褐环粘盖牛肝菌的研究性论文.docx

1、褐环粘盖牛肝菌的研究性论文1 引言褐环粘盖牛肝菌（Suillus luteus）是一种应用价值很大的外生菌根真菌，它具有拮抗性强、适生范围广、菌根效益显著等特点1。自然界大部分植物都有菌根，有些植物没有菌根就不能生长或生长不好2。菌根能代替根毛扩大寄主植物根系的吸收面积，有效促进植物对土壤营养的吸收3-7；产生的植物激素、抗生素、酶和挥发性物质，对植物生长发育及分化起着调控等多重作用8；对根部土传病害有屏障作用，增强寄主植物的抗病性9-13；能极大提高植物对寒冷、高温、干旱、过湿、高盐以及含有过量有毒物质等不良环境的适应能力14-17，提高新建苗圃、引进树种的育苗成活率18-20。随着人们对外

2、生菌根与植物生长关系的认识不断深入，外生菌根在生态稳定、农林生产等方面所表现出来的重要性已越来越引起人们的关注，并积极开展对外生菌根菌应用的研究。主要的应用方式是将外生菌根菌的子实体、菌丝、孢子等制成菌剂，用于菌根化苗木和大面积造林。其中菌丝是真菌无性繁殖的营养体，具有遗传性能稳定、不需要经过孢子萌发阶段、能迅速与树木形成菌根等特点21，因此对外生菌根真菌菌丝体菌剂的应用研究最为广泛。国外对外生菌根菌菌丝体菌剂开发应用较早，80年代初，美国的Danieson和Boyle用菌丝悬液接种班克松和黑云杉苗木根系，菌根形成较好22。目前，美国已研制成功十几种商业剂型，比较大的菌剂生产商是PHC公司和F

3、MA公司。法国是将菌丝体包埋于海藻胶丸内，形成胶丸菌剂。澳大利亚也完成了胶丸菌剂生产的工业化技术研究23-24。国内对外生菌根真菌菌丝体菌剂的研究起步较晚，目前正处于发展阶段。闫伟等将彩色豆马勃菌丝体粉碎后，与一定浓度的海藻酸盐溶液混匀，并注入固化剂中固化成型，研制成功了高效胶囊菌剂25。中国林业科学研究院林木菌根研究开发中心自20世纪80年代以来通过筛选出适合不同立地条件和树种的优良菌根真菌，已研制成功多种剂型菌根剂，并建立了我国首条菌根制剂生产线，年产可达1000t26。外生菌根真菌菌丝体菌剂的生产方式主要有两种，一种是固体培养，另一种是液体培养。固体培养是指利用自然底物如木质、草质进行固

4、体发酵，其主要特点是发酵体系没有游离水存在，菌丝的生长是在有足够湿度的固态底物上进行。底物则既不溶于水，也不悬浮于水中，它不仅起到一个提供碳源、氮源、水分、无机物和其它营养物的作用，同时也为微生物的生长提供了一个固定的位置。用营养液浸湿的蛭石和草炭是产生外生菌根真菌菌丝的极好基质27。中科院沈阳应用生态研究所和北京林业大学等，先后用棉子壳、麦麸子、木屑、玉米粉等为基质扩大培养菌根菌，取得了良好效果28。液体培养是采用液体基质，通入无菌空气或加以振荡和搅拌来进行菌丝体的培养。液体培养与固体培养相比有很多优越性：1）生产周期短，菌种在液体培养下的生长周期一般为10-15天，而固体培养一般需要30天

5、左右29，仅发菌时间就比固体培养节省了2/3-1/2；2）产量高，在液体深层培养中，菌丝细胞能在反应器内处于最适温度、酸碱度、氧气和碳氮比等条件下生长，呼吸作用所产生的代谢废气又能及时排放，因此新陈代谢旺盛，菌丝生长分裂迅速，能在短时间内产生大量的菌丝体30；3）菌龄一致，由于固体培养是菌丝在固体基质中蔓延长成的，这样处于基质顶部和底部的菌丝体菌龄差异较大，往往底部菌丝刚开始生长，顶部菌丝就已接近老化。而液体培养就不一样，菌种生长发育均匀一致，菌龄整齐；4）产物易加工，固体培养的菌丝与固体基质紧密结合，不易分离。液体培养的菌丝取样容易，可以精加工成各种类型菌剂。因此利用液体培养的方法生产外生菌

