62 线粒体靶向纳米材料与肿瘤治疗特点.docx

1、62 线粒体靶向纳米材料与肿瘤治疗特点线粒体靶向纳米材料与肿瘤治疗优势1 线粒体靶向纳米材料 线粒体靶向策略的最初应用是对生物活性分子修饰线粒体靶向基团，使这些活性分子能够直接靶向至线粒体，发挥更好的疗效。例如，将辅酶Q10或维生素E的衍生物与TPP结合，已被证明能够选择性的靶向至线粒体并提高抗氧化效率。当亲脂性的TPP与DOX共轭结合时，原本只能在耐药的人乳腺癌高转移细胞(MDA-MB-435/DOX)的胞浆中积累的DOX，优先选择在线粒体中积累；与DOX原药相比，TPP-DOX能够增加caspase-3和PARP的剪切，诱导更明显的细胞凋亡，具有逆转MDR的应用潜力。 在前文中已经提及，将

2、纳米材料与抗肿瘤药物结合形成纳米医药或用纳米载体负载药物，能够在保持药物原本完整的疗效的同时，改善多种药物的药代动力学和生物分布。但在十年之前，关于线粒体靶向的纳米载药体系的报道并不多见，大部分纳米靶向系统只靶向至细胞层面，纳米载体进入细胞后靠随机分布与包括线粒体在内的亚细胞器作用。后期研究发现，纳米递送载体通过修饰特定靶向到亚细胞器，可以增加药物与亚细胞器上特定位点作用的几率，从而提高治疗效率。因此，定点给药的药物递送系统为目前暂时失败的治疗方法提供了新的可能性。为了将药物运输到线粒体基质并有效的控制释放药物到不同的线粒体组分，对纳米递送系统的设计和制备有着精确的要求：精确的尺寸、亲脂性的表

3、面、合适的电性和表面特定的靶向基团。此外，为保证线粒体靶向的纳米递送系统在生物体内的安全性，对这些纳米材料的生物相容性与生物降解性也有一定的要求。我们对近年来报道的几类线粒体靶向的纳米平台做一个简单总结：1.1 脂质体基线粒体靶向纳米材料 靶向线粒体的脂质体基材料，可以通过膜融合将其所载的药物或活性分子带入线粒体内。DQAsome是一类研究要多的脂质体基线粒体靶向纳米材料，此外还发展了一系列利用亲脂性阳离子TPP实现靶向功能的脂质体基纳米材料。2008年，Weissig课题组在Nano Letter上发表了他们制备的以脂质体为核心TPP修饰的线粒体靶向载体：他们将TPP结合到十八烷醇上制备出S

4、TPP，再和罗丹明B标记的磷脂酰乙醇胺制备脂质体用于靶向线粒体增加神经酰胺的抗癌疗效。为了克服上述STPP基脂质体的非特异性细胞毒性，2012年，Torchilin等通过聚乙二醇-聚磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)和端基为TPP的PEG共轭得到TPP-PEG-PE，将此共轭结构混入脂质体的磷脂双分子层合成得到一种新型的线粒体靶向的脂质体基纳米材料，这种材料能够显著提高其运载的抗癌药物紫杉醇(PTX)的效率、细胞毒性和在小鼠体内的抗癌效率。线粒体穿膜肽DKLAKLAK2(KLA)修饰是另一种实现脂质体基材料线粒体靶向的方式。Gu课题组制各了一种KLA修饰、pH敏感的新型脂质体材料，能够提高负载的PT

5、X在线粒体中的积累量，可以用于逆转人肺腺癌细胞(A549)的MDR。1.2 树状大分子基线粒体靶向纳米材料 树状大分子是一种从核心分子向周围辐射，形成高度支化的重复分支的功能高分子材料，其表面具有数量可控的、能够用于实现多功能化的基团。树状大分子的中心内核和支化空间可以包覆生物分子，表面基团的不同功能化使其能够递送多种药剂或显影分了。移位蛋白(TSPO)的一种分子量为18kDa的多聚体，在肿瘤的固醇类细胞的线粒体外膜高表达。Bornhop课题组用树状大分子G(4)-PAMAM骨架、1-(2-氯苯基)异喹啉-3-羧酸(C1PhIQ Acid)和丽丝胺罗丹明(Lissamine)制备了靶向线粒体外

