Hedgehog信号转导通路下游转录因子Gli1在人神经胶质瘤中对水通道蛋白AQP1调控作用的研究大学毕业论文Word格式文档下载.docx

1、将过表达质粒瞬转细胞收获不同时间点及不同转入剂量的样品观察转录水平观察蛋白水平的表达变化设计合成基因特异的干扰片段构建干扰载体体外验证有效后研究干扰掉后对报告基因活性及胶质瘤细胞系中表达的影响建立分别稳定转染空载体过表达及稳定干扰的三种神经胶质瘤细胞系一 方法检测三种细胞系中表达水平的变化将报告质粒转入三种不同的稳定细胞系中检测转录活性的变化分析启动子区根据的核心结合序列设计引物运用染色质免疫共沉淀技术研究与启动子区的结合情况根据实验结果利用重叠延伸技术构建启动子区突变报告基因质粒转入相应的稳定细胞系中利用报告基因检测确定在对调控中起关键作用的启动子区段位置阐明调控作用的机带 利用和实验比较不

2、同细胞系侵袭能力的差异评价在胶质瘤细胞系中调控表达所引起的生物学功能变化实验结果神经胶质瘤组织标本中和的表达与对照正常组织相比都呈现出异常高表达的状态并且两者之间的高表达具有特异的相关性外源瞬时转入及稳定表达都可以在转录和翻译水平上调的表达并能显著增强含有启动子区全长的报告基因的活性特异性干扰的表达则可以降低的表达并抑制的报告基因活性可以和启动子区中的保守调节序列相结合其中启动子区位的保守结合序列对维持的调节作用至关重要表达水平不同的神经胶质瘤细胞系表现出不同的侵袭转移能力在侵袭能力较低的细胞系中外源性转入可以使其侵袭能力得到恢复提高提示神经胶质瘤中可能通过上调的表达来增强肿瘤细胞的恶性生物学

3、特性结论本研究首次发现了神经胶质瘤中通路异常活化与异常高表达两种现象之间的关系并且证实通路下游转录因子可以通过与启动子区的结合在转录和翻译水平对其表达进行调控其中启动子区一一一段的序列在这一调控作用中发挥重要作用在胶质瘤细胞中这一调控作用的生物学意义是可以通过上调来增强胶质瘤细胞的恶性侵袭能力关键词信号通路神经胶质瘤转录调节第二部分基于结构修饰的靶向通路小分子抑制剂的筛选研究信号转导通路通路是一条高度保守的在生物的胚胎发育及多种疾病的发生发展过程中起重要作用的信号通路近年来的研究表明在多种人类恶性肿瘤性疾病中如脑胶质细胞瘤基底细胞癌胰腺癌非小细胞肺癌前列腺癌等该通路都呈现出异常的活化状念并且对

4、肿瘤的发生及发生后肿瘤组织的生长和恶性生物学特性的维持起着重要作用人们在研究通路与肿瘤之间关系时发现特异性抑制通路可以抑制多种肿瘤细胞的增殖以及向其他器管侵袭转移的能力因此信号通路被认为是一条比较理想的可以作为肿瘤靶向治疗的信号途径针对通路的小分子抑制剂的开发及研究工作方兴未艾逐渐成为国际研究的热点介芬胺是从藜芦属植物中提取的一种小分子天然产物在化学结构上属于一种箔体类生物碱可以与通路上游激活因子特异性结合而抑制该通路信号的传递进而发挥抑制肿瘤细胞的增殖的效应是一种具有潜在临床应用价值的小分子抑制剂但是作为一种天然产物其抑制通路活性的作用并不是很强且具有较大的化学毒性这一缺陷限制和延缓了其作为

5、一种新型抗肿瘤药物的研发与应用本研究拟以为先导化合物通过结构修饰和改造的方法制备系列目标衍生物然后对制备的衍生物进行抑制通路的特异性筛选及抗肿瘤活性筛选并与已有的通路抑制剂的活性进行比较最终期望获得两个高效低毒高特异性的通路抑制剂并对结构修饰规律作出总结为新型抗肿瘤药物的研发提供基础第二军医大学博士学位论文结构修饰衍生物的获得以为底物分别经醚化烃化酰化甲基化氯代等特异性化学修饰得到一系列衍生化合物衍生物高通量筛选平台的构建在通路组成性激活的细胞系中稳定转染可以反应通路激活程度的报告基因将该细胞系命名为并对该细胞系反映通路激活程度的敏感性进行鉴定初次筛选以步骤中构建的稳定细胞系为筛选工具将步骤中