6、根真菌菌丝体前景更为广阔。鲁达科夫利用洁净的甘蓝或马铃薯100g，用1000mL清水煮沸后过滤其残渣留下汁液并加入0.3%的葡萄糖和微量的维生素B1，混匀后经高温灭菌消毒接入菌根菌种进行培养，待菌丝体长好后用消毒研钵碾碎菌丝体并配制成悬浮液接入通气的液体培养液中进行再次扩大培养，可以获得大量的菌丝体31。Marx利用MMN培养液接种菌种，在摇床和发酵罐 中进行液体培养，在高强度通气条件下，菌丝体可大量繁殖32。童竞心等采用液态通气的方法扩培彩色豆马（Pisolithustinctorius）菌丝体，用于接种国外松，取得了较好的效果33。王学聘等对厚环粘盖牛肝菌（Suillus greville

7、i）进行深层发酵培养，认为该菌具有发酵周期短，生长迅速，易于工业化生产等特点34。但到目前为止，只有少数几个菌种可以通过液体培养的方法生产出菌丝体菌剂，其主要原因是大多数外生菌根真菌在液体培养的条件下生长缓慢甚至不能生长，无法繁殖出足够的菌丝体在生产实践中使用35。外生菌根真菌菌丝体的生长不仅取决于菌种本身的性能，关键还要赋予它合适的生长条件。因此，在纯培养的条件下对外生菌根真菌的生长特性进行研究显得尤为重要。根据以往的研究，褐环粘盖牛肝菌在液体培养的条件生长比较缓慢，所以无法制成菌剂，限制了它的进一步应用推广。本论文以固体纯培养和液体纯培养的方法，对褐环粘盖牛肝菌的培养条件进行了研究，旨在为

8、以后的工业化生产其菌剂提供理论依据。1.1 真菌培养条件的研究影响真菌生长的因素主要包括培养基、pH、种龄等方面，各个影响因素也不是单一作用，它们之间的关系比较复杂，而且在实际运用当中这些因素还是处于不稳定的状态36。1.1.1 培养基培养基是按一定比例配制的多种营养物质混合物，其主要作用可概括为形成结构（参与细胞组成），提供能量（机体进行各种生理活动所需要的能量），和调节作用（构成酶的活性成分和物质运输系统）。培养基的组成对菌体的生长繁殖、生物合成都有重要的影响，因此优化培养基是优化真菌培养的首要前提。郭思琪等通过对厚环粘盖牛肝菌的菌种培养基筛选研究表明，适宜厚环乳牛肝菌生长的培养基组成为：

9、麦芽糖2g，葡萄糖2g，可溶性淀粉2g，硫酸镁0.15g，硝酸钙0.15g，磷酸二氢钾0.125g，水1000mL37。姚庆智等人通过对11株外生菌根真菌菌株纯培养营养生理特性的研究表明，11株外生菌根真菌适宜的基础液体培养基为麦芽汁培养基和Pachlewski培养基38。王平章以麦芽为原料制成麦芽汁培养基来培养毕赤酵母（Pichia pastoris）基因工程菌，其经济效益及产出与投入之比是合成培养基的200倍39。Zhu等用黑箱模型，设计优化轮枝链霉菌（Streptove rticillium）的产酶培养基，使酶活提高了4倍40。培养基的组成成份主要有碳源、氮源、无机盐及微量元素和生长因子

10、等。1.1.1.1 碳源碳源的主要作用是供给真菌生命活动所需要的能量和构成菌体细胞成分和代谢产物中的碳素来源。由于各种真菌的生理特性不同，不同的真菌利用碳源的品种也不完全相同。常用的碳源有葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、玉米粉、以及动植物油脂、矿油、碳氢化合物等。大多数外生菌根真菌可以利用单糖，有一些可以利用双糖和多糖。Palmer等人研究了粘盖牛肝菌（Suillus bovinus）对不同碳源的利用情况，发现较理想的碳源依次为葡萄糖、甘露糖、木梨糖和麦芽糖，而对甘油和蔗糖利用效果不理想41。Tomoyuki等通过对十几种牛肝菌的营养特性的研究得出结论，葡萄糖是这些外生菌根菌普遍利用良好的碳