6、膜TSPO的CIPhIQ-PAMAM-Liss，在C6大鼠胶质瘤和人乳腺癌细胞中有良好的线粒体显影效果。2012年，Torchilinh课题组利用(3-羧丙基)三苯基溴化膦的羧基和乙酰化的树状大分子的伯胺发生酸胺缩合反应制备了PAMAM基的G(5)-D-Ac-TPP，用荧光染料标记该纳米载体，细胞实验结果显示这种材料和线粒体共定位的效果较好，并且毒性也较低。在此工作的基础上，Cheng等成功的用TPP修饰的PAMAM树状大分子实现了在人宫颈癌细胞和非洲绿猴肾纤维母细胞中的基因递送，转染效率可与商用的Lipofectamine 2000相比拟，比SuperFect更高。1.3 聚合物基线粒体靶向

7、纳米材料 由生物相容性和生物可降解的聚合物制备的聚合物纳米颗粒是另一种药物递送系统中最常用的材料。在2008年，Kopecek课题组构建利用TPP作为线粒体靶向剂、基于新型的羟丙甲丙烯酸甲酯(HPMA)共聚物的药物递送系统：他们设计了一种与赖氨酸共轭结合的HPMA共聚物，使赖氨酸一端的氨基连接TPP用于靶向至线粒体，另一端氨基连接药物；所连接的荧光团BODIPY和光敏药物Mce6都通过激光共聚焦显微镜(CLSM)证明该共聚物能够靶向至线粒体。美国乔治亚大学的Dhara教授课题组合成了一系列线粒体靶向的聚合物纳米颗粒。如图113所示，其中最典型的是用TPP修饰FDA批准的可生物降解聚乳酸-羟基乙

8、酸共聚物(PLGA)，制备得到靶向线粒体的聚合纳米粒子，用这种纳米粒子封装氯尼达明(LND，抑制线粒体的糖醇解)、-生育酚琥珀酸盐(-TOS，选择性肿瘤药物)、姜黄素(淀粉-p蛋白(A)的抑制剂，阿兹海默症药物)和2，4-二硝基苯酚(2，4-DNP,减肥药物)，测试药物纳米粒子对各类线粒体相关疾病的治疗效果。与LND原药对照组相比，线粒体靶向纳米粒子运载的LND对肿瘤细胞的半数致死率是原药的108倍。之后，他们利用这个载体负载TPP修饰的顺铂前药(Platin-M)，将其递送到神经母瘤细胞的线粒体中，用于针对性的耐药脑部肿瘤的治疗；并以狗为动物模型，建立了这种线粒体靶向的顺铂纳米递送系统的生物

9、分布评价模型。此外，TPP修饰其他聚合物，例如聚乙二醇-聚己内酯纳米颗粒和多聚赖氨酸纳米颗粒等，用于线粒体靶向、递送生物活性分子或抗癌药物至线粒体的研究也陆续见诸报道。图113 TPP修饰的载药聚合纳米颗粒靶向线粒体的示意图。1.4 无机纳米碳纳米金用于线粒体靶向的纳米药物载体的研究主要集中于以脂质体或高分子聚合物作为载体材料，这两种材料虽然具有许多优点，但是它们皆有稳定性差、药物容易泄露的缺点。当以上两种材料置于复杂的生物体内液态环境时，由于高分子链的溶胀效应及脂质体自身动态不断自组装的本质特征，它们的形状、大小和表面化学性质易变且很不确定。相对而言，无机纳米材料具有稳定的形态和结构，将其用

10、于构建线粒体靶向的纳米材料的报道也越来越多。 最早发现有线粒体靶向功能的无机纳米材料是金纳米棒。2011年，Chen课题组发现金纳米棒可以选择性的杀死肿瘤细胞，而对正常细胞和间充质干细胞没有影响，不同的细胞摄取方式、胞内逃逸和溶酶体敏感性导致了这样的差异性：金棒表面的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)可以破坏溶酶体造成溶酶体逃逸，逃逸后金棒表面残留的CTAB可以使其在多种肿瘤细胞模型中选择性的在线粒体积累，与线粒体的长期作用导致线粒体膜电位下降，产生大量ROS，从而杀死肿瘤细剧。与此同时，研究发现单壁碳纳米管(SWCNTs)利用其表面的正电性也可以穿过细胞膜，在肿瘤的细胞的线粒体中积累，并且结合

