DNA的复制机制Word文档下载推荐.docx

1、如图所示，一个新来的三磷酸脱氧核糖核苷和一条存在的DNA链（模板链）进行碱基配对,引导新DNA链的形成，并且使之有一条互补核苷酸序列。Figure 5-4 由DNA聚合酶催化的DNA合成（A）如图所示，DNA聚合酶催化一个脱氧核糖核苷酸向一条多聚核苷酸链（引物链，已和另一模板链配对）的3OH端的逐步添加。新合成的DNA链因此是以53的方向聚合的，正如前一幅图所示。因为每个新来的三磷酸脱氧核糖核苷必须和模板链配对以被DNA聚合酶识别，模板链决定了哪种脱氧核糖核苷酸（A，T,C，或者G）将被添加。焦磷酸盐的释放及其后续水解为两个无机磷酸盐分子导致巨大的有利的自由能改变，驱动了脱氧核苷酸的添加反应.

2、（B）一个由X线晶体学确定的大肠杆菌DNA聚合酶分子结构。通俗的讲,它就像一只右手,手掌手指和大拇指握住DNA.该图示例的是一个在DNA修复时起作用的DNA聚合酶，但是复制DNA的酶有相似的特征。DNA复制叉非对称在细胞内DNA复制期间，每条旧DNA链都作为形成一条完整新链的模板.因为一个分裂细胞的两个子细胞都遗传了包含旧链和新链的新DNA双螺旋（Figure 55）,该DNA双螺旋据说是被DNA聚合酶半保留复制。这一任务是如何完成的呢?Figure 5-5 DNA复制的半保留性质在一轮复制中，DNA的每条链都用左形成互补链的模板.原始链因此经历很多代而完好无损。1960年代早期对完全复制的染

3、色体进行的分析发现，一个局部的复制区域沿母DNA双螺旋向前移动。因其Y形结构该活跃区域被称为复制叉（Figure56）在复制叉处,两条新的子链被一个包含DNA聚合酶在内的多酶复合物合成。Figure 56 在一个环形染色体上两个复制叉朝相反方向移动.一个活跃的DNA复制区域沿正在复制的DNA分子向前移动,形成一个Y形DNA结构即复制叉:Y的两条臂是两个子DNA分子，Y的茎是母DNA螺旋。图中，母链为橙色;新合成的链为红色。DNA合成中不存在35的DNA聚合，只有53。Figure57 一种不正确的DNA复制模型.虽然看起来像是最简单的DNA复制模型，这里所示例的机制并非细胞使用的。在这个方案中

4、，两条子DNA链都连续增长，利用两个末端磷酸（图中发红光黄圈所示）水解的能量在每条链上添加下一个核苷酸.这就要求链既以53方向增长也以3-5方向增长.催化3-5方向的核苷酸聚合的酶尚未发现。那么,3-5方向的总体链增长是如何实现的呢?答案是冈崎片段-复制叉处短暂存在的10002000个核苷酸长度的DNA碎片（真核生物中也有相似的复制中介，长度只有100200个核苷酸）。冈崎片段只以5-3链方向被聚合而成，合成以后被连接在一起形成连续的长DNA链。复制叉因此具有一个不对成的结构（Figure 58）. 被连续合成的子链叫前导链,其合成稍微领先于另一条非连续的合成子链，即后随链.后随链的核苷酸聚合

5、方向和DNA链的总体增长方向相反。后随链合成之所以要延迟，是因为必须等待前导链将合成冈崎片段的模板链暴露出来。后随链通过一种不连续的“后缝”机制合成意味着DNA复制只需要53类型的DNA聚合酶。Figure 58 DNA复制叉结构。 因为两条DNA子链都以53方向聚合，后随链上的DNA合成开始时必须被做成一系列短的DNA分子，称为冈崎片段。DNA复制的高保真要求几种校对机制正如本章开始所述，复制期间拷贝DNA的保真度为每109个拷贝的核苷酸中大约有1个错误.基于碱基互补配对的准确度，这一保真度比预期要高得多.标准的互补碱基配对对并非唯一的互补配对形式，比如，在螺旋几何中一些小的变化，DNA中G