6、得到的衍生物以浓度作用于体外培养的后测定报告基因数值观察各化合物对通路的抑制效应得到可以相对特异性抑制通路活性的化合物二次筛选细胞活性检测再次筛选步骤中得到的化合物对体外培养的的细胞毒性排除初筛过程中报告基因数值的降低是由于化合物本身的毒性导致细胞死亡所致得到对细胞增殖抑制不明显但可以显著抑制报告基因活性的毒性低特异性好的衍生物及 检测步骤中得到的化合物对细胞中通路下游转录因子表达的抑制作用进一步验证化合物的特异性法检测经二次筛选得到的衍生物在体外对肿瘤细胞的增殖抑制作用裸鼠荷瘤实验将得到的化合物以不同剂量灌胃给药观察其对体内肿瘤的生长抑制作用最终得到具有较高的抗肿瘤活性低毒高效的通路抑制剂以

7、为先导化合物进行化学修饰和改造分离纯化后共得到个衍生物报告基因法初筛检测修饰后的化合物对通路的相对抑制作用与阳性对照药物环杷明相比较共有个化合物显示出与其类似或更佳的抑制作用用法再次检测初筛得到的化合物对体外培养细胞的增殖活性的影响剔除细胞毒性较大的衍生物再次筛选后得到个毒性较低特异性较好的化合物分别为号化合物号化合物 号化合物 号化合物及结果显示经两次筛选后得到的个化合物可以有效降低通路下游转录因子的及蛋白表达水平提示其具有良好的特异性抑制通路活性的作用在体外肿瘤细胞增殖抑制实验中筛选到的化合物显示出选择性抑制通路依赖的肿瘤细胞的特性裸鼠荷瘤实验中四种化合物均表现出较好的抑制肿瘤生长的作用其

8、对体内肿瘤生长的抑制效率如下号化合物为号化合物为号化合物为 号化合物为其中统计学分析结果表明号化合物对肿瘤生长的抑制作用要优于阳性对照化合物环杷明本研究以为先导化合物首先经特异性结构修饰改造得到一系列衍生物然后对衍生物在抑制通路的特异性体内外毒性抗肿瘤活性等方面的特性进行连续筛选最终得到四个特异性较好毒性较低抗肿瘤活性较强的阳性化合物其中有三个化合物在上述特性上与阳性对环杷明类似一个化合物要优于坏杷明对所得阳性化合物的结构改造位点与先导化合物的结构进行比较分析可以得出以下规律氧化能够增强化合物的特异性及抗肿瘤活性但不明显对化合物毒性影响亦不显著化合物的毒性针对通路的特异性以及抗肿瘤活性主要与与

9、结构中哌啶环的密切相关对哌啶环的进行结构修饰是发现高效低毒衍生物的重要方向结构修饰关键词介芬胺通路小分子抑制剂第二军医大学博士学位论文 第二军医大学博士学位论文 一英文缩略词表英文全称 中文全称缩写 牛血清白蛋白染色质免疫沉淀环杷明 焦碳酸二乙酯 改培养基二甲基亚砜 乙二胺四乙酸 胎牛血清多形性胶质母细胞瘤 绿色荧光蛋白免疫组化 聚合酶链反应 干扰 逆转录聚合酶链反应独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意本人承担

10、本声明的法律责任吼学位论文作者签名才询她钙月白学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留使用学位论文的规定第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅本人授权第二军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入中国学位论文全文数据库中国优秀博硕士学位论文全文数据库等数据库进行检索可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存汇编学位论文保密的学位论文在解密后适用本授权书导师签名学位论文作者虢锄拙一一喀碧日期 年 曩月 日魄叼年乡月日第一部分通路下游转录因子在人神经胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究引 言神经系统是人体最精细结构和功能最复杂的系统由数以亿万计