11、近红外光对SWNTs照射，可以实现针对肿瘤的线粒体靶向的光热治疗。 此后，通过对无机纳米材料修饰线粒体靶向基团实现靶向功能的研究才陆续报道出来。Prato等对多壁碳纳米管(MWCNTs)表面修饰线粒体靶向肽序列(KMSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKC)，实现了其在药物递送中的线粒体靶向，CLSM观察到靶向的MWCNTs在巨噬细胞和人宫颈癌细胞的线粒体中大量积累，细胞电镜进一步确认了这个结果。2014年，Ma等报道了另一种碳基材料的线粒体靶向，通过对CQDs修饰TPP实现了对活细胞线粒体的单光子和双光子显影。之后，Lin课题组在实现TPP修饰的CQDs用于线粒体显影的同时，还开发

12、了其检测亚硝酸离子的分析功能。 近年来的研究中人们也发现，某些无机纳米粒子也具有线粒体靶向的能力，比如Ti02纳米颗粒和金纳米颗粒。王等人研究了并报道了表面包覆牛血清蛋白的金纳米颗粒在癌细胞A549中的作用机制。他们指出当金纳米颗粒浓度在25-100M时能杀死A549细胞，同时对正常细胞的毒性较小。为了探寻这种毒性的差异产生的原因，他们对金纳米颗粒进入细胞的过程进行了分析并对其进入细胞后的定位进行了监测。结果表明，金纳米颗粒是通过内吞途径进入到细胞内，其大部分在溶酶体中，在正常细胞中，溶酶体中的纳米颗粒很容易会被清除掉。而在癌细胞同不同，包覆了CTAB的金纳米颗粒很容易从溶酶体中逃逸然后进入线

13、粒体，这使得它很难被癌细胞清除，从而造成癌细胞死亡 (Figure 1-18)。Figure. 1-18 Different fates and effects of AuNRs in cancer cell, normal cell, and stem cell due to distinct pathways for cellular trafficking.2 线粒体靶向肿瘤治疗优势2.1克服多药耐药肿瘤多药耐药是导致化疗失败的主要原因之一，外排蛋白P-糖蛋白(P-gP )的高表达，是肿瘤耐药细胞的重要特征，耐药细胞的P-gp可将化疗药物如阿霉素等外排，导致化疗失败。通过靶向肿瘤细胞线粒

14、体，将抗肿瘤药物直接递送至线粒体靶点，可躲避胞浆及核的耐药机制，如避免P-gp糖蛋白的外排，克服多药耐药，提高化疗效果。Zhang等通过构建线粒体靶向药物递释系统递送DOX至肿瘤细胞线粒体，加剧了肿瘤耐药细胞的死亡。如图4.1所示，以TPP修饰生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)与碳量子点(CQDs)自聚集形成胶束，包裹DOX，构建线粒体靶向药物递释系统CQDs-TPGS-TPP/DOX。该制剂一方面通过TPGS抑制P-gp糖蛋白的过表达，另一方面通过将DOX直接递送至线粒体靶点，避免P-gp糖蛋白的外排，大幅度杀伤肿瘤耐药细胞，克服了多药耐药。 图4.1线粒体靶句药物递释系统克服肿瘤多药耐药示

15、意图2.2抑制肿瘤转移 肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。手术及化疗等传统治疗方法，可消除患者大部分肿瘤组织，却无法抑制肿瘤的复发与转移。磷酸肌醇-3-激酶( Phosphoinositide-3 kinases, PI3K)是一种蛋白激酶，在很多癌症患者中均存在PI3K异常，以PI3K为治疗靶点开发的多种PI3K抑制剂，已处于不同的临床验证阶段，但其效果并不理想。近来，Caino等发现单独使用PI3K抑制剂进行癌症治疗，可能会促进肿瘤细胞的侵袭性而转移至其他器官，导致患者病情恶化，这一过程主要依赖于线粒体功能应答。如图4.2所示，未经抑制剂药物处理的细胞，其线粒体主要围绕细胞核分布，而用