6、和T之间即可形成两个氢键。另外,四种DNA碱基会短暂出现稀少的互变异构体形式，比例为1比104或105.这些互变异构形式不改变螺旋几何即可发生错配：例如，C稀少的互变异构形式与A相配，而不是和G。当新来的三磷酸脱氧核糖核苷和DNA模板发生错配时，如果DNA聚合酶不做什么特殊的事，这个错误的核苷酸就会被包含在新DNA链中，产生频繁的变异。DNA复制的高保真度不仅依靠互补配对，还依靠几种校对机制顺序执行以修正任何可能已经出现的初始错配。第一个校对步骤,由DNA聚合酶在新核苷酸被加在增长链上之前执行。首先正确的核苷酸比不正确的核苷酸对移动的聚合酶有更高的亲和力，因为只有正确的核苷酸睬可和模板正确配对

7、。此外，核苷酸键联之后,共价地添加到增长链上之前,DNA聚合酶必须进行一次构象改变。一个不正确的核苷酸比正确的核苷酸更有可能在这一步脱离.这一步因此让聚合酶在催化添加核苷酸之前两次检查准确的碱基配对几何。下一步错误修正反应，核酸外切校对. DNA聚合酶不能通过连接两个三磷酸脱氧核糖核苷来开始一条新多聚核苷酸链，而是绝对要求一条引物链已碱基配对的3-OH端来进一步添加核苷酸（见Figure 54）.所以如果引物链3OH端的核苷酸错配了，DNA聚合酶就不能延伸这样一条链。DNA聚合酶分子在一个分开的催化位点（根据具体的聚合酶，在该聚合酶分子的一个分开的子单元或者分开的域里面）处理错配的引物链。进行

8、校对的核酸外切酶沿3-5方向切除掉引物链3端任何未配对残基，直到足够的核苷酸被移除，重新生成了一个碱基配对的3OH端，可引导DNA合成。这样,DNA聚合酶又作为一个“自我修正”酶，沿DNA移动时移除掉自己的聚合错误（Figures 59 和5-10）Figure 5-9 DNA聚合酶在DNA复制期间的核酸外切校对。在本例中，错配是因为包含了一个稀有的短暂的C碱基互变异构体形式（星号所示）。同样的校对机制适用于在3-OH端的任何其他错误包含的核苷酸。Figure 5-10 DNA聚合酶和DNA模板络合物在聚合模式（A左和编辑模式（右）下的结构略图。E为核酸外切反应的催化位点,P为聚合反应的催化位

9、点。对完美配对的引物终端的要求对于DNA的自我修正性质是很重要的。DNA聚合酶在没有引物的情况下开始合成，要完全正确区分配对的和未配对的3-OH端,很明显不可能.相反，基因转录中的RNA聚合酶不需要有效的核酸外切校对：RNA中的错误把不会传给下一代，偶尔的缺陷RNA分子无长期影响。因此RNA聚合酶可以无需引物即开始合成.在RNA合成以及单独的mRNA翻译过程中，都发现了大约1/104的错误频率.这一水平比DNA复制的错误率高100，000倍.是一系列校对过程使得DNA复制过程相当的准确（table 5-1）。table 51 促进DNA高保真合成的三部曲。第三部，链指导错配修复，本章后续将介绍

10、.链指导错配修复系统移除复制错误移除从复制机器逃脱的错误正如前面所述,细菌如大肠杆菌能够每30分钟分裂一次，使得从大量菌株中筛选找出一个稀有的在某一特定过程中发生改变的变种细胞相对容易。一个有趣的变种类型,包含了所谓增变基因中的改变，增变基因大大增大了自发突变率，即使在它们未激活时。并不奇怪的是，一个这样的变种所产生的的35校对核酸外切酶（DNA聚合酶的一部分，见Figures 5-9和510）是有缺陷的形式.当3-5的核酸外切酶校对有缺陷时，DNA聚合酶不再有效率地校对，许多本来可以被移除的错误在DNA中累积起来。对其他非正常高变异率的大肠杆菌变种的研究发现了另一种校对系统，该校对系统移除由

