第十章 细胞内蛋白质的分选和运输Word格式.docx

1、这一假说可以说明为什么没有微粒体存在时合成的蛋白质比有微粒体时合成的蛋白质要长，长出的一段肽链就是信号序列。进一步的实验表明，存在于新合成分泌蛋白前体的N-末端信号序列也存在于膜蛋白和溶酶体酶蛋白的前体，它们都是在糙面内质网合成的。把这种信号序列用重组DNA技术接到原来不进入内质网的蛋白质上，就可引导它们进入内质网。除了输入内质网的蛋白质有信号序列外，由细胞质基质直接输入细胞核、线粒体和过氧化物酶体的蛋白质都带有各自的信号序列，引导它们靶向运输。图10-1 糙面内质网蛋白质合成的信号假说（引自Alberts等，2002）参照前书图13-1蛋白质的分选信号至少有两种类型（图10-2），一类是信号

2、肽，另一类是信号斑（ signal patch ）。信号肽是位于蛋白质上的一段连续的氨基酸序列，一般有15-60个氨基酸残基，具有分选信号的功能。在引导蛋白质到达目的地，即完成其分选信号任务后，信号肽常常从蛋白质上被切除。图10-2 蛋白质的分选信号（A）信号肽，（B）信号斑参照前书图13-2信号斑是位于蛋白质不同部位的几个氨基酸序列在多肽链折叠后形成的一个斑块区，具有分选信号的功能。信号斑是一种三维结构，当多肽链伸展时，组成信号斑的不同氨基酸序列可在多肽链上相距很远，在完成分选任务后，这些氨基酸序列继续存在。信号肽通常引导蛋白质从细胞质基质进入内质网、线粒体和细胞核，同时也引导蛋白质从细胞核

3、送回到细胞质基质以及从高尔基体送回到内质网；信号斑则引导一些其他分选过程，如在内质网合成的溶酶体酶蛋白上存在一种信号斑，在高尔基体的CGN中可被N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶所识别，从而使溶酶体酶蛋白上形成新的分选信号M-6-P，进一步在TGN中被M-6-P受体识别,并分选进入运输小泡最终送到溶酶体（详见第十章）。每一种信号序列引导蛋白质到达细胞内一个特定的目的地（表10-1）。要运送到内质网的蛋白质，在其N-末端有一段信号肽，其中间部分有5-10个疏水氨基酸。带有这种信号肽的蛋白质，都会被运送到内质网，并进一步被运送到高尔基体，其中一部分蛋白质在C-末端还带有一个由4个氨基酸组成的信号肽，它们

4、在高尔基体的CGN部位被识别并被送回内质网，是内质网驻留蛋白质；要运送到线粒体的蛋白质，在其N-末端带有一种信号肽，其信号序列中带阳电荷的氨基酸和疏水氨基酸呈交替排列；要运送到过氧化物酶体的蛋白质，在其C-末端有一种由三个特征性氨基酸组成的信号肽；要运送到细胞核的蛋白质，其信号肽中有一串带阳电荷的氨基酸，这一信号序列可位于蛋白质的任何部位。表10-1 几种典型的信号序列_信号序列的功能 信号序列_输入到细胞核 -Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-从细胞核输出 -Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Leu-Asp-Ile-输入到线粒体 +H3N-

5、Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys- Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-输入到过氧化物酶体 -Ser-Lys-Leu-COO-输入到内质网 +H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile- Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys- Glu-Val-Phe-Gln- 回输到内质网 -Lys-Asp-Glu-Leu-COO-用遗传工程技术可证明信号序

6、列对引导蛋白质运输的重要性。例如，把引导蛋白质进入内质网的N-末端信号肽装到细胞质基质的其它蛋白质上，就会引导这些蛋白质进入内质网。实验还证明，具有同样目的地的各种信号肽是可以互换的，尽管它们的氨基酸序列有很大的不同，接在任何蛋白质上都可引导它们到达目的地。在信号肽的识别过程中，物理特性（如疏水性）往往比氨基酸序列更重要。目前对信号斑的结构了解得还很少，因为实验分析信号斑比信号肽困难得多，信号斑是蛋白质折叠后的三维结构，不能把它们从一个蛋白质转接到另一个蛋白质上，而且实验性改变很容易破坏信号斑的三维结构。二、 细胞内蛋白质运输的途径细胞内的蛋白质分子在细胞质基质的核糖体上开始合成，然后根据其氨