11、源，并且高浓度的碳源会促进真菌的生长42。Takefum等研究了外生菌根真菌将不同脂肪酸和油酸作为碳源的能力，发现不同菌种对脂肪酸和油酸的利用能力不同43。腐生真菌可以通过分泌纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶等胞外酶分解利用纤维素和木质素，外生菌根真菌由于分泌纤维素酶的能力较差而普遍不能利用。纤维素酶是一种诱导酶，肖光辉对香菇（Lentinus edodes）的研究发现，培养基加入少量的易利用的碳源如米糠，可逐步诱导纤维素酶的产生44。当培养基中加入少量葡萄糖为起始碳源，黄口蘑可适度利用纤维素。Lamb等研究发现，在葡萄糖的存在条件下，一些粘盖牛肝菌可以很好的利用糊精和可溶性淀粉45。碳源浓度对真

12、菌生长的影响极为明显，在一定的浓度范围之内，菌体生长量随碳源浓度增加而增加，但是碳源浓度过高，渗透压增大会影响菌体生长。花晓梅对彩色豆马勃的最佳营养源进行了研究，结果表明，彩色豆马勃的最佳碳源为玉米粉，当浓度为4%时，菌丝干物重最大，当浓度超过4%，干物重逐渐下降46。另外，碳源浓度过高，会促进真菌分泌酸性物质，使培养基的pH下降47。1.1.1.2 氮源氮源是用来合成真菌细胞中的含氮物质的。常用氮源主要分为有机氮源和无机氮源。有机氮源除含有丰富的蛋白质和游离氨基酸外，往往还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子。常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水。真菌在含有机氮源的培养基中常表现

13、出生长旺盛、菌丝体生长迅速的特点。如大多数食用菌在有机氮源培养基上生长健壮、速度快，在无机氮源培养基上生长缓慢、细弱48。外生菌根真菌对酰胺类的有机氮源利用较好，如谷氨酰胺和门冬酰胺52。对无机氮源中的铵盐利用较好，某些外生菌根真菌非但不能利用硝酸盐，反而会受到毒害。郭秀珍等从油松上分离的一种牛肝菌和厚环粘盖牛肝菌，对有机氮利用最好，其次是铵态氮，而对硝态氮的利用最差31。但有些外生菌根真菌对硝酸盐的利用效果与铵盐一样，如外生菌根真菌白毒伞（Amanita Verna），磷酸氢二铵和硝酸钾是其生长的最好氮源49。Tibbett分析了外生菌根真菌Hebeloma spp在无机氮源和有机氮源的生长

14、时发现大部分株系在有机氮源即谷氨酸生长要优于无机氮50 。Abuzinadah等以有机氮源作为外生菌根真菌的氮源研究发现，不同的外生菌根真菌对不同形式的有机氮源的吸收利用存在很大差异，有的真菌能在蛋白质和多肽上生长，有的则生长较弱51。真菌对无机氮源的利用迅速，菌丝生长启动较快，以后的生长比较平缓；在有机氮源上生长的真菌菌丝启动较慢，但能保持较长的高生长率时期。因此，在真菌培养的研究当中，很多都利用无机氮源和有机氮源按一定比例配制的复合氮源作为真菌生长的氮源。如花晓梅等的研究结果表明，以蛋白胨和氯化铵组成的复合氮源培养彩色豆马勃菌丝体，菌丝体的生长势要优于单一氮源46。一般来说，氮源浓度与真菌

15、的生长有很大关系，氮源浓度高，菌丝体生长旺盛，但会使培养基pH偏高，氮源浓度过低，则菌丝体繁殖量少。Dickie等在不同浓度的蛋白质培养基上对彩色豆马勃等7种真菌实验证实，供试的7种真菌中有5种在高浓度氮上生长很好，有1种在低浓度上生长很好，有1种没有差别52。此外，Colpaert研究认为，真菌氮的代谢可能与pH值有关，因为在不同的pH值时真菌Amanita muscaria表现出不同的蛋白酶形态53。1.1.1.3 无机盐及微量元素无机盐为真菌生长、发育代谢所不可缺少的重要营养元素。它们参与真菌细胞的合成、辅酶代谢、能量转移，作为酶的激活剂控制原生质的物理性质和细胞的渗透性，在菌体与培养基