11、DNA聚合酶产生而被校对核酸外切酶错过的错误。链指导错配修复系统，检测DNA螺旋中由于非互补碱基对不匹配而造成的潜在的扭曲。但是如果该校对系统仅仅识别新复制的DNA中的错配，随机修正两个错配核苷酸中的一个,就可能错误地修正原始模板链来匹配错误，因而不能降低总体错误率.为了有效,这样一个校对系统必须能够区分和移除新合成链上的错配核苷酸，新合成的链才是错误发生的地方。大肠杆菌中的错配校对系统所使用的链区分机制是依靠DNA中GATC序列中A残基的甲基化.唯一未被甲基化的GATC序列位于紧随复制叉后面的新链中.新链和旧链的识别就是通过未被甲基化的GATC的识别来实现的。链指导错配修复的三步过程包括：错

12、配的识别，从新链中切除包含错误的DNA片段，以旧链为模板重新合成被切除的片段从而移除了错配。链指导错配修复系统减少了DNA复制期间的错误数量，见table 5-1.真核生物中,在错配位点区分新链和模板母链的机制不是依靠DNA甲基化。事实上,有些真核生物包括酵母和果蝇不会甲基化其任何DNA。新合成的链具有刻痕，生化专家揭示了这些刻痕（也被称作单链裂口）在真核生物中为链指导错配修复系统提供了信号，指导其去修复合适的链（新链）.Figure 5-23 真核生物中的链指导错配修复模型（A）The two proteins shown are present in both bacteria and e

13、ucaryotic cells： MutS binds specifically to a mismatched base pair, while MutL scans the nearby DNA for a nick。 Once a nick is found, MutL triggers the degradation of the nicked strand all the way back through the mismatch。 Because nicks are largely confined to newly replicated strands in eucaryotes

14、, replication errors are selectively removed。 In bacteria， the mechanism is the same， except that an additional protein in the complex （MutH） nicks unmethylated （and therefore newly replicated） GATC sequences, thereby beginning the process illustrated here。 （B） The structure of the MutS protein boun

15、d to a DNA mismatch. This protein is a dimer， which grips the DNA double helix as shown， kinking the DNA at the mismatched base pair. It seems that the MutS protein scans the DNA for mismatches by testing for sites that can be readily kinked, which are those without a normal complementary base pair.

16、 （B， from G。 Obmolova et al。， Nature 407:703710， 2000。 Macmillan Magazines Ltd.）只有5-3方向的DNA复制允许有效的错误修正Figure 5-11An explanation for the 5-to3 direction of DNA chain growthGrowth in the 5-to-3 direction, shown on the right， allows the chain to continue to be elongated when a mistake in polymerization

17、 has been removed by exonucleolytic proofreading （see Figure 5-9）。 In contrast， exonucleolytic proofreading in the hypothetical 3-to5 polymerization scheme， shown on the left, would block further chain elongation. For convenience， only the primer strand of the DNA double helix is shown。一种特殊的聚合核苷酸的酶在

18、后随链上合成短RNA引物分子对于前导链，仅在复制开始时需要一个特殊的引物：一旦复制叉建立起了，DNA聚合酶就将持续地面对一个配好对的链端以添加新核苷酸.然而,在复制叉的后随链上，DNA聚合酶每次完成一条新的冈崎片段（几秒钟），必须在模板链更前方的位点开始合成一个全新的片段（见Figure58）.一个专门的机制产生DNA聚合酶所需的碱基配对的引物链.该机制包括一种叫DNA引物酶的酶，用三磷酸核糖核苷酸在后随链上合成短的RNA引物（Figure 512）.在真核生物中,这些引物大约为10个核苷酸长度,在后随链上间隔100200个核苷酸。Figure 5-12 RNA引物合成A schematic

19、view of the reaction catalyzed by DNA primase, the enzyme that synthesizes the short RNA primers made on the lagging strand using DNA as a template. Unlike DNA polymerase, this enzyme can start a new polynucleotide chain by joining two nucleoside triphosphates together。 The primase synthesizes a sho

20、rt polynucleotide in the 5-to3 direction and then stops， making the 3 end of this primer available for the DNA polymerase。因为DNA引物包含合适的碱基配对的具有3-OH端的核苷酸，所以可被DNA聚合酶在该端延长，以开始冈崎片段。当在DNA聚合酶遇到上一个冈崎片段的RNA引物时，冈崎片段的合成即终止。为了将这些DNA片段生成连续的DNA链，一个专门的DNA修复系统迅速行动，擦除旧的RNA引物，以DNA代替之。最后，一种叫DNA连接酶的酶，将新DNA片段的3端和上一个片段的5端

