物理分隔稀释后，Co-barcode 打断，最后根据 barcode 信息确定片段来源，具有相同 barcode 的 reads 可拼接成超长 Linked-Re

14、ads，Linked-Reads 更好地覆盖基因组结构变异信息，跨越基因组复杂结构区域。图 7 Co-barcode 打断原理Co-barcode 起源于 2012 年，这一年 Complete Genomics 公司在 Nature上在线发表了Accurate whole-genome sequencing and haplotyping from10 to 20 human cells，文章介绍了一种名为长片段读取（Long Fragment Read，简称 LFR）的技术（如图 8），将 DNA 长度为 10kb 到 300kb 分配到 384 孔里面，MDA 扩增，然后进行 Co-Ba

15、rcode 标记，打断成小片段，再合并构建高通量 测 序 文 库，测 序 后 利 用 Barcode 序 列 进 行 单 倍 型 的 组 装。（单 体 分 型Haplotyping 一直就是研究热点）图 8 LFR 技术建库原理Complete Genomics 就是现在大家熟知的被华大基因收购的 CG 公司，哈佛大学的 George M.Church 也参与了 LFR 的开发。乔治.邱奇，大家都认识，去年访问中国时他被各大公司聘为顾问，刷爆朋友圈，就不用介绍了。在 同 一 年，来 自 斯 坦 福 大 学 的 Stephen Quake 实 验 室 也 发 布 了 称 为Moleculo 的长

16、片段测序技术，与 CG 的技术不同，Moleculo 的技术将 Tn5 打断的片段锁定在 10kb。Stephen Quake 也是同一级别的大牛，1999 年他创办了Flulidigm 公司（单细胞测序都知道），也是他完成了第一例人类单细胞测序（Genome-wide Single-Cell Analysis of Recombination Activity and DeNovo Mutation Rates in Human Sperm）；2015 年 他 在 Nature ReviewsGenetics 上 发 表 的Single-cell genome sequencing:curr

17、ent state of thescience，一直被认为是单细胞测序领域的最权威综述。瀚海基因的三代技术前身就 是 来 源 于 Stephen Quake 教 授 参 与 成 立 的 Helicos Biosciences 公 司，Stephen Quake 教授正是贺建奎博士的博后导师。无创产前筛查技术最早也是由斯坦福大学的 Stephen Quake 实验室和香港中文大学的卢煜明教授分别独立提出的，最近 sicence 上用孕妇血浆游离 RNA 预测胎儿早产可能性的文章也是出自他们实验室。Moleculo 这一技术 2012 年被 Illumina 收购（从收购 Solexa 到 Epi

18、centre，不得不佩服 Illumina 的眼光），从而开发为 TruSeq Synthetic Long-Read DNALibrary Prep Sequencing（是的，这两个技术一个去了华大，另一个去了Illumina）。后来 Illumina 团队在此基础上开发了 CPT-seq，这一技术发表在Nature Genetics 杂志上（如图 9）。图 9 CPT-seq 技术原理但是这两种长片段测序技术由于技术封闭和手工操作过于复杂，而没有得到很好的推广。将物理分割的 Co-barcode 技术做到最好的，是借助仪器实现的 10XGenomics 公司。2015 年，10X Gen

19、omics 公司正式发售 GemCode 测序平台（技术细节磁珠起源一文说过）。长片段之战，二代测序明显劣于三代，但是 10XGenomics 的出现，加上 PacBio 测序的价格昂贵、数据产出不稳定，OxfordNanopore 迟迟未商业化，二代测序公司有望和三代暂时扳扳手腕，相争与之合作。10X Genomics 公司异军突起，堪称测序界的黑马，这几年风光无限。10X Genomics 创立于 2012 年，它的创始人源于数字 PCR 公司 QuantaLife的高管。又是一次大鱼吃小鱼，Bio-Rad 收购了 QuantaLife，并推出了 QX100微滴式数字 PCR 平台。看来