7、基酸序列中的分选信号种类决定它们的运输途径；细胞外的一些蛋白质分子也可经胞吞作用摄入细胞内，进入特殊的运输途径。因此，细胞内蛋白质有多种运输途径，一般可分为三种类型：（一） 翻译后转运的蛋白质运输途径蛋白质在核糖体上合成后释放到细胞质基质中，其中一些蛋白质不带分选信号，就留在细胞质基质中；而大多数蛋白质带有分选信号，将按其分选信号种类分别转运到细胞的不同部位。由于这种转运是在蛋白质分子完全合成后进行的，因此称为翻译后转运（post-translational translocation）。属于这种蛋白质运输途径的主要有：（1）蛋白质从细胞质基质通过核孔复合体到细胞核的运输；（2）蛋白质从细胞质

8、基质到线粒体的运输；（3）蛋白质从细胞质基质到过氧化物酶体的运输。近年来体外实验还发现，有少量蛋白质可在细胞质基质完全合成后转运到内质网，这种情况在酵母中更多见。（二） 共翻译转运的蛋白质运输途径蛋白质在核糖体上合成过程中转移到内质网，即在核糖体上多肽链开始合成不久，在N-末端形成的信号肽引导核糖体附着到内质网膜上，信号肽穿入内质网腔并继续其合成过程，新合成的多肽链可游离于内质网腔内成为可溶性蛋白，也可插入内质网膜成为跨膜蛋白。以这种方式合成的蛋白质除一部分留在内质网外，大部分将运送到高尔基体，在那里作进一步分选和运输。由于这种转运是在蛋白质合成过程中进行的，因此称为共翻译转运（co-tran

9、slational translocation）。（1）蛋白质从内质网经高尔基体到细胞外的运输，称为生物合成-分泌途径（biosynthetic secretory pathway）；（2）蛋白质从内质网经高尔基体到溶酶体的运输。（三） 蛋白质的胞吞途径细胞通过胞吞作用摄取细胞外蛋白质和其他大分子，进入胞吞小泡，并进一步经内体运送到溶酶体，在那里大分子被降解，降解产物进入细胞质基质为细胞利用，这种蛋白质运输途径称胞吞途径（endocytic pathway）。三、 细胞内蛋白质的运输方式蛋白质在细胞质基质与细胞器或细胞核之间、细胞器与细胞器之间以及细胞内与细胞外之间的运输有三种不同的方式，即门

10、控运输（gated transport）、穿膜运输（transmembrane transport）和小泡运输（vesicular transport）。（一）门控运输蛋白质在细胞质基质与细胞核之间的运输通过核孔复合体进行，核孔复合体象一扇能选择性开放的门，对核质之间的物质交换进行调控，因此把这种蛋白质运输方式称为门控运输。门控运输既具有选择性，又具有双向性。小分子物质可以自由地通过核孔复合体，在核质之间是一种被动运输；而大分子物质通过核孔复合体则是一种耗能的主动运输过程。门控运输一方面介导细胞质基质的蛋白质向细胞核内运输，另一方面又可介导细胞核内的大分子向细胞质运输。（二）穿膜运输 穿膜运输

11、主要发生在细胞质基质与细胞器之间，蛋白质穿过细胞器的膜从细胞质基质进入细胞器内。蛋白质穿膜运输的靶细胞器界膜中存在一种特殊的蛋白质转运子（protein translocator），其功能是识别蛋白质的分选信号并邦助其穿膜。一般情况下，要穿膜的蛋白质必须呈非折叠状态才能完成穿膜运输，但也有一些蛋白质可以在折叠状态下穿膜。蛋白质从细胞质基质进入内质网、线粒体和过氧化物酶体都采用穿膜运输方式。（四） 小泡运输细胞器之间通过运输小泡（transport vesicle）进行的蛋白质运输称为小泡运输（图10-3）。从内质网到高尔基体、从高尔基体一个膜囊到另一个膜囊、从高尔基体到晚期内体和细胞表面以及从

12、细胞表面到溶酶体的蛋白质运输都是通过小泡运输方式来实现的。运输小泡直径为50-100nm，它从一个细胞器以芽生方式形成，小泡内装着运输的蛋白质，小泡膜内装着膜蛋白，当它到达靶细胞器时即与其融合，将蛋白质从一个细胞器运送到另一个细胞器。图10-3 小泡运输模式图参照前书图13-3蛋白质在细胞内的运输方式是由蛋白质分子上的分选信号决定的。在门控运输时，蛋白质分子上的分选信号与位于核孔复合体部位的相应受体特异结合才能介导主动运输；在穿膜运输时，蛋白质分子上的分选信号必须被靶膜中相应的蛋白质转运子所识别，否则不能穿膜；在小泡运输中，蛋白质分子上的分选信号与运输小泡膜上特殊受体相结合，然后作定向运输，每