16、PI3K抑制剂(GDC-0941)处理肿瘤细胞，会引起线粒体向细胞膜特定区域移动，线粒体占据细胞周围骨架这一重要位置能够为细胞迁移和侵袭提供大量能量，这表明细胞运动和侵袭能力增强。PI3K抑制剂药物，依赖于线粒体参与细胞膜骨架的重新分配，提供细胞运动性、迁移性所需的能量与动力，促进肿瘤转移和侵袭。因此，开发PI3K抑制剂药物时，可联合线粒体靶向药物递释系统干预肿瘤转移时的能量代谢过程，进而抑制肿瘤转移。图4.2 PI3K抑制剂促进肿瘤转移依赖线粒体参与细胞膜骨架重新分配示意图。(a)相差显微镜技术观察PI3K抑制剂( GDC-0941)孵育前列腺癌PC3细胞Sh内细胞形态和位置变化(b)共聚焦

17、显微镜观察线粒体向膜板状伪足分布的3D示意图，绿色荧光:纤维形肌动蛋白，红色荧光:线粒体。2.3提高光疗效果 由光敏剂接收特定波长激发光后，电子能级跃迁，产生单线态氧和自由基，诱导肿瘤细胞凋亡(光动力疗法，PDT)，或产生热能，导致肿瘤细胞坏死(光热疗法，PTT) 。线粒体是细胞内能量生成的关键细胞器，90%ROS产生于线粒体，且线粒体对热刺激高度敏感，通过促使ROS产生，诱导肿瘤细胞凋亡。将线粒体靶向与PDT或PTT联合，可提高光疗效果，降低激光照射功率及光敏剂剂量，同时也降低了光毒性。因此，线粒体靶向的PDT和PTT已经成为一种新的治疗策略。Jung等通过 TPP修饰香豆素氧化铁(CIO)

18、，获得线粒体靶向的光敏剂Mito-CIO。如图4.3所示，Mito-CIO可靶向Hela细胞线粒体，740nm激光照射刺激在线粒体内产生过高热，加剧肿瘤细胞死亡，获得更高效的PTTa。图4.3线粒体靶向的光敏剂用于肿瘤光热治疗示意图很多光敏剂由于其在近红外波段吸收强度有限，而需要使用较高的激光照射功率，超出了耐受限度，对周围正常组织有潜在的损伤。如二氧化铁(Ti02)由于优良的光催化特性、光稳定性，能够产生不同细胞毒性的ROS，引起肿瘤细胞严重死亡，被认为是用于PDT疗法良好的光敏剂。黑色Ti02纳米粒将其光吸收波段从紫外拓宽到近红外区域，可用于PDT/PTT联合治疗。但由于黑色Ti02在近红

19、外波段吸收较弱，使其PTT治疗的激光功率高达2 W/cm2，超出了常规使用限度( 980nm: 0.72W/cm2)，对周围正常组织有潜在伤害。 线粒体靶向的PDT/PTT有可能提供新的契机解决这个难题。Mou等设计线粒体靶向的PDT/PTT联合制剂G-Ti02-x-TPP，大幅度降低了激光照射频率及给药剂量，提高了体内安全性，为肿瘤治疗临床转化提供了很好的思路。如图4.4所示，通过超声破碎法将黑色Ti02( B-Ti02)改良为绿色Ti02 (G-Ti02)，可获得更稳定的增强型近红外吸收。经TPP修饰，得线粒体靶向的Ti02纳米粒G-Ti02-x-TPP。G-Ti02-x-TPP靶向至线粒

20、体，在功率为0.72W/cm2的980nm激光照射条件下，就能产生很好的光疗效果，体内外给药剂量大幅度降低，生物相容性较好。图4.4线粒体靶向的光动力和光热联合治疗肿瘤示意图2.4增强免疫治疗 免疫治疗引入功能性的抗原特异性免疫反应，实现对肿瘤细胞长期的免疫记忆、预防和杀伤。肿瘤免疫疗法包括肿瘤疫苗、人工抗原呈递细胞治疗、肿瘤免疫检查位点治疗及细胞疗法等。基于DC细胞的肿瘤免疫治疗临床应用的局限性之一，是产生肿瘤抗原特异性T细胞应答的效率较低。因此，提高细胞毒性T细胞介导的细胞免疫应答是解决这个问题的关键。 PDT可通过产生ROS，诱导肿瘤细胞凋亡，激活机体宿主免疫应答。将光敏剂靶向输送至线粒