20、10X Genomics 做微流控技术是有底蕴的。10X Genomics 的长读长需要仪器的支持，当然这台仪器还可以用于单细胞转录组测序。不过 10X Genomics 的技术是基于微流控技术（microfluidics），在单细胞转录组测序上微孔板技术（microwell technology）的兴起，在成本上给微流控很大的冲击。最近浙大郭国骥老师在 cell 的文章就是很好的证明，技术的革新往往会打开一片新天地。最近在长读长上，10X Genomics 同样遇到来自华大的挑战。华大并没有放弃 LFR 这一技术（毕竟 cPAL、DNB、Patterned Array、LFR 是 GC 的几

21、大看家本领）。就像 cPAL 升级为 cPAS 一样，华大几年如一日的优化研究终于推出了LFR 的革新版 stLFR（Single Tube Long Fragment Read，简称 stLFR），stLFR技术作为一款突破性的技术，能够在一管中完成所有反应，极大地降低长片段文库构建复杂程度和成本消耗。整个操作无需微量自动化移液设备，无需进行 MDA扩增，无需微流控液滴生成装置和芯片，样本起始量低至 1ng。基于无分隔共标记的理念，该方法利用磁珠表面形成数千万个虚拟分隔，不同虚拟分隔均携带不同的分子标签。经过酶反应后，高分子量 DNA（long fragments）被片段化，同时来源于相同高

22、分子量的片段化短 DNA（sub fragments）被标记上相同的分子标签，从而实现在测序后通过分子标签还原长片段信息（如图 10）。图 10 stLFR 技术原理如果说 Nextera DNA Flex Library Preparation Kit 将极速建库做到了极致，stLFR 则是目前基于二代测序的长读长技术的典范，它近期推出了成熟的试剂盒，我们马上就能看到它的能量。Tn5 引爆了极速建库和长片段之战，但是 Tn5 的花样不止于此，ATAC-seq、单细胞测序、mate pair 文库构建，等等。ATAC-seq 利用转座酶代替 DNase I 核酸酶分析染色质可接近性，更加简便、

23、投入量更低、通量更高。理论上简单到：ATAC-seq 只要加一步细胞核提取，既可以用普通 Tn5 建库试剂盒完成建库。当然优化上会有一堆的事情，比例配合清华大学颉伟课题组开发 CARM 技术（CRISPR/Cas9-assisted removal ofmitochondrial DNA），能去除线粒体 DNA 的污染，极大地提高数据利用率。在单细胞基因组扩增中，2017 年谢晓亮课题组发表的 LIANTI 方法，替换了phi29，用的就是带 T7 启动子的 Tn5 转座子打断，然后用 T7 启动子体外线性扩增。单细胞转录组，由于转录组产物量少，后续的 DNA 建库一般是用 Tn5 进行微量建

24、库（1ng 起始）。Nextera Mate Pair Library Kit（Illumina 的 Nextera 系列）采用转座酶将其含有生物素标记的识别序列随机插入基因组 DNA 中，使 DNA 片段打断至合适大小（2-15K），补平后，采用平末端自身环化构建 Mate Pair 文库。利用转座酶反应，同时完成 DNA 片段化与结合 biotin 标签，极大提高了样本 DNA 的利用率，同时也缩短了实验周期；通过在打断的基因组 DNA 两端加上含有生物素标记的接头序列，避免生物素标记的 dNTP 掺入到 DNA 片段的中间，减少了非特异性标记，提高数据准确性和利用率。诺唯赞也有类似的试剂盒，性价比很高。可以说 NGS 的发展，Tn5 会被玩出越来越多的花样作者简介：csp:熟悉 NGS 各类建库技术，主攻 DNA 方向；杨婷婷：擅长转录组建库试剂盒开发，熟知竞品性能相关文章链接：磁珠起源微信公众号NGS 实验起源