13、种新形成的运输小泡只运送一种蛋白质，并与特定的靶细胞器融合。第二节 细胞内蛋白质的门控运输在细胞核和细胞质之间不断地进行着双向的物质运输，这种运输是通过核孔复合体进行并受其调控的，因此称为门控运输。许多在细胞核内行使功能的蛋白质，如组蛋白、DNA和RNA聚合酶、基因调节蛋白等，是在细胞质基质内合成后运送到细胞核的；与此同时，一些在细胞质内行使功能的大分子如tRNA和mRNA，是在细胞核内合成后被运送到细胞质基质的；有些转运过程更为复杂，如核糖体蛋白在细胞质基质中合成后输入到细胞核内，与细胞核内合成的rRNA一起装配成颗粒，然后以核糖体亚基的形式再运送到细胞质基质。细胞核与细胞质之间的物质运输是

14、十分繁忙的，例如在DNA合成期的细胞中，需要每3分钟从细胞质基质输入106个组蛋白分子到细胞核内，以便与新合成的DNA一起组装成染色体，这意味着平均每个核孔复合体每分钟输入100个组蛋白分子。又如在快速生长的细胞中，平均每个核孔复合体每分钟需要输出多个新装配的核糖体亚基进入细胞质基质以满足大量合成蛋白质的需要。这还仅仅是通过核孔复合体运输的一部分。实验分析表明，在核孔复合体内有一个直径9nm、长15nm的圆柱形通道，细胞核与细胞质之间的物质运输通过这一水溶性通道进行。小的水溶性分子包括离子、小分子代谢产物和小的蛋白质分子（分子量小于60KDa）等可以自由通过这一通道，但大的分子或颗粒如DNA和

15、RNA聚合酶和核糖体亚基等，其大小巳超过核孔通道的直径，则不能自由通过，它们是通过耗能的主动运输过程进出核孔通道的。一、 门控运输的蛋白质分选信号及其受体蛋白质和其他大分子物质通过核孔复合体的主动运输是一个信号识别和载体介导的过程。从细胞质输入到细胞核的蛋白质以及从细胞核输出到细胞质的大分子或核糖体亚基都带有分选信号，它们被核孔部位相应的受体识别，从而使核孔通道选择性地开放，介导了主动运输过程。应用各种金颗粒的示踪实验表明，在主动运输过程中，核孔通道可以膨大到26nm。（一） 核定位信号及其受体 1、核定位信号 大分子经核孔复合体的主动运输可以用实验观察，一个典型的实验是从蛙卵细胞核中提取出一

16、种蛋白质叫核质素（nucleoplasmin），它能通过蛋白水解分成头部和尾部两个片断，将头部和尾部用放射性同位素标记后再分别注射到蛙卵细胞质内，通过放射自显影方法可以看到核质素的尾部很快进入细胞核而头部则留在细胞质内。用20nm胶体金颗粒与核质素尾部结合后注射到细胞质内，尽管金颗粒大于核孔通道直径，还是能随着核质素尾部进入细胞核。这一实验表明，在核质素尾部必定存在着一种信号，它能使核孔通道暂时性扩大并引导蛋白质进入细胞核。类似的实验发现，把细胞核内的蛋白质抽提出来，用微注射方法注入细胞质，即使是很大的蛋白质分子也会有效地聚集到细胞核内。这种选择性的核输入过程主要决定于细胞核蛋白质中存在着分选

17、信号，称为核定位信号（nuclear localization signal），又称核输入信号（nuclear import signal）。核定位信号最初是在一种SV40病毒编码的蛋白质“T抗原”中发现的，T抗原是分子量为90KDa的一种蛋白质，是病毒在细胞内复制所必需的。在正常情况下，T抗原在细胞质中合成后很快进入细胞核。但有一种只有1个氨基酸不同的突变，所产生的T抗原就不能进入细胞核而留在细胞质中，因此认为这一突变位于核定位信号序列中。后来证明，T抗原的核定位信号是一段有8个氨基酸序列的短肽，富含带阳电荷的赖氨酸、精氨酸和脯氨酸，位于多肽链的内部区域。进一步研究表明，核定位信号可以是信号