11、的高度相互联系的神经细胞组成由于神经系统发育不良及后天的病变导致的各种神经性疾病尤其是肿瘤性病变已经成为危害人类的主要疾病之一胶质细胞瘤也称神经胶质细胞瘤起源于神经外胚叶组织是中枢神经系统最为常见的原发性肿瘤在人类对抗和干预胶质细胞瘤的历史中虽然已形成了一整套以手术为中心辅以放疗和化疗等多种措施的综合治疗方案但是由于胶质细胞瘤生长迅速无边界浸润易于复发等特性其治疗预后仍不尽理想据统计胶质细胞瘤在神经上皮组织肿瘤中约占约占颅内肿瘤的而神经胶质细胞瘤患者的平均生存期仍少于年因此加强胶质细胞瘤致病机理及发生发展的基础科学研究为临床治疗提供新的思路和治疗途径对于从根本上提高本病的治疗效果有着重要意义信

12、号转导通路是在脊椎动物胚胎期神经发育和分化中起着至关重要的作用的一条信号通路参与脊椎动物神经发育中细胞命运和胚胎范型的决定在早期途径可以通过不同时空的特异表达决定神经管中来自腹部区域的细胞发育为运动神经元而来自背区的细胞则发育为感觉神经元在后期该通路可以通过与其他一些信号因子的协同作用如等对神经系统细胞的精细分化进行调节在与神经系统的疾病联系方面在未成熟的个体途径配体的突变将会导致一种叫做前脑无裂畸形的发育缺陷性疾病对面部和神经系统的中线产生影响在成熟的个体途径的过度激活是多种神经系统肿瘤发生及恶性生物学行为维持的重要原因其中包括神经胶质瘤蛋白家族是通路下游具有锌指结构域的转录因子也是途径在受

13、到外界信号刺激后做出对一系列靶基因进行调节这一反应功能的最终执行者该蛋白家族中既有激活因子也包括抑制因子而是通路下游末端重要的转录激活因子其表达水平的高低是通路激活程度的标志基因由在年发现由于其在脑胶第二军医大学博士学位论文质瘤中较正常对照组织扩增高出大约倍而得名通路在神经胶质瘤的发生发展中起重要作用参与调节胶质瘤细胞的生长胶质瘤肿瘤干细胞的自我更新的维持并与其成瘤能力关系密切水通道蛋白是分布在生物膜表面能够对水分子进行高效特异的跨膜转运的一类通道蛋白家族最初在年由等人对红细胞膜分离纯化多肽时发现随后的研究证明了其特异转运水分子的功能并将其命名为的发现更新了人们长期以来的水跨生物膜的移动仪靠单

14、纯扩散的观念使人们一些生理病理的过程及机制有了更加合理和深刻的认识迄今为止已经在哺乳动物体内发现了种水通道蛋白在中枢神经系统中主要分布的是在下常生理条件下在人主要表达于脑脉络膜上皮微绒毛的顶膜与酶共同定位于该组织在脑脊液产生过程中具有重要作用并参与调节水和离子平衡在发育过程中从妊娠个月胎儿的脑组织中丌始检测出随后其表达部位和量随月龄增大而相应变化可能与胎儿脑内水平衡的调节有关在脑的发育中起重要作用在正常脑组织中的表达水平很低在神经胶质瘤中主要表达于微血管内皮细胞和瘤性星形细胞在转移瘤的微血管内皮细胞和反应性星形细胞中表达主要在神经胶质瘤的进展过程中发挥作用由于胶质瘤细胞的生长环境是在结构致密空

15、问局限的中枢神经系统所以其向周围组织的浸润性生长主要依靠其通过变形运动插入到神经元周围的空隙中来实现引表达水平高的胶质瘤细胞在体内外实验中表现出更强的侵袭转移特性因为此类细胞具有更强的变形运动能力更有利于向周围组织扩散性增殖此外还与脑胶质瘤旁的肿瘤周围组织水肿的发生发展有着密切的关系尽管在脑脊液分泌大脑内水平衡的调节以及胶质瘤的发展中起着重要作用并且人们对于其自身的通道结构已经有了清楚的了解但是对于其表达的调节机制仍不清楚尤其是其与主要信号转导通路之间的关系目自订仍然研究的很少在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究信号通路与在中枢神经系统的发育及正常功能的维持中都起着重要的作用在中枢神经系统胶

16、质细胞瘤的发生发展中两者也都各自体现出重要的影响但是对两者之间关系的研究目前尚未见报道本课题从神经胶质瘤组织标本入手首先分析了两者之问的表达的相关性发现了与在胶质细胞瘤中伴随性高表达这一现象然后通过分子生物学实验对通路通过其下游转录因子对进行调控的可能性及机制进行研究最后对这种调控作用对胶质瘤细胞生物学功能的影响进行了初步探讨第二军医大学博士学位论文材料和方法一 材料主要化学和生物试剂普通试剂琼脂糖琼旨 公司十二烷基肌酸钠公司蛋白胨及酵母提取物公司冰乙酸上海试剂一厂甲醇上海试剂一厂无水乙醇上海试剂一厂碱公司各种限制性内切酶酶 连接酶公司公司滤纸公司公司硝酸纤维素膜膜公司等特殊试剂及试剂盒 公司