16、之间起重要的缓冲和调节作用。一般真菌所需要的无机盐包括硫酸盐、磷酸盐、氯化物和含钾、钠、镁化合物等。外生菌根真菌对磷酸盐的需要量较大，但培养基中磷酸盐浓度过高同样会对菌根真菌的生长产生抑制54。袁玲等通过研究钾离子对外生菌根真菌菌丝生长的作用时发现，液体培养基中的钾离子会影响真菌分泌酸性物质和对其他养分的吸收利用55。Nagarajan 指出，适量的钠盐对菌根真菌细胞质代谢有促进作用56。Blomberg 则发现，在0.05mol/L-0.2mol/L之间，钠盐抑制了菌根真菌菌丝酶的活动57。微量元素包括铜、锰、锌、铁、钴、铝、碘、溴等，它们多数是辅酶的成分，参与酶蛋白的合成，是酶的激活剂。如

17、二价铁离子对克雷伯氏菌（Klabsiellaoxylaca）的1,3-丙二醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶都有激活作用58。外生菌根真菌等大型真菌对微量元素的需求量很少，浓度过高反而会影响其新陈代谢，导致菌丝的生长不良。白淑兰等通过微肥对菌根真菌菌丝体的生长的研究发现，浓度为0.01%的Na2B4O7 对外生菌根真菌L.laccata 的菌丝体生长有促进作用，其它浓度的Na2B4O7以及MnSO4、ZnSO4、（NH4）6Mo7O24 对L.laccata 均有抑制作用59。1.1.1.4 生长因子生长因子指那些微生物生长所必需的而且需求量很小，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机物

18、，根据据化学结构与功能可分为三大类:维生素、氨基酸和嘌呤、嘧啶。很多外生菌根真菌真菌对生长因子是异养的，例如牛肝菌（Boletus）在生长中就需要维生素B1和维生素B2，黄色须腹菌（Rhizopogonluteolus）在生长中需要肌醇，土生空团菌（Cenococcum geophilum）需要维生素H31。但生长因子超过一定浓度时，就会抑制真菌的生长。Kahlos报道说，在麦芽汁和固体培养基中分别加入丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和丝氨酸，当浓度为0.1g/L时，除了在麦芽培养基中的甲硫氨酸外，其它所有氨基酸均促进了桦褐孔菌（Inonotus obliquus）菌丝体生长。在浓度

19、为0.9g/L时，在固体培养基中的所有氨基酸均减缓了该菌的生长。甲硫氨酸有最强的生长抑制作用60。1.1.1.5 添加物在微生物工业中，为了进一步大幅度提高发酵产率，培养基中除了碳源、氮源、无机盐、生长因子等成分外，考虑到代谢控制的方面，还需要添加某些特殊功用的物质。例如，在博莱霉素发酵培养基中加入前体物质天然或非天然博莱霉素的末端胺，可以抑制其它天然博莱霉素的生成，并生成包含该种末端胺的新的博莱霉素产物61。有研究表明，同样存在着某些物质对真菌的生长分化起着特殊作用。杜爱玲等在研究覆土对双孢蘑菇（Agaricus bisporass Imbach）子实体形成作用时，发现双孢蘑菇栽培必须覆土才

20、能形成子实体，从而推定覆土层中的微生物或其它未知因子对蘑菇菌丝体生长和子实体形成有影响62。佟丽华发现某些伴生菌或其培养液的有机溶剂提取物对牛肝菌菌丝体生长具有明显促进作用63。Fries认为红酵母和宿主植物根系浸出物是引发菌根真菌孢子活化因子64-65。许旭萍等研究发现，红菇（Rus sula Spp.）在人工培养条件下虽然能够进行组织分离而获得纯培养菌株，但其孢子却难以发芽，野生条件下，植物根系分泌物对红菇孢子的萌发有刺激作用，可在野生条件下逐步发育成子实体66。因此，开展微生物提取物、寄主植物提取物和土壤提取物对外生菌根真菌菌丝体生长影响的研究，并分析其中的各种促进和抑6制因子，也是研究

21、外生菌根真菌菌丝生长条件的一条途径。1.1.2 pH真菌生长的最适pH范围一般在5-8之间67，过高或过低的pH对大多数真菌都有害，但酵母菌中有些种类如椭圆酵母（Saccharo my ces ellipsoideus）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）最低可分别在pH2.5和pH1.9中生长68。大部分外生菌根真菌的最适pH在4-6，有一些菌根真菌中性或微碱性条件下生长较好。Sanchez等发现，供试的大部分菌根真菌在pH为2.5时，生物量最小69。Yamanka认为所研究的外生菌根真菌的最佳pH生长环境为5-670。姚庆智等对11种外生菌根真菌的最适pH进行了研