18、肽，也可以是信号斑，许多细胞核蛋白质中可存在1个或2个信号序列，可位于多肽链的任何部位，都富含带阳电荷的赖氨酸、精氨酸和脯氨酸，具体的氨基酸序列可因不同蛋白质而异。将核定位信号接在其他蛋白质上，也可引导它们进入细胞核，信号序列在蛋白质中的位置并不重要。蛋白质输入细胞核后，其信号序列并不被切除。细胞核内的蛋白质在细胞分裂时与细胞质混合，分裂完成后再次输入细胞核，由于蛋白质的核定位信号没有被切除，因此很容易再次输入细胞核。2、核输入受体 核定位信号的受体称为核输入受体（nuclear import receptor），它是由相关的基因家族编码的一类受体蛋白，每一个家族人员编码一种核输入受体，可识别

19、一组具有相似核定位信号的细胞核蛋白质。核输入受体是可溶性的细胞质基质蛋白，它既能与输入蛋白的核定位信号结合，又可与核孔复合体的核孔蛋白（nucleoporin）结合，从而介导了蛋白质通过核孔通道的运输。核孔复合体由50多种核孔蛋白组成，有些核孔蛋白形成触须状纤维从核孔复合体的边缘伸向细胞质，还有些核孔蛋白排列在整个核孔通道上。核孔蛋白含有大量由苯丙氨酸和甘氨酸组成的短的氨基酸重复序列（Phe-X-Phe-Gly 和Gly-Leu-Phe-Gly），称FG重复序列，它们是核输入受体的结合位点。在细胞质基质中，核输入受体与蛋白质的核定位信号结合形成蛋白复合体，再结合到从核孔复合体伸向细胞质的核孔蛋

20、白纤维上，这些蛋白复合体通过与FG重复序列结合、解离、再结合、再解离的方式沿着核孔通道移动，一旦进入细胞核，核输入受体与结合的蛋白质解离，蛋白质留在细胞核内，受体本身则返回到细胞质。核输入受体并不总是直接与核定位信号结合，有时在核输入受体与核定位信号之间有一个接合蛋白（adaptor）作为连接桥梁。接合蛋白在结构上与核输入受体相似，它们在进化上可能是同源的。联合使用核输入受体和接合蛋白，可使细胞能识别各种核定位信号。（二） 核输出信号及其受体 大分子从细胞核输出到细胞质，如新装配的核糖体亚基和各种RNA分子的输出，同样要依靠选择性的运输系统来通过核孔通道。这种运输系统的核心是位于输出大分子上的

21、核输出信号（nuclear export signal）及其相应的核输出受体（nuclear export receptor）。不同大分子的核输出信号在结构上不相同，有些核输出信号的氨基酸序列中富含亮氨酸，有些则不同，目前还不清楚核输出信号是否有共同的特征。核输出受体能同时与核输出信号和核孔蛋白结合，介导大分子通过核孔通道进入细胞质。核输出受体在结构上与核输入受体相似，单从氨基酸序列看，两者很难区分，实际上两者由同样的核运输受体（nuclear transport receptor）基因家族编码。因此，核输出运输系统与核输入运输系统以同样的方式工作，仅仅是方向相反。核输入受体在细胞质与蛋白质结

22、合，到细胞核释放它们，其本身回到细胞质重新利用；核输出受体的作用过程正相反。将小分子RNA,如tRNA,与金颗粒结合后注射到培养细胞的细胞核中，它们会很快通过核孔通道进入细胞质；如果用两种不同大小的金颗粒，一种与RNA结合后注射到细胞核，另一种与带有核定位信号的蛋白质结合后注射到细胞质，就可以看到两种大分子的双向运输。二、 门控运输的能量来源 通过门控运输的主动运输过程，细胞核的蛋白质从细胞质运输到细胞核，并在细胞核内聚集，使细胞更加有序化，这就需要消耗能量。这种能量是由一种称为Ran的单体GTP酶水解来供应的。Ran GTP酶在细胞核和细胞质都存在，核输入和核输出系统都需要它。像其他GTP酶

23、一样，Ran是一种分子开关，以两种构型状态存在，一种状态与GDP结合，另一种状态与GTP结合。两种状态之间的转换由两种特异的调节蛋白启动，一种是位于细胞质的GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein,简称GAP），启动GTP水解，将Ran-GTP转换成Ran-GDP；另一种是鸟嘌呤交换因子（guanine exchange factor,简称GEF），促进GDP到GTP的变换，从而将Ran-GDP转换成Ran-GTP（图10-4）。因为GAP位于细胞质，GEF与染色质结合而位于细胞核，因此细胞质内主要含有Ran-GDP，而细胞核内主要含有Ran-GTP。图10-4 R