17、 检测系统公司产物纯化试剂盒胶回收试剂盒为上海赛百盛基因技术有限公司产品各种寡核苷酸链引物使用相关软件自行设计均由上海生工生物工程有限公司合成测序工作送交英骏生物技术有限公司完成荧光素酶定量检测试剂盒为公司产品细胞核染色试剂购自公司溴化乙锭为转染公司产品 质粒纯化试剂盒公司试剂公司蛋白定量试剂盒公司细胞活力分析试剂一购自日本同仁化学研究所细胞侵袭实验板购自公司细胞外基质试剂购自公司载体菌株和抗体购自载体真核表达载体质粒为本为公司产品实验室所有宿主菌和均由合作单位德国马普生化所提供公司单抗购自抗体抗抗体抗抗体购自康成生物有限公司羊抗兔及羊抗小鼠二抗购自华舜公司荧光二抗购自公司质粒真核表达质粒由谢

18、经武教授惠赠 一表达质粒干扰质粒报告基因质粒一一一一一质粒均由本室构建细胞及培养用主要试剂及制备方法人胚肾上皮细胞人神经胶质瘤细胞购自中科院细胞库液体培养基取培养基于粉 公司包加入碳酸氢钠完全培养基液体培养基添加胎牛血清三抗三抗青霉素链霉素庆大霉素配成后的除菌滤膜过滤保存备用胎牛血清购自 公司胰蛋白酶购自 公司细胞冻存液液体培养基二甲基亚砜主要缓冲液裂解液 临用前加入凝胶加样缓冲液溴酚蓝甘油嘶在去离子水中溶解碱和甘氨酸然后加入的电泳级储存液用离子水补至则成储存液室温密闭保存蛋白转移缓冲液甘氨酸碱甲醇丽春红三氯醋酸磺基水杨酸第二军医大学博士学位论文封闭液脱脂奶粉溶解缓冲液的配制称取碱加入去离子水

19、磁力搅拌下完全溶解用约浓盐酸调节值至去离子水定容至室温保存备用碱加入去离子水磁力搅拌下完全溶解称取用约 室温保存备用称取 加入去离子水磁力搅拌下完全溶解用约 加入去离子水磁力搅拌下完全溶解用约处 用理的去离子水充分溶解加数滴浓调节值至并将体积调节至保存在的条件下溶解于去离了十二烷基磺酸钠水中加数滴浓盐酸调节值至冷却后去离子水定容至室温二主要仪器和设备仪型紫外分光光度计型一超低温冰箱型机型各种离心机 型型转膜仪恒温水浴振荡器型哈尔滨东联电子技术开发有限公司恒温水浴箱一型上海天平仪器厂超净工作台苏州净化设备公司凝胶成像系统上海四星生物技术公司免疫组化石蜡包埋机公司免疫组化制片仪公司免疫组化冰冻切片

20、仪公司荧光实时定量仪公司荧光素酶检测仪器紫外透射反射分析仪型上海长明光学电子仪器厂显微镜荧光显微镜电泳仪 型型制冰机公司三 二研究方法 针咒万法标本来源及处理人神经胶质瘤石蜡包埋组织标本来例源于年月至年月在长海医院神经外科手术切除的患者经病理组织学检查确诊其中分级级例其余均为级下常对照两例于正常脑组织内减压术中获得冰冻组织标本例其中分级级例级例级例级例正常对照组织例免疫组织化学石蜡切片烤箱过夜切片脱腊至水二甲苯一二甲苯一二甲苯一乙醇第二军医大学博士学位论文乙醇一乙醇一乙醇一双蒸水甲醇液室温放置双蒸水洗抗原修复切片放入柠檬酸盐缓冲液中煮沸停火再煮沸自然冷却至室温双蒸水沈封闭 甩去封闭液不洗直接加