21、体，可促进产生更多的ROS，加剧肿瘤细胞凋亡，释放大量的肿瘤抗原，进一步提高肿瘤免疫治疗的效果。Marrache等借助于线粒体靶向的光动力疗法，大幅度激活了T细胞免疫应答。如图4.5所示，以TPP修饰的生物可降解聚合物PLGA-b-PEG-TPP为载体，包封疏水性光敏剂ZnPc，构建线粒体靶向纳米粒T-ZnPc-NPs。该制剂将ZnPc有效递送至线粒体后，660 nm激光照射加剧ROS产生，诱导肿瘤细胞凋亡，释放的肿瘤抗原促使DC细胞成熟，激活T细胞，产生更多的IFN-细胞因子，杀伤肿瘤细胞。基于线粒体靶向的光疗引起的促免疫应答效应，联合现有的免疫检查点疗法，可能将起到协同增效的效果，为肿瘤治

22、疗提供较大的潜力价值。圈4.5线粒体靶向的光动力疗法提高肿瘤免疫治疗示意图。 (aa)激光触发线粒体靶向纳米粒在线粒体内产生ROS，诱导肿瘤细胞凋亡和坏死(b)通过纳米沉淀法合成T-ZnPc-NPs3 作用于肿瘤线粒体靶点的药物分子 线粒体功能障碍在肿瘤发生发展过程中扮演着重要的角色，包括细胞能量代谢紊乱、ROS干扰、细胞凋亡受损、线粒体DNA(mtDNA)突变等。深入了解调控这些关键环节中逆转线粒体功能障碍的药物分子及其作用机制，为后续实现肿瘤线粒体内药物递送精准治疗，降低脱靶效应，发挥药物最大抗肿瘤疗效有重要意义。近年来，作用于线粒体靶点的药物不断出现，临床批准应用的抗癌药如依托泊苷(VP

23、-16 )、长春瑞滨；临床前研究的新靶点候选药物，如神经酞胺MKT077、CD437、氯尼达明、桦木酸等，报道显示这些分子可直接作用于线粒体触发凋亡研究发现，这些线粒体靶点药物，受自身理化性质限制，体内分布到肿瘤细胞线粒体的数量有限，需要借助于药物递释系统，以期实现线粒体靶点药物的高效安全治疗。3.1参与细胞代谢转变的药物 线粒体是细胞内参与能量代谢的重要亚细胞器。线粒体是正常细胞的主要供能单位，而肿瘤细胞即使在有氧的条件下也以无氧糖酵解为主要的获能方式(即Warburg效应)。肿瘤细胞的线粒体数量并没有明显减少，提示肿瘤细胞的线粒体功能是异常的。通过建立不同背景的线粒体和细胞核融合模型，发现

24、功能异常的线粒体具有促进细胞生长和克隆形成的能力，而正常细胞的线粒体则不具备这一功能。 2-脱氧葡萄糖可抑制糖酵解。3-溴丙酮酸，乳酸类似物，显示较好的抑制肿瘤生长的特性氯尼达明，可抑制糖酵解，提高阿霉素和顺铂的细胞毒性。此外，根皮素，可使得癌细胞在低氧条件下对道诺霉素更敏感，具有抗肿瘤活性、促凋亡和克服耐药等功能。二氯乙酸盐，可抑制肿瘤细胞的丙酮酸脱氢酶激酶关键酶，应用于脑瘤和一些实体瘤，均有明显的抗肿瘤效果。3.2调控ROS诱导细胞损伤的药物细胞内90%以上的ROS主要来源于线粒体。一些药物可通过提高ROS水平治疗肿瘤。三氧化二砷可通过干预氧化磷酸化引起电子泄露增加，进而导致ROS水平提高