21、连接起来（Figures 5-13 和5-14）。 Figure 513The synthesis of one of the many DNA fragments on the lagging strandIn eucaryotes, RNA primers are made at intervals spaced by about 200 nucleotides on the lagging strand, and each RNA primer is approximately 10 nucleotides long。 This primer is erased by a special

22、 DNA repair enzyme （an RNAse H） that recognizes an RNA strand in an RNA/DNA helix and fragments it； this leaves gaps that are filled in by DNA polymerase and DNA ligase。Figure 5-14The reaction catalyzed by DNA ligaseThis enzyme seals a broken phosphodiester bond。 As shown， DNA ligase uses a molecule

23、 of ATP to activate the 5 end at the nick （step 1） before forming the new bond （step 2）. In this way, the energetically unfavorable nick-sealing reaction is driven by being coupled to the energetically favorable process of ATP hydrolysis.专门的蛋白质在复制叉前面打开DNA双螺旋为了DNA合成的推进，DNA双螺旋必须在复制叉前面被打开，这样新来的核苷酸才能和模板

24、链形成碱基对.DNA双螺旋在正常条件下非常稳定，试管中必须要接近沸水的温度才能将两条链分开。只有当模板链已经从其互补链分离开来而暴露出来时， DNA聚合酶和DNA引物酶才能拷贝DNA.两种蛋白质-DNA解旋酶和单链DNA结合蛋白,帮助打开双螺旋从而为DNA聚合酶提供合适的单链DNA模板来进行拷贝.DNA解旋酶首先和DNA单链结合，通过水解ATP周期性地改变其自身形状，从而进行机械运动，即推动自己沿DNA单链快速前移，当碰到双螺旋区时，继续前进，以1000个核苷酸对每秒的速度将双螺旋撬开（Figures 515 和516）.Figure 515 An assay used to test for

25、 DNA helicase enzymesA short DNA fragment is annealed to a long DNA single strand to form a region of DNA double helix. The double helix is melted as the helicase runs along the DNA single strand， releasing the short DNA fragment in a reaction that requires the presence of both the helicase protein

26、and ATP. The rapid stepwise movement of the helicase is powered by its ATP hydrolysisFigure 516The structure of a DNA helicase（A） A schematic diagram of the protein as a hexameric ring。 （B） Schematic diagram showing a DNA replication fork and helicase to scale。 （C） Detailed structure of the bacterio

27、phage T7 replicative helicase， as determined by x-ray diffraction。 Six identical subunits bind and hydrolyze ATP in an ordered fashion to propel this molecule along a DNA single strand that passes through the central hole. Red indicates bound ATP molecules in the structure.单链DNA结合（SSB）蛋白，非常合作地紧紧结合在暴

28、露出来的DNA单链上,而不覆盖其要做模板的碱基.这些SSB蛋白不能直接打开一个长DNA螺旋，但是它们通过稳定被解开的单链构象来辅助解旋酶。另外，它们合作性的结合,使模板上的单链DNA区段“穿上外套“并伸直，从而阻止在单链DNA中极容易形成的短的发夹螺旋的形成（Figures 5-17 和518）.发夹螺旋阻碍DNA聚合酶催化的DNA合成。Figure 5-17The effect of single-strand DNAbinding proteins （SSB proteins） on the structure of singlestranded DNABecause each prote

29、in molecule prefers to bind next to a previously bound molecule， long rows of this protein form on a DNA single strand。 This cooperative binding straightens out the DNA template and facilitates the DNA polymerization process. The “hairpin helices” shown in the bare, singlestranded DNA result from a

30、chance matching of short regions of complementary nucleotide sequence; they are similar to the short helices that typically form in RNA molecules （see Figure 16）.Figure 518The structure of the singlestrand binding protein from humans bound to DNA（A） A front view of the two DNA binding domains of RPA protein, which cover a total of eight nucleotides。 Note that the DNA bases remain exposed in this proteinDNA complex。 （B） A diagram showing the th