21、一抗置入湿盒中 然后冰箱过夜时取出室温复温 然后 洗滴抗 沈 显色 镜下观察双蒸水终止显色苏木素复染秒分化后自来水返蓝蒸馏水浸泡脱水透明盖玻片覆盖显微镜下观察阳性染色在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究免疫印记取等量神经胶质瘤组织液氮中磨碎加入裂解缓冲液冰浴超声破碎细胞置恒温离心机内离取上清蛋白定量试剂盒进行蛋白定量取出所需量蛋白加入加样缓冲液变性变性样品进行蛋白电泳通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜 公司脱脂奶粉封闭洗三次每次稀释一抗孵育洗三次每次脱脂奶粉稀释二抗孵育 洗三次每次 化学发光法显影细胞培养胚肾上皮细胞入神经胶质瘤细胞细胞用培养置孵箱中培养保持饱和湿度消化取待传代细胞培养瓶皿轻

22、弃培养基预温少许轻洗一遍弃去加少许胰酶室温放置数分钟至瓶壁出现针孔样弃去胰酶加少量新鲜培养基终止消化轻轻吹打待成单个细胞后传代冻存生长对数期细胞约胰酶消化数分钟用完全培养基中止吹打成单个细胞离心分钟将细胞沉淀悬浮于冻存液胎牛血清中转移到冻存管中小时一小时液氮管而后放进液氮中复苏准备 温水视复苏细胞管数多少将从液氮罐中取出的细胞迅速在水中融化不断搅动转移细胞于加有新鲜完全培养液的培养瓶中培养次日更换培养液质粒的构建启动子区报告基因质粒及突变体质粒的构建方法启动子区全长及各突变体质粒物见下表其中各突变体质粒采用第二军医大学博士学位论文重叠延伸法进行构建条件如下变性退火延伸个循环电泳鉴定构建方法上游

23、引物均引入 酶切位点下游引物均引入酶切位点得到的产物进行胶回收再用 酶切与用同样双酶切酶切回收后的质粒进行连接转化感受态菌氨苄抗生素筛选阳性克隆用酶切初步鉴定正确后再送测序鉴定确认突变位点正确后再用于后续实验质粒名称 引物一一 一干扰质粒质粒的构建人工合成针对人中部碱基处的反向互补序列端加端加入粘性木端序列如下合成后上下游寡入粘性术端核苷酸链在 溶液中于沸水浴中后自然冷却即得到双链的带粘性末端的有矛 片段质粒用酶切回收然后进行连接转化 感受态菌卡那抗生素筛选阳性克隆片段是否接入用测序鉴定鉴定正确后在体外验证其干扰效果门一一表达载体的构建在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究网站检索得到序列根据

24、丌放读码框设计引物序列如下上游引物引入 酶切位点下游引物引入酶切位点以抽提的大鼠肾脏组织为模板扩增胶回收后用酶切质粒同样进行双酶切后回收片段载体进行连接然后进行连接转化感受态菌氨苄抗生素筛选阳性克隆酶切鉴定细胞转染脂质体法公司在培养皿中接种适量细胞使之培养后汇合率达到在不同离心管中分别加入无血清分别加入肛质粒和脂质体分别混匀后室温放置将溶液和脂质体溶液混合轻柔混匀室温放置转染前细胞用预温的无血清洗涤一遍加入 无血清随后将质粒一脂质体复合物滴加至细胞表面置孵箱内培养 后吸去一脂质体复合物加入含的培养基继续培养 裂解细胞提取总蛋白法公司在孔培养皿中接种适量使之培养后汇合率达到在不同离心管中分别加入

25、生理盐水并混匀随即将溶液加入溶液振分别加入质粒和荡混匀室温放置将质粒脂质体复合物滴加至细胞表面置孵箱内培养裂解稳定转染细胞转染后胰酶消化按传代细胞贴壁后加入培养以维持其性状两周左右挑取单克隆细胞 抽提待六孔板中细胞生长至汇合度室温孵育加入 加入氯仿剧烈振荡室温孵育离心吸取上层含有的水相入新管加入异丙醇沉淀室温孵育 离心第二军医大学博士学位论文弃上清加入的乙醇洗涤矾沉淀离一水溶解干燥用 用紫外分光光度计测定的含量保存准备做四操作步骤合成第一链总 随机引物 立星丞鱼丛冰浴至少肛反应取上述合成的为模板按列反应体系进行扩增 槿拯 坠加水至总体积为轻轻混合预变性 变性退火延伸至个循环终木延伸产物用琼脂糖胶电泳分析荧光素酶报告