24、an GTP酶两种构型状态的转换参照前书图13-4细胞核和细胞质之间两种构型Ran的梯度，驱动大分子物质通过核孔通道向适当方向转运。在蛋白质从细胞质到细胞核的输入过程中，带有核定位信号的蛋白质与核输入受体结合并停靠到核孔通道胞质一侧的FG重复序列上，然后沿着排列有FG序列的核孔通道移动直至到达细胞核一侧，在那里与Ran-GTP结合，结果蛋白质与核输入受体解离并释放到细胞核内。Ran-GTP位于细胞核内决定了蛋白质从细胞质向细胞核运输的方向（图10-5）。在细胞核中释放蛋白质后，与Ran-GTP结合的核输入受体通过核孔通道被运回到细胞质，在Ran结合蛋白（Ran binding protein）

25、和GAP的协同作用下把Ran-GTP转换成Ran-GDP。Ran结合蛋白先取代与核输入受体结合的Ran-GTP，然后触发Ran水解与其结合的GTP，最后Ran-GDP与Ran结合蛋白解离，完成一个循环。图10-5 Ran GTP酶两种构型的梯度驱动蛋白质的门控运输参照前书图13-5大分子从细胞核输出到细胞质也以相似的机制进行，在细胞核内Ran-GTP、大分子以及核输出受体三者结合在一起形成复合体，停靠到核孔通道细胞核一侧，沿着排列有FG序列的核孔通道移动，一旦到达细胞质一侧，在Ran结合蛋白和GAP的作用下，Ran水解与其结合的GTP，核输出受体释放与其结合的大分子和Ran-GDP，游离的核输

26、出受体回到细胞核完成一个循环。三、 门控运输中大分子转运的调节蛋白质通过核孔复合体的运输是受各种因素调节的，不同大分子运输的调节因素也不相同。有些蛋白质，如细胞核中与新合成mRNA结合的蛋白质，既有核定位信号、又有核输出信号。这些蛋白质不断地在核质之间穿梭运输，它们在细胞中的定位取决于输入和输出的相对速率。如果输入速率超过输出速率，这种蛋白质就主要位于细胞核；相反，如果输出超过输入，蛋白质就主要位于细胞质。因此，改变输入或输出速率可以改变蛋白质的定位。另一些蛋白质不能在核质之间穿梭运输，它们的转运受到严格的控制。例如，有些基因调节蛋白，平时被控制定位于细胞质，只有在需要时才转运到细胞核内。在许

27、多情况下，这种控制是通过调节核定位信号和核输出信号来实现的，即通过使信号序列邻近氨基酸的磷酸化来开启或关闭信号。例如，T细胞激活核因子NF-AT（又称钙调磷酸酶激活转录因子）是一种基因调节蛋白，在T细胞质中无活性状态的NF-AT以磷酸化形式存在。当T细胞激活时，细胞质内钙浓度增加。在高钙条件下，钙调磷酸酶（calcineurin）与NF-AT结合，使NF-AT去磷酸化，从而开启核输入信号（同时关闭核输出信号），使NF-AT与钙调磷酸酶组成的复合体输入到细胞核内，在那里NF-AT激活许多与免疫反应有关的细胞因子和细胞表面蛋白的基因转录。在细胞核内的低钙条件下，钙调磷酸酶与NF-AT解离，NF-A

28、T再次磷酸化，从而关闭核输入信号、开启核输出信号，使NF-AT回到细胞质（图10-6）。还有些情况下，这种控制是通过基因调节蛋白与胞质抑制蛋白结合来实现的，使它们被锚定在细胞质的细胞骨架或细胞器上；或者把它们的核定位信号遮蔽住，使它们不能与核输入受体结合。当细胞接受适当的刺激时，这种锚定或遮蔽被解除，基因调节蛋白可运送到细胞核内。例如，有一种基因调节蛋白可控制与胆固醇代谢有关的基因转录，平时以没有活性的形式作为跨膜蛋白储存于内质网膜中，当细胞缺乏胆固醇时，细胞会激活一种水解酶，切割这种跨膜蛋白，将其胞质面结构域释放，这一结构域输入到细胞核内，激活与胆固醇代谢有关的基因转录。图10-6 T细胞激活过程中NF-AT核输入的控制参照前书图13-6细胞以相似的方式控制RNA从细胞核输出到细胞质。例如，mRNA分子在细胞核内转录和剪接过程中就与蛋白质结合，这些蛋白质含有核输出信号和核定位信号，可被核输出受体识别，从而介导与其结合的mRNA经核孔通道输出到细胞质。在细胞质内，这些蛋白质与mRNA解离，并很快借助于核定位信号回