22、究，结果表明这11种外生菌根真菌适宜pH值为6-738。pH也会对真菌的酶活产生影响，从而改变真菌的代谢途径，如黑曲霉（Aspergillus niger）在pH2-3时合成柠檬酸，在pH接近中性时积累草酸。谷氨酸生产菌在中性和微碱条件下积累谷氨酸，在酸性条件下形成谷氨酰胺71。大多数真菌能分解糖，产生酸性物质，造成环境的pH值下降，少数真菌能分解尿素成氨，使环境pH值上升，蛋白质脱羧产胺反应也会使pH值上升72，外生菌根真菌在生长过程中会分泌有机酸如柠檬酸、草酸、甲酸等，使周围环境pH大幅度下降73。所以说，真菌的代谢活动会改变环境的pH值。pH的变化对真菌生长的影响也很大，Myu报道说，p

23、H的降低会抑制K.pneu mnina合成2，3-丁二醇74。Hebbar等研究认为将培养基的pH由7.0调至10.0，镰孢菌（Fusarium）产生的厚垣孢子的成活率会大大提高75。Collnig等人发现黄曲霉（Aspergillusflavus）的细胞壁厚随pH的增加而减小，其菌丝在pH为6.0时为2-3m，在pH为7.4为2-18m76。因此必须掌握真菌生长过程中pH变化规律，使它处于菌体生长最佳状态。在工业发酵中，可以通过流加酸、碱或补料的方式来控制pH，而在实验室条件下首要的控制方法是调整培养基配方和添加缓冲体系。添加缓冲体系比较直接有效，但选择了不适当的缓冲体系也会带来负作用，比如

24、尹艳丽等研究了不同摇瓶条件对侧耳菌（Pleurotus sp.）的生长及漆酶分泌的影响时发现，用硫酸调pH时的漆酶活力和生物量要高于缓冲液体系调节pH的结果77。1.1.3 种龄在对真菌的研究当中，需要将真菌逐级扩大繁殖，用于扩繁的起始菌种称为种子，种子培养时间称为种龄。由于真菌在生长过程中，不同生长阶段的生理活性差别很大，种龄的研究就极为重要。在种子培养过程中，随着培养时间的延长，菌体量逐渐增加。但是菌体繁殖到一定程度，由于营养物质消耗和代谢产物的积累，菌体量不再继续增加，而是逐渐趋于老化。一般以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长中后期为宜，此时的种子活力高，接入培养基后能较快地进入对数生长，

25、有利于缩短培养周期。若种子培养不完全就接入培养基，往往出现前期生长缓慢，导致培养周期延长，接入过老的种子，由于菌体活力不够，会引起产能下降和菌体过早衰老、自溶。杨梅等人研究了白背木耳深层培养条件，认为最佳种子培养周期为5d，周期过长或过短，都会使菌丝生物量下降78。1.2 本研究的目的与主要内容褐环粘盖牛肝菌是一种优良的外生菌根真菌。在对该菌最适pH的研究中，不同的研究者所得到的研究结果不一致，而且所采用的研究方法几乎都是每次改变一个因素的单次单因子法，这种方法不能考察各因素之间的交互作用，这就使得在每个因素的最佳实验点的操作条件下，通常得不到预期的实验效果。本研究利用缓冲液体系对褐环粘盖牛肝

26、菌的生长最佳pH进行了研究，并对培养过程中的影响因素pH和碳、氮源浓度间的协同作用进行了初步探讨，为以后的深入研究做了基础工作。主要的研究内容有：1）筛选出了褐环粘盖牛肝菌生长的最佳基础培养基；2）研究了种龄对褐环粘盖牛肝菌生长影响；3）研究了21种添加物对褐环粘盖牛肝菌生长的影响；4）首先以缓冲液体系研究了pH对褐环粘盖牛肝菌生长的影响，然后通过筛选缓冲液和缓冲液浓度确定了最佳缓冲液体系，最后通过最佳缓冲液体系得到了褐环粘盖牛肝菌生长的最佳pH；5）在不同的pH条件下分别研究了碳、氮源浓度对褐环粘盖牛肝菌生理生长的影响，并得出了其生长的最佳碳、氮源浓度。2 材料与方法2.1 供试菌种褐环粘盖