25、，诱导肿瘤细胞凋亡。维生素E类似物的II期临床研究，应用于黑色素瘤、前列腺癌、结直肠癌、间皮瘤、乳腺癌治疗。I/II期临床研究证明2-甲雌二醇可选择性杀死人白血病细胞，并且可使患有恶性肿瘤或多发骨髓瘤的病人病情稳定。此外，丁硫氨酸亚矾胺和伊美克也处于I期临床研究。3.3介导线粒体凋亡通路的药物 细胞凋亡主要有两种途径。一种是由死亡受体介导，另一种则是由线粒体介导。线粒体在调控细胞凋亡中占有很重要的地位。其中，Caspase-3 , Caspase-9表达增加或激活，是介导线粒体凋亡通路最主要的路径。细胞色素C释放可激活Caspases家族，诱导肿瘤细胞凋亡。细胞色素C释放或增加，最直接的方法是

26、线粒体膜通透性转换(Mitochondrial permeability transition, MPT )，通透性增加。传统的化疗成分主要通过生理凋亡控制的内在因素，引起线粒体膜通透性增加。然而，很多处于研究阶段的抗癌药物，包括氯尼达明、亚砷酸盐、桦木酸、CD437和一些两亲性阳离子-螺旋肽，直接作用在线粒体膜，或者线粒体渗透性转换孔(Mitochondrial permeablity transition pore, PTPC)。 抗凋亡蛋白Bcl-2家族蛋白可调控线粒体膜稳定性，抑制细胞凋亡。肿瘤细胞线粒体外膜高表达抗凋亡蛋白Bcl-2，减弱Bax蛋白促凋亡效应。靶向特定的PTPC复合物

27、，可克服Bcl-2介导的抗凋亡。一种方法包括交联PTPC的关键氧化还原敏感硫醇基；另一种方法包括应用线粒体苯二氮受体的配体。针对Bcl-2 RNA序列的特定反义寡核普酸(如G3139)，可显著抑制肿瘤细胞增殖或增加化疗药物敏感性。G3139和棉子酚，BH3类似物，与化疗药物联合治疗肿瘤，处于III期临床研究。外周苯二氮卓受体PBR的配体，如PK11195 , ROS-4864和安定，体内外均显示具有抗肿瘤活性，单独应用或与其他化疗药物联合治疗，已进入临床阶段。经安定与氯尼达明联合治疗的复发恶性胶质瘤患者，已获得显著疗效。3.4作用于突变mtDNA的药物一些靶向mtDNA或与复制相关酶的化合物，

28、显示具有潜在临床应用价值。其中，临床应用的典型抗癌药物顺铂，发现其与mtDNA结合比高于其与核DNA结合比，显示更高水平的顺铂-mtDNA加合物，导致NADH-泛醌还原酶抑制，以及ATP降低。地特氯铵，一个bis-嵌入剂聚集在线粒体，引起mtDNA特定消除，抑制其复制。体外研究表明，维生素对乳腺癌和胰腺癌细胞具有杭肿瘤活性，通过特定抑制DNA聚合酶( mtDNA复制所需的线粒体酶)的活性，但是其抗肿瘤活性仍有待评价。3.5 HSP90抑制剂HSP90存在于肿瘤细胞线粒体，但未见于正常细胞线粒体。尽管一些致癌基因如RAS和AKT，已显示协助HSP90进入线粒体，HSP90蛋白在恶性肿瘤细胞线粒体

29、中优先定位的分子基础仍比较复杂。在线粒体中，HSP90和肿瘤坏死因子受体相关蛋白1 (TRAP1)形成复合物HSP90-TRAP1，该复合物可通过蛋白折叠机制调控CYPD介导的MPT。因此，线粒体靶向的HSP90抑制剂，可干预肿瘤细胞特定亚细胞结构的信号网络。Shepherdin作为拟肽物，可抑制HSP90和伴侣蛋白生存素的相互作用。细胞渗透的Shepherdin，可聚集在线粒体并可快速触发CYPD介导的MPT和细胞死亡，不依赖p53和BCl-2表达水平。Shepherdin介导的细胞死亡，与其结合到线粒体中HSP90和TRAP1密切相关。在多种肿瘤模型预临床研究中，Shepherdin均抑制肿瘤生长。Gamitrinibs可抑制肿瘤细胞线粒体HSP90的ATP酶活性，其线粒体靶向性主要通过HSP90抑制剂17-AAG上耦合亲脂性阳离子三苯基磷实现。已证明Gamitrinibs可引起肿瘤细胞线粒体毒性反应，而对正常细胞无毒副作用。