27、牛肝菌，由内蒙古农业大学林学院菌根技术研究室提供。2.2 试验方法2.2.1 固体培养选用培养了6-8d 的菌种，接入供试固体培养基，25恒温培养。每隔2d 用游标卡尺测量相互垂直两个方向的菌落直径，取平均值。培养14d 后，将固体培养基加适量水加热熔解，过滤后，用蒸馏水清洗3 次，然后收集菌丝。收集的菌丝于60烘干，万分之一分析天平测干物重。每个试验重复4 次。2.2.2 液体培养选用培养了6-8d 的菌种，从上切取一圆形菌块接入液体培养基中，装液量为10mL/100mL，25恒温静置培养。培养14d 后，滤出液体培养基中的菌丝，用蒸馏水冲洗三次，60烘干，万分之一分析天平称重。培养后的培养

28、液分别用PHS-3B精密pH计测定pH、用WFZ800-D3A型分光光度计 处测OD257nm以显示色素分泌程度、用砷钼酸比色法79测定残糖、用纳氏比色法80测定残氮。每个试验重复3次。2.3试验设计2.3.1基础培养基的筛选根据相关文献，选用Pach、MMN、MM、综合PDA和蛋白胨酵母膏五种培养基，分别配制固体培养基，pH调至5.5。接种后25下培养，以菌丝的日均生长量为指标，寻找适合褐环粘盖牛肝菌生长的基础培养基。2.3.2菌种种龄与活力试验分别将培养了4、6、8、10、12、14d的菌落作为起始菌种接种于pH5.5的Pach固体培养基上，接种后25下培养，以此研究种龄与生长状况之间的关

29、系。2.3.3添加物试验2.3.3.1蘑菇汁褐环粘盖牛肝菌生长的影响将平菇（Pleurotusostreatus）、香菇（Lentinus edodes）、鸡腿菇（Coprinuscomatus）、双孢菇（Agricas bisporus）、蟹味菇（Hypsizygus mammoreus Bigelow）、金针菇（Flammulina velutipes）榨汁，3000转/min离心20min，取上清液灭菌，按10%的体积比加入到Pach培养基中，pH调至5.0，制成固体培养基，接种后在25下培养。观察不同蘑菇汁对褐环粘盖牛肝菌生长的影响。2.3.3.2松树叶、枝、根的浸提液对褐环粘盖牛肝菌

30、生长的影响分别选取油松（Pinus tabulaeformis Carr）、白杄（Picea meyeri）、侧柏（Platycladus Spach）、杜松（Juniper Berry）、圆柏（Sabina Mill.）的松叶、松枝和松根各10g，110灭活后80烘干12h，捣碎加入100ml蒸馏水，煮沸浸提40min后过滤，将滤液按体积比10%加入到Pach培养基中，pH调至5.0，制成固体培养基，接种后在25下培养。观察不同松树浸提液对褐环粘盖牛肝菌生长的影响。2.3.4 pH和缓冲液体系对褐环粘盖牛肝菌的影响2.3.4.1非缓冲体系下pH对褐环粘盖牛肝菌生长的影响以Pach培养基为基础

31、培养基，用1mol/L的KOH和HCl将pH分别调节到3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0，分别制成固体和液体培养基，接种后在25下培养。92.3.4.2柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系下褐环粘盖牛肝菌的生长情况用柠檬酸和柠檬酸钠配制成pH4.5、5.0和6.0的缓冲液，以15、30、45、60%的体积比加入到Pach培养基中，制成固体培养基，接种后25下培养。2.3.4.3适宜缓冲液体系的研究分别配制pH4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钾缓冲液和乙酸-乙酸钠缓冲液，以体积浓度40%加入到Pach培养基中，以酸碱调节pH的培养基

32、为对照，分别配制成固体培养基，接种后25下培养。以菌丝生长量为指标来确定最佳缓冲液。将最佳缓冲液配制成pH4.5的缓冲液，以体积浓度10、20、30、40、60、80、100%加入到Pach培养基中，以酸碱调节pH的培养基为对照，分别配制成固体培养基来培养褐环粘盖牛肝菌，以菌丝生长量和菌丝干重为指标来确定最佳缓冲液浓度。2.3.4.4以最佳缓冲液体系调节pH对褐环粘盖牛肝菌生长的影响利用试验所确定的最佳缓冲液体系，配制pH为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0的缓冲液加入到Pach培养基中。分别配制固体培养基和液体培养基，接种后25下培养。2.3.5不同pH条件下碳、氮源浓度对褐环粘盖牛肝菌的影响2.3.5.1不同pH条件下碳源浓度对褐环粘盖牛肝菌生长影响用最佳缓冲液体系将Pach培养基的pH设置为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，7.0七个处理，选